專利名稱：脂肪油中有效成分的一種測定方法
技術領域：
本發明涉及脂肪油中有效成分的一種測定方法。
背景技術：
海狗系深海哺乳動物，生活在北極圈以內-50℃的高寒水域中，以名貴的鱈魚為食，皮下有厚厚的脂肪層，體內富含ω-3多烯脂肪酸。以加拿大北部無污染海域海狗脂肪為原料提煉出的海狗脂肪油，其中含有三種重要的ω-3多烯脂肪酸-EPA(Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸)、DPA(Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸)和DHA(Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸)，且總含量在20％以上。醫學界經過多年的研究已經證實，這三種脂肪酸對人體有多種獨特的生物學活性EPA具有改善血液循環、軟化血管、調整血脂、降低血壓和血糖以及抗炎作用；DHA和DPA具有營養大腦、促進胎兒和兒童大腦發育、保護視力、調節免疫和抗癌作用，其中DHA又被稱作“腦黃金”。近期人們又發現它們對一些疾病具有治療作用EPA已被開發作為治療動脈硬化和高血脂的藥物；還發現海狗油對II型糖尿病、脂肪肝和前列腺炎具有治療和預防作用。
人體自身不能合成ω-3多烯脂肪酸，只能從外界攝取，深海冷水魚油中雖然也還有ω-3多烯脂肪酸，但其與海狗油相比除含量一般較低外，還有以下重大區別1.海狗與人類同為哺乳類動物，其體內甘油脂的化學結構與人類相似，ω-3多烯脂肪酸一般位于甘油三脂的1、3位，而魚是低級冷血動物，ω-3多烯脂肪酸位于甘油三脂的2位，要經過人體肝臟代謝后才能利用。因此海狗油的ω-3多烯脂肪酸相比之下有更好的生物利用度，且不會增加肝臟負擔。
2.海狗油中還含有2-3％的角鯊烯，這也是魚油中沒有的，這種物質有效抑制生物中不良膽固醇的吸收并加速其代謝，還具有防癌作用，另外對皮膚也有滋潤作用。
3.海狗油中不僅富含EPA和DHA，并且富含DPA，而大多數魚油中DPA含量很低。
4.海狗油中幾乎不含膽固醇，而大多數魚油卻含有較多膽固醇。
因此，海狗油相對于魚油具有更高的應用價值，可幫助人們戰勝糖尿病、脂肪肝、冠心病等長期困擾人類的“現代文明病”。
海狗油等脂肪油中脂肪酸的含量測定多采用柱前衍生毛細管氣相色譜法，近年來HPLC測定法由于其外標定量準確、方法重現性良好、有足夠的分離度、儀器相對比較普及，并可以為中低壓液相制備提供依據等獨特的優點而越來越受到重視。
脂肪油的堿催化轉酯化方法國內外均有文獻報道，但現有的操作步驟均較繁瑣，衍生后需進行多次萃取，處理時間長，且耗費大量有機溶劑，所以此方法還需進一步改進。對于海狗油來說，采用衍生方法中脂肪油的堿催化轉酯化方法，操作步驟繁瑣，要求衍生后進行多次萃取，再合并萃取液用無水硫酸鈉干燥，最后減壓吹干萃取劑再定容。按此步驟操作，每處理一個樣品約需4-6小時，費時費力，且浪費大量有機溶劑，不利人體健康，也破壞了環境。而且采用傳統樣品衍生方法，回收率低，僅83.6％左右，衍生化試劑也需現用現配，給操作帶來不便。因此目前海狗油等脂肪油中有效成分的測定方法還需進一步改進，才能更為準確地測定脂肪油中的有效成分EPA、DHA和DPA的含量。

