專利名稱：用于檢測硫酸鹽還原菌的引物和熒光探針的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測微生物的引物和探針。
背景技術：
硫酸鹽還原菌(sulfate reducing bacteria，SRB)是一類與硫酸鹽還原反應相關的細菌的總稱。由革蘭氏陰性菌(如脫硫弧菌屬Desulfovibrio，脫硫桿菌屬Desulfobacterium)、革蘭氏陽性菌(脫硫腸狀菌屬Desulfotomaculum)、嗜熱細菌(熱脫硫菌屬Thermodesulfobacterium)和嗜熱古細菌(古生球菌屬Archaeoglobus)等多種微生物構成。
SRB菌通過一系列復雜的生物化學反應將硫酸鹽還原成H2S和大量的硫化物，硫化物和H2S不僅腐蝕油田生產設備；而且其腐蝕產物(金屬硫化物)不溶于水，導致污水發黑、懸浮固體含量增加，使處理后水中懸浮固體含量超標，嚴重的危害了油田的正常生產。因此，快速定量檢測硫酸鹽還原菌對于油田水質檢測和地面系統殺菌劑濃度的合理調節具有重要的生產指導意義。但是，目前SRB菌的定量檢測方法(如絕跡稀釋法等)存在檢測時間長、非特異性高、檢測結果偏低的缺陷。

發明內容
本發明的目的是為了解決目前SRB菌的定量檢測方法存在檢測時間長、非特異性高、檢測結果偏低的缺陷，而提供的用于檢測硫酸鹽還原菌的引物和熒光探針。
用于檢測硫酸鹽還原菌的上游引物基因序列為5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列為5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’。
用于檢測硫酸鹽還原菌的熒光探針由報告熒光基團、淬滅熒光基團和探針基因序列組成；探針基因序列為5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探針基因序列5’端標記的報告熒光基團是FAM，探針基因序列3’端標記的淬滅熒光基團是TAMRA。
SO42-/SO32-的氧化還原電位太低，致使硫酸根(或亞硫酸根)不能直接接受電子，因此硫酸根(或亞硫酸根)離子的還原首先需要硫酸根(或亞硫酸根)離子活化。在硫酸腺苷轉移酶的作用下硫酸鹽還原菌以ATP為代價將硫酸根離子激活，經過復雜的生物化學反應生成H2S。所以，腺苷酰硫酸還原酶(adenosine-5′-phosphosulfate reductase，APS)是硫酸鹽還原菌還原硫酸鹽生成H2S的關鍵酶。腺苷酰硫酸還原酶是一種寡聚鐵硫黃素蛋白，含有一分子黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和12個原子的鐵和不穩定硫；APS基因在硫酸鹽還原菌中具有保守性結構框架，APS蛋白結構中包含有典型的硫酸鹽-亞硝酸鹽還原酶的保守框架CP-Xn-C-X2-C-X2-C框架，能與[4Fe4S]結合，是SRB菌共有的一個穩定靶位點；所以，本發明根據腺苷酰硫酸還原酶基因序列的保守區域設計了具有特異性的引物和熒光探針。本發明引物和熒光探針特異性高，在引物和熒光探針的雙重作用下假陽性大幅降低。使用本發明的引物和熒光探針進行熒光定量PCR檢測硫酸鹽還原菌，檢測時間短、從樣本的模板DNA提取到熒光定量PCR檢測全過程僅需6h。


圖1是具體實施方式
四中以pGEM-T-DSR為底物的PCR擴增曲線圖，圖1中曲線①模板濃度為5.65×107copies/μL的PCR擴增曲線，②模板濃度為5.65×106copies/μL的PCR擴增曲線，③模板濃度為5.65×105copies/μL的PCR擴增曲線，④模板濃度為5.65×104copies/μL的PCR擴增曲線，⑤模板濃度為5.65×103copies/μL的PCR擴增曲線，⑥模板濃度為0 copies/μL的PCR擴增曲線；圖2是具體實施方式
四中硫酸鹽還原菌熒光定量檢測標準曲線圖。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式用于檢測硫酸鹽還原菌的上游引物基因序列(FP)為5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列(RP)為5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’。
本實施方式檢測引物根據APS基因在硫酸鹽還原菌中具有的保守性結構框架而特異性設計、合成。
具體實施方式
二本實施方式用于檢測硫酸鹽還原菌的熒光探針由報告熒光基團、淬滅熒光基團和探針基因序列組成；探針基因序列為5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探針基因序列5’端標記的報告熒光基團是FAM，探針基因序列3’端標記的淬滅熒光基團是TAMRA。
本實施方式熒光探針的基因序列根據APS基因在硫酸鹽還原菌中具有的保守性結構框架而特異性設計、合成。
具體實施方式
三本實施方式采用熒光定量PCR法檢測硫酸鹽還原菌1、設計、合成檢測引物和熒光探針根據APS基因在硫酸鹽還原菌中具有的保守性結構框架設計、合成特異性引物和熒光探針。上游引物基因序列(FP)為5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列(RP)為5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’；探針基因序列為5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探針基因序列5’端標記的報告熒光基團是FAM，探針基因序列3’端標記的淬滅熒光基團是TAMRA。引物和熒光探針的合成由生物工程公司完成。
2、引物和熒光探針檢驗(1)制備標準品(硫酸鹽還原菌)基因片段。標準品基因片段PCR反應體系(20μL)為硫酸鹽還原菌模板基因20ng，TagDNA聚合酶終濃度為0.3U，4種dNTP各0.3mmol/L，標準品上游引物(基因序列為5’-GGGYCTKTCCGCYATCAAYAC-3’)0.1μmol/L，標準品下游引物(基因序列為5’-GCACATGTCGAGGAAGTCTTC-3’)0.1μmol/L和余量的去離子水。標準品PCR反應程序為94℃預熱5min，94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸90s，循環30次，最后72℃延伸10min。
TagDNA聚合酶購自于寶生物工程(大連)有限公司。
(2)連接、轉化。將上一步(步驟2(1))得到的PCR產物(標準品基因片段)用明膠回收試劑盒(寶泰克)切膠回收，然后與pGEM-T載體連接，再轉化到大腸桿菌TOP10感受態細胞中。
pGEM-T購自于美國Promega公司，大腸桿菌TOP10感受態細胞購自于北京天為時代科技有限公司。
(3)藍白斑篩選。在加入氨芐青霉素Amp(5μg/mL)和X-gal的LB固體培養基上進行篩選。
(4)檢測陽性質粒基因序列。提取白色質粒基因，再用pGEM-T載體引物T7和SP6擴增，并測序。質粒基因提取使用上海華舜生物有限公司出品的DNA小量細菌提取試劑盒，基因測序工作由生物工程公司完成，質粒中插入序列為921bp，如SEQ ID NO4所示。
3、硫酸鹽還原菌熒光定量檢測靈敏度檢測和繪制標準曲線圖(1)檢測pGEM-T-DSR的濃度。
(2)換算為拷貝數。拷貝數換算公式為

拷貝數換算公式中C為pGEM-T-DSR的濃度，單位μg/μL；載體和目的片段的單位bp。
(3)質粒溶液(10×)梯度稀釋。以稀釋后的質粒溶液為模板，以水為對照組，以FP、RP為引物，進行實時熒光定量RT-PCR檢測。在實時熒光定量RT-PCR的40個循環結束后，利用分析軟件Opticon Monitor2.02，根據輸入的模板量和產生的熒光信號，計算出硫酸鹽還原菌熒光定量檢測標