發明內容
本發明的目的在于提供脂肪油中有效成分的一種測定方法，該方法采用柱前衍生反相HPLC法，簡化了樣品衍生化操作步驟，無需萃取，節省了時間和試劑，能保證完全酯化的衍生條件，采用適當的色譜分離條件，將目的組分與雜質完全基線分離。
本發明的另一目的在于提供海狗油中有效成分的一種測定方法。
為了實現本發明的目的，本發明提供脂肪油中有效成分的一種測定方法，包括以下步驟1)脂肪油的衍生化處理取脂肪油與含0.2-1.0mol/L醇的堿金屬鹽以1∶30-100體積比混合搖勻，在0-60℃下反應至小油滴完全消失，再加入酸終止反應，用醇定容，過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液；2)色譜進樣分析取衍生處理后的脂肪油，進入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為流動相甲醇水系統、乙腈四氫呋喃水系統或乙腈甲醇水系統，等梯度洗脫，
流速1.1-1.5ml/min，柱溫15-45℃，檢測波長202～230nm，進樣量5～50μl；3)記錄色譜圖，用外標法測定脂肪酸的含量。
其中，所述的脂肪油為魚油、植物油或海狗油等含有三種多烯脂肪酸EPA、DPA和DHA的脂肪油，所測定脂肪油中的有效成分是指三種ω-3多烯脂肪酸EPA-Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸；DPA-Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸和DHA-Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸，本方法可測定這三種脂肪酸中的一種或多種。本方法尤其適合海狗油中這三種ω-3多烯脂肪酸的測定。
其中，步驟1)脂肪油的衍生化處理取脂肪油80-120μl，加入0.2-1.0mol/L醇的堿金屬鹽4-8ml，搖勻，在0-60℃下反應至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml酸終止反應，用醇定容，0.2μm-0.3μm濾膜過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液。
進一步地說，所述的衍生化處理方法為取脂肪油100-120μl，加入0.5-0.8mol/L的甲醇鈉4-6ml，搖勻，室溫反應15-30分鐘，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸終止反應，用甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液。
衍生化反應中所述的醇的堿金屬鹽可為甲醇鈉、乙醇鈉或甲醇鉀等，優選為甲醇鈉，甲醇鈉在15天以內催化衍生化能力基本無變化。其濃度為0.2-1.0mol/L，優選為0.5-0.8mol/L。
終止反應所用的酸為冰醋酸、甲酸、三氟乙酸或硫酸等中的任意一種，定容所用的醇為甲醇、乙醇等。
為了使產品具有更好的穩定性，定容時可加0.001％-0.005％的抗氧化劑，所述的抗氧化劑為2，6-二叔丁基對甲酚或對羥基叔丁基茴香醚。
優選的，本發明所述的衍生化處理在0-60℃下反應5-30分鐘，為了便于操作，衍生化反應更優選在室溫下進行，反應15分鐘。
本發明色譜儀所用的色譜柱可為Allsphere Octyl(C8)，3μm，100，4.6mm×150mm；Waters SymmetryShield RP-18，5μm，100，3.9mm×150mm和LichrospherRP-18，5μm，100，4.6mm×250mm。以RP-18型，5μm，100，4.6mm×250mm型號為好。如Waters高效液相色譜儀，Lichrospher高效液相色譜儀，Mightsil高效液相色譜儀。優選的，液相色譜儀為RP-18型，5μm，100，4.6mm×250mm型號。
在選擇色譜儀的色譜條件時，發現檢測波長在202～230nm之間均可，其中210nm處三種脂肪酸吸收較強且穩定，精密度也符合藥典要求，故檢測波長選用210nm為佳。
本發明選擇甲醇水系統、乙腈四氫呋喃水系統或乙腈甲醇水系統三種系統中的任意一種作為流動相進行等梯度洗脫。經反復調試，改變比例，最終發現乙腈甲醇水系統最好，在其比例為7∶1∶2流速逐漸提高至1.1-1.5ml/min，最后發現在流速為1.2ml/min時各項指標達到最佳。所以流動相優選為乙腈甲醇水系統，三者比例為7∶1∶2，流速為1.2ml/min，同時柱溫選擇在15-45℃。
為實現本發明的另一目的提供海狗油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，包括以下步驟1)海狗油的衍生化處理取海狗油80-120μl，加入0.2-1.0mol/L甲醇鈉4-8ml，搖勻，在0-60℃下反應至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml冰醋酸終止反應，用含0.001％-0.005％2，6-二叔丁基對甲酚的醇定容，0.2μm-0.3μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液；2)色譜進樣分析取衍生處理后的海狗油供試品溶液，進入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為流動相甲醇水系統、乙腈四氫呋喃水系統或乙腈甲醇水系統，等梯度洗脫，流速1.1-1.5ml/min，柱溫15-45℃，檢測波長202-230nm，進樣量5～50μl；3)記錄色譜圖，用外標法測定脂肪酸的含量。
所述的衍生化處理方法優選為取脂肪油100-120μl，置于10-200量瓶中，加入0.5-0.8mol/L的甲醇鈉4-6ml，搖勻，室溫反應15-30分鐘，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸終止反應，用含0.003％-0.005％2，6-二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液。
更優選的衍生化處理方法為取海狗油120μl，加入0.5mol/L甲醇鈉4ml，搖勻，室溫反應至小油滴完全消失，再加入0.2ml冰醋酸終止反應，用含0.005％2，6-二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液。
其中，所測定海狗油中的有效成分是指三種ω-3多烯脂肪酸EPA-Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸；DPA-Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸和DHA-Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸，本方法可測定這三種脂肪酸中的一種或多種。
本發明的脂肪油中有效成份的一種測定方法是本發明技術人員多年對測定方法摸索的結果，具有以下優點1.脂肪油的堿催化轉酯化方法國內外均有文獻報道，但操作步驟均較繁瑣，都要求衍生后進行多次萃取，再合并萃取液用無水硫酸鈉干燥，最后減壓吹干萃取劑再定容。按此步驟操作，每處理一個樣品約需4-6小時，費時費力，且浪費大量有機溶劑，不利人體健康，也破壞了環境。本發明經步驟優化后，每處理一個樣品僅需0.5小時左右，且無需萃取，節省了大量時間和有機溶劑。
2.采用傳統樣品衍生方法，結果回收率僅83.6％左右，這與其操作步驟較多，樣品有損失有關，本發明簡化了操作步驟，提高了回收率，回收率接近100％。
3.現有的衍生化試劑需現用現配，給操作帶來不便。本發明對衍生化試劑的穩定性進行了考察，證明其15天內穩定，節省了操作時間和試劑。
4.傳統樣品衍生方法要求10℃反應10分鐘，操作不便。本發明對衍生時間和溫度進行了考察，在室溫下即可進行衍生化操作，找到了方便操作又能保證完全酯化的衍生條件。
5.本發明在對色譜條件進行研究的過程中，對不同色譜柱進行篩選，篩選出Lichrospher RP-18色譜柱，尋到了理想的色譜條件，最終將目的組分與雜質完全基線分離。
6.本發明所述的測定方法為進一步對海狗油純化打下了基礎。


圖1為海狗油衍生化程度考察，其中3為未衍生樣品，4為衍生樣品，5為未完全衍生樣品；圖2為樣品與樣品中加入對照品的光譜圖；圖3為Allsphere Octyl柱最佳分離色譜圖；圖4為Waters-C18柱最佳分離色譜圖；圖5為Lichrospher RP-18柱最佳分離色譜圖；圖6為甲醇水系統最佳分離色譜圖；圖7為乙腈四氫呋喃水系統最佳分離色譜圖；圖8為乙腈甲醇水系統最佳分離色譜圖；圖9為1.0ml/min流速下的色譜圖；圖10為室溫分離色譜圖；圖11為30℃分離色譜圖；圖12為空白試驗與樣品對照色譜圖；圖13為Mightsil RP-18柱色譜圖。
具體實施例方式
下面實施例為進一步描述本發明，但所述實施例僅用于說明本發明而不是限制本發明。
實施例1本實施例所述的海狗油有效成分的測定方法，包括以下步驟1)海狗油的衍生化處理取海狗油120μl，置于10ml量瓶中，加入0.5mol/L甲醇鈉4ml，搖勻，室溫反應15分鐘，至小油滴完全消失，再加入0.2ml冰醋酸終止反應，用含0.005％BHT的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液；2)取20μl衍生處理后的海狗油供試品溶液，進入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為色譜柱Lichrospher RP-18，5μm，100A，4.6mm×250mm；流動相乙腈∶甲醇∶水＝7∶1∶2，等梯度洗脫；流速1.2ml/min；柱溫45℃；檢測波長210nm；
進樣量20μl；3)記錄色譜圖，測定EPA、DHA和DPA三種脂肪酸的含量。
采用本發明所述的測定方法測得樣品海狗油中三種多烯脂肪酸的百分含量(W/W)為EPA6.92％，回收率99.10％；DHA9.76％，回收率98.90％；DPA4.18％，回收率99.60％。
實施例2本實施例所述的海狗油有效成分的測定方法，包括以下步驟1)海狗油的衍生化處理取海狗油80μl，置于50ml量瓶中，加入0.8mol/L甲醇鈉6ml，搖勻，40℃下反應至小油滴完全消失，再加入0.3ml冰醋酸終止反應，用含0.003％BHT的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液；2)取30μl衍生處理后的海狗油供試品溶液，進入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為色譜柱LichrospherRP-18，5μm，100A，4.6mm×250mm；流動相甲醇∶水＝3∶2，等梯度洗脫；流速1.3ml/min；柱溫30℃；檢測波長202nm；進樣量30μl；3)記錄色譜圖，測定EPA、DHA和DPA三種脂肪酸的含量采用本實施例所述的測定方法測得樣品海狗油中三種多烯脂肪酸的百分含量(W/W)為EPA7.06％，回收率99.70％；DHA9.829％，回收率98.70％；DPA 4.29％，回收率99.50％。
實施例3本實施例所述的海狗油有效成分的測定方法，包括以下步驟1)海狗油的衍生化處理取海狗油100μl，置于100ml量瓶中，加入1.0mol/L甲醇鈉8ml，搖勻，50℃下反應至小油滴完全消失，再加入0.5ml冰醋酸終止反應，用含0.001％BHT的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液；2)取50μl衍生處理后的海狗油供試品溶液，進入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為色譜柱Waters SymmetryShield RP-18，5μm，100，3.9mm×150mm；流動相乙腈∶甲醇∶水＝7∶1∶2，等梯度洗脫；流速1.3ml/min；柱溫15℃；檢測波長220nm；進樣量50μl；3)記錄色譜圖，測定EPA、DHA和DPA三種脂肪酸的含量。
采用本實施例所述的測定方法測得樣品海狗油中三種多烯脂肪酸的百分含量(W/W)為EPA7.15％，回收率97.90％；DHA9.75％，回收率99.60％；DPA4.21％，回收率99.30％。
實施例4本實施例所述的鯡魚油有效成分的測定方法，包括以下步驟1)鯡魚油的衍生化處理取鯡魚油90μl，置于200ml量瓶中，加入0.6mol/L乙醇鈉5ml，搖勻，10℃下反應至小油滴完全消失，再加入0.35ml鹽酸終止反應，用含0.002％2，6一二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的鯡魚油供試品溶液；2)取40μl衍生處理后的鯡魚油供試品溶液，注入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為色譜柱Waters SymmetryShield RP-18，5μm，100，3.9mm×150mm；流動相乙腈四氫呋喃水系統＝7∶1∶2，等梯度洗脫；流速1.4ml/min；柱溫40℃；檢測波長230nm；進樣量40μl；3)記錄色譜圖，測定EPA和DHA兩種脂肪酸的含量。
采用本實施例所述的測定方法測得樣品鯡魚油中三種多烯脂肪酸的百分含量(W/W)為EPA 6.828％，回收率99.80％；DHA 6.35％，回收率98.50％。
實驗例1本實驗例在于研究脂肪油—海狗油的衍生化處理方法。
1.試劑及樣品樣品海狗油，產自加拿大TerraNova漁業有限公司。
試劑2，6-二叔丁基對甲酚(BHT)、金屬鈉、金屬鉀、冰醋酸、無水乙醚、正己烷、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、乙醇、酚酞、鹽酸、丙酮、三乙胺均為國產分析純；高純氮氣，Fisher公司產品；α-溴代苯乙酮，色譜純，Wako公司產品。
2.衍生化方法的選擇2.1α-溴代苯乙酮衍生法取海狗油20μl，精確稱定，加入2ml2.0％氫氧化鉀-乙醇置5ml離心管中，氮氣密封100℃皂化30分鐘。冷卻至室溫后以酚酞為指示劑、鹽酸乙醇(4∶1)中和，離心取上清液，氮氣吹干，再加入100μlα-溴代苯乙酮的丙酮溶液(10mg/ml)及100μl三乙胺的丙酮溶液(10mg/ml)，充氮密封后沸水浴5分鐘。冷卻后加入160μl冰醋酸的丙酮溶液(2mg/ml)，再次沸水浴5分鐘。所得反應液0.45μm濾膜過濾，氮氣吹干，準確加入0.15ml甲醇溶液，取5μl進樣。
本衍生法由于在脂肪酸鏈羧基端引入了苯環結構，使得被測物在254nm處有很強的吸收，故幾種目的組分HPLC的檢測限可達0.25ng，此方法衍生步驟繁瑣，操作費時，且回收率難以保證。
2.2堿催化一步轉酯化法取海狗油約0.2g，精密稱定，溶于4ml四氫呋喃，與新制0.5mol/L甲醇鈉溶液8ml混合，10℃反應約10分鐘，加入0.4ml冰醋酸終止反應，反應液用20ml蒸餾水稀釋后，以50ml乙醚分三次萃取；合并萃取液，用無水Na2SO4及KHCO3干燥后，減壓抽干，甲醇定容至100ml，0.2μm濾膜過濾，進樣20μl。
該方法操作相對簡便，且利用脂肪酸中多個雙鍵較強的遠紫外端(210nm)吸收，幾種目的組分HPLC的檢測限約7-8ng，可很好的滿足定量要求，故采用此方法作進一步的研究。
3.衍生化步驟的研究原方法操作步驟較多，回收率較低，僅83％左右。分析衍生反應機理及各反應物和產物性質并結合反相分離的特點，認為反應產生的少量鹽在反相柱上基本不保留，對分離無影響，而水在流動相中本來就有，也不必除去；另外試驗發現海狗油酯化后可溶于甲醇，衍生前加入四氫呋喃也沒必要。故將方法改為衍生完后直接定容進樣，步驟如下取海狗油80-120μl，置于瓶中，加入0.5-1.0mol/L甲醇鈉4-8ml，搖勻，在0-60℃下反應5-30分鐘，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml冰醋酸終止反應，用含0.001％-0.005％2，6-二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm-0.3μm膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液。
經多次重復，并和原方法對比，結果證明本發明方法完全可行，對目的組分的分離無任何影響，且大大簡化了操作步驟，省去了四氫呋喃溶劑的添加，及萃取步驟，同時卻能保證較高的樣品回收率，并節省了大量有機溶劑。
4.溫度對衍生化反應的影晌由于各文獻報道的衍生反應溫度各不相同，故對樣品衍生溫度進行考察取海狗油6份各120μl分別置10ml棕色容量瓶中，精密稱定，均分三組，平行操作，按優化好步驟衍生，反應溫度分別為第一組冰浴(0℃)，第二組室溫(15℃)，三組60℃水浴。衍生10分鐘后終止反應，各進樣兩次，考察溫度對衍生化反應的影響。
試驗中發現，溫度對反應速率有一定影響冰浴組樣品油滴最早消失，室溫組其次，60℃水浴組最饅，說明低溫可加速該衍生反應，但10分鐘后油滴都消失。另外不斷振搖可明顯加速衍生反應，這是由于振搖可使海狗油滴破裂為小油滴，增大了油與衍生化試劑的接觸面積，加快了反應的進行。
表1溫度對衍生化反應的影響結果

由表1可知，溫度在0℃到60℃之間變化對衍生化反應結果影響較小，經初步統計分析，其中EPA甲酯(EPAM)變異較大，故以其峰面積為考察指標，對各衍生溫度下結果進行方差分析，比較各組之間有無統計學差異，結果見表2和表3。
表2不同反應溫度對EPAM峰面積影響結果表

表3不同反應溫度對EPAM峰面積影響方差分析表

由于F0.05(2.9)＝4.26，方差分析計算所得F＝0.7955＜F0.05(2.9)，P＞0.05，所以三組數據間無統計學差異，說明盡管衍生溫度不同，最后反應都達到一個共同的平衡。溫度可選擇在在0-60℃之間，為了便于操作，衍生化反應優選在室溫下進行。
5.衍生化試劑甲醇鈉穩定性考察因有的文獻報道甲醇鈉不穩定，須現用現配，給試驗帶來較大不便；而有的文獻卻說甲醇鈉可室溫放置數月而保持穩定，故考察甲醇鈉的穩定性。
配制0.5mol/L甲醇鈉溶液7份，分別室溫(約15℃左右)放置1、2、3、5、10、15、30天。取海狗油7份，精密稱定，平行操作，分別加入7種放置不同時間的甲醇鈉進行衍生。各進樣兩次，以DHA為考察對象，以峰面積除以取樣量的商為指標，考察衍生化試劑穩定性。
由表5可見，甲醇鈉在15天以內催化衍生化能力基本無變化，峰面積/取樣量僅下降約1％；到第30天略有下降，峰面積/取樣量僅下降約4.5％，故甲醇鈉配好后最少可用15天。
表5甲醇鈉室溫放置對催化能力的影響

6.衍生化完全程度考察取海狗油及衍生化樣品點于硅膠G薄層板(110℃活化1h)上，石油醚(沸程30～60℃)-乙醚(9∶1)展開，噴0.02％Rhodamin6G乙醇液，于紫外燈(365nm)下觀察(見圖1)。脂肪酸甲酯的Rf值大于甘油三酯，衍生后樣品中甘油三酯點的消失，說明衍生化完全。
圖中4衍生完后樣品中甘油三酯斑點已完全消失，樣品衍生完全。
7.樣品衍生化方法的確立綜上可知，樣品衍生化方法為取海狗油80-120μl，置于瓶中，加入0.5-1.0mol/L甲醇鈉4-8ml，搖勻，在0-60℃下反應5-30分鐘，再加入0.2-0.5ml冰醋酸終止反應，用含0.001％-0.005％2，6-二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm-0.3μm膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液。
最佳樣品衍生化方法為取海狗油120μl，精密稱定，置100ml棕色容量瓶中，加入0.5mol/L甲醇鈉4ml，不斷振搖，室溫反應約15分鐘，加入0.2ml冰醋酸終止反應，用含0.005％/BHT的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液。
實驗例2本實驗例在于研究液相色譜儀的色譜條件。
1.儀器及試劑儀器島津(Shimadzu)201OA高效液相色譜儀、紫外雙波長檢測器、Class-VP色譜工作站；Waters515泵、996型二極管陣列檢測器、Millennium32色譜工作站；MiIlipore超純水制備機。
試劑高純氮氣；甲醇、乙腈色譜純，Fisher公司產品；三氟乙酸，色譜純，Merck公司產品；α-溴代苯乙酮，色譜純，Wako公司產品；EPA甲酯(EPAM)標準液(9.99mg/ml)、DHA甲酯(DHAM)標準液(9.81mg/ml)、DPA甲酯(DPAM)標準液(9.94mg/ml)，Supelco公司產品。
2.目的峰的確認利用相同條件下對照品和樣品保留時間對照法和樣品中加入對照品峰面積增大法對樣品中的目的組分進行了確認。
由圖2可見，在相同色譜條件下樣品中1號峰和EPAM對照品保留時間相同，2號峰和DHAM對照品保留時間相同，3號峰和DPAM保留時間相同。在樣品中分別加入EPAM、DHAM和DPAM對照品，則1號、2號、3號峰分別增高，由此可見樣品中1、2、3號峰分別為EPAM、DHAM和DPAM。后應用二極管陳列檢測器，通過光譜比對也驗證了該結果。
3.檢測波長的選擇樣品衍生后進液相色譜儀，用二極管陳列檢測器記錄色譜圖，從3D圖中提取三種脂肪酸的光譜圖；以吸光系數和精密度為指標，選擇合適的檢測波長。
由光譜圖可見，三種脂肪酸的極大吸收波長均為196.9nm，接近紫外末端，吸收值不穩定，故精密度較差，日內精密度RSD達3％以上；且大部分物質在196.6nm都有較強吸收，基線噪音較大。經嘗試發現210nm處三種脂肪酸吸收較強且穩定，精密度也符合藥典要求，故檢測波長選用210nm。
4.測試濃度和取樣量的選擇為減少系統誤差，使定量更準確，結合標準曲線的結果，確定樣品測定濃度約為0.1-0.3mg/ml左右；預定目的組分含量為5～10％，初步確定取樣量為120μl，定容至100ml。
5.色譜柱的選擇根據目的組分的結構特點和理化性質，對以下三種色譜柱進行考察(1)Allsphere Octyl(C8)，3μm，100，4.6mm×150mm；(2)Waters SymmetryShieldRP-18，5μm，100，3.9mm×150mm；(3)Lichrospher RP-18，5μm，100，4.6mm×250mm。
我們開始選用Allsphere Octyl柱，在乙腈-甲醇-水系統下反復調整各相比例，目的組份最好只能達到如圖3的分離程度，于是換為Waters-C18柱。
由于Waters-C18柱為短柱，故出峰較快，柱效較低(見圖4)，仍不能將目的組分基線分離。
最后換用Lichrospher RP-18柱，找到了最佳分離條件(見圖5)。三種脂肪酸與雜質均完全基線分離，分離度均大于1.5，且峰對稱性良好，故優選用LichrospherRP-18柱。
6.流動相的調整對以下三種流動相體系進行考察(1)甲醇∶水系統；(2)乙腈∶四氫呋喃∶水系統；(3)乙腈∶甲醇∶水系統。(見圖6-8)經反復調試，改變比例，最終發現系統(3)最好，在其比例為7∶1∶2時可使樣品基線分離，三種目的組分與前后雜質峰的分離度都大于1∶7，峰對稱性因子介于1到1.14之間，故選之。
7.流速的選擇在1.0ml/min流速下，目的組分出峰較晚，最后的DPAM要42分鐘才能出峰(見圖9)。這不僅浪費流動相，更使峰形展寬，分離度下降，影響定量準確性。因此，將流速逐漸提高至1.1-1.5ml/min，最后發現在流速為1.2ml/min時各項指標達到最佳，故選用該流速。
8.柱溫的選擇分別考察樣品在室溫、30℃、45℃時的分離效果，室溫(約20℃)及30℃時峰形展寬，分離變差，見圖10、11。原因可能是由于溫度較低時三種脂肪酸甲酯在固定相的溶解度發生變化，其與固定相的吸附解析過程時間變長，故峰展寬。經試驗對比發現45℃分離最佳。
9.色譜條件的確立與系統適用性試驗綜上可知，最佳色譜條件為色譜柱Lichrospher RP-18，5μm，100A，4.6mm×250mm；流動相乙腈∶甲醇∶水＝7∶1∶2，等梯度洗脫；流速1.2ml/min；柱溫45℃；檢測波長210nm；進樣量20μl。
實驗例3本實驗例目的在于對于本發明所述液相色譜條件方法學驗證。
1.線性范圍精密量取EPA甲酯標準液0.4ml、DHA甲酯標準液0.4ml、DPA甲酯標準液0.2ml置10ml棕色容量瓶中，異丙醇定容，作為混標溶液；將此混標液用異丙醇連續作7次倍比稀釋，得8種不同濃度的系列混標液；分別取20μl進樣，以峰面積對進樣濃度進行回歸，考察線性。
結果顯示三種脂肪酸甲酯標準品峰面積Y與其濃度X呈良好線性，線性方程見下表6表6各組分線性范圍、回歸方程及相關系數

2.精密度取配好的系列混標液高、中低三個濃度，各連續進樣5針，計算日內精密度，各連續三天進樣，計算日間精密度，結果見下表7表7精密度試驗結果

3.檢測限及定量限將混標溶液用異丙醇連續倍比稀釋后進樣，測出的三種脂肪酸甲酯的信號與空白樣品測出的噪音信號進行比較，以信噪比約為3∶1時，相應濃度確定檢測限，以信噪比約為10∶1時，相應濃度確定定量限，結果見表9。
表9各組份檢測限及定量限

4.專屬性4.1空白試驗取空白樣品進樣，記錄色譜圖，考察其他成分對樣品分析有無干擾。
圖12中上面為樣品色譜圖，下面為空白試驗色譜圖，對比可以看出冰醋酸、醋酸鈉、BHT出峰時間較早，對樣品分析均無干擾。
4.2峰純度檢查樣品衍生后進液相色譜儀，用二極管陳列檢測器記錄色譜圖，計算峰純度，見表10。
色譜工作站計算的三種脂肪酸甲酯色譜峰的純度角均小于其純度閾值，表明三者均為純物質峰。
表10三種脂肪酸甲酯純度角計算結果

5.耐用性5.1樣品測試液穩定性考察樣品測試液配好后4℃放置，分別于0、2、4、8、12、24小時各取20μl進樣2次，考察其穩定性。
由下表11可見，樣品測試液隨放置時間的延長，目的組分含量有下降趨勢，但變化不大，在24小時內三種主成分含量的RSD均小于5％，故可以認為樣品測試液在4℃放置24小時是穩定的。但樣品測試液長時間放置不穩定，室溫放置更會加速其降解，因此樣品衍生后應及時測定。
表11衍生化產物4℃放置穩定性考察結果

5.2不同儀器及色譜柱對分離的影響將島津(Shimadzu)2010A高效液相色譜儀換為Waters高效液相色譜儀，將LichrospherRP-18色譜柱換為同類型的Mightsil RP-18柱(5μm，100A，4.6mm×250mm)，考察方法耐用性。
圖13為用Mightsil RP-18柱得到的結果，可見樣品在兩個色譜柱均可得良好分離；峰純度檢查在Waters高效液相色譜儀上進行，結果也顯示方法耐用性良好。
6.準確度將三種脂肪酸標準液用異丙醇作10倍稀釋；準確稱取已準確定量的海狗油9份各12μl，置10ml棕色容量瓶中，分別定量加入EPAM和DHAM標準稀釋液1.2、1.0、0.8ml，加入DPAM標準稀釋液0.6、0.5、0.4ml；每種濃度3份，衍生后定容進樣，測定三種脂肪酸的含量，以加標液測定平均值為M，原樣品液含量平均值為P，加標量為A，照下式計算回收率∶回收率＝(M-P)/A×100％表12EPA甲酯加標回收率計算結果表

表13DHA甲酯加標回收率計算結果表

表14DPA甲酯加標回收率計算結果表

實驗例4本實驗例為海狗油有效成分含量的分析。
準確稱取海狗油5份，按上述步驟操作，外標法測定三種脂肪酸的含量，由外標法首先算得海狗油中脂肪酸相應甲酯的含量，要求得脂肪酸含量，尚需進行以下折算EPA含量＝EPAM含量×302.450/316.478＝EPAM含量×0.95567DHA含量＝DHAM含量×328.487/342.515＝DHAM含量×0.95904DPA含量＝DPAM含量×330.530/344.531＝DPAM含量×0.95936表15樣品中三種多烯脂肪酸百分含量(W/W)結果表

權利要求
1.脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，包括以下步驟1)脂肪油的衍生化處理取脂肪油與含0.2-1.0mol/L醇的堿金屬鹽以1∶30-100體積比混合搖勻，在0-60℃下反應至小油滴完全消失，再加入酸終止反應，用醇定容，過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液；2)色譜進樣分析取衍生處理后的脂肪油，進入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為流動相甲醇水系統、乙腈四氫呋喃水系統或乙腈甲醇水系統，等梯度洗脫，流速1.1-1.5ml/min，柱溫15-45℃，檢測波長202～230nm，進樣量5～50μl；3)記錄色譜圖，用外標法測定脂肪酸的含量。
2.根據權利要求1所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，基中，步驟1)脂肪油的衍生化處理取脂肪油80-120μl，加入0.2-1.0mol/L醇的堿金屬鹽4-8ml，搖勻，在0-60℃下反應至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml酸終止反應，用醇定容，0.2μm-0.3μm濾膜過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液。
3.根據權利要求1或2所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，所述的衍生化處理方法為取脂肪油100-120μl，加入0.5-0.8mol/L的甲醇鈉4-6ml，搖勻，室溫反應15-30分鐘，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸終止反應，用甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液。
4.根據權利要求1-3中任意一種所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，所述的醇的堿金屬鹽可為甲醇鈉、乙醇鈉或甲醇鉀，優選為甲醇鈉；定容所用的醇為甲醇或乙醇；所述的終止反應所用的酸為冰醋酸、甲酸、三氟乙酸或硫酸中的任意一種。
5.根據權利要求1-3中任意一種所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，定容時可加0.001％-0.005％的抗氧化劑，所述的抗氧化劑為2，6-二叔丁基對甲酚或對羥基叔丁基茴香醚。
6.根據權利要求1-3中任意一種所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，所述的衍生化處理方法為取脂肪油100-120μl，加入0.5-0.8mol/L的甲醇鈉4-6ml，搖勻，室溫反應15-30分鐘，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸終止反應，用含0.003％-0.005％ 2，6-二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液。
7.根據權利要求1-3中任意一種所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，所述的液相色譜儀為RP-18型，5μm，100，4.6mm×250mm型號。
8.根據權利要求1-3中任意一種所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，所述的流動相為乙腈甲醇水系統，三者比例為7∶1∶2，流速為1.2ml/min。
9.海狗油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，包括以下步驟1)海狗油的衍生化處理取海狗油80-120μ1，加入0.2-1.0mol/L甲醇鈉4-8ml，搖勻，在0-60℃下反應至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml冰醋酸終止反應，用含0.001％-0.005％ 2，6-二叔丁基對甲酚的醇定容，0.2μm-0.3μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液；2)色譜進樣分析取衍生處理后的海狗油供試品溶液，進入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為流動相甲醇水系統、乙腈四氫呋喃水系統或乙腈甲醇水系統，等梯度洗脫，流速1.1-1.5ml/min，柱溫15-45℃，檢測波長202-230nm，進樣量5～50μl；3)記錄色譜圖，用外標法測定脂肪酸的含量。
10.根據權利要求9所述的海狗油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，所述的衍生化處理方法為取海狗油120μl，加入0.5mol/L甲醇鈉4ml，搖勻，室溫反應至小油滴完全消失，再加入0.2ml冰醋酸終止反應，用含0.005％ 2，6-二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液。
全文摘要
本發明公開了脂肪油中有效成分的一種測定方法，該方法采用柱前衍生反相HPLC法，簡化了樣品衍生化操作步驟，無需萃取，節省時間和試劑，衍生化反應完全，采用適當的色譜分離條件，將目的組分與雜質完全基線分離。
文檔編號G01N30/06GK1758060SQ200410080429
公開日2006年4月12日 申請日期2004年10月9日 優先權日2004年10月9日
發明者徐康森, 王召, 樂嘉靜, 李湛君 申請人:中國藥品生物制品檢定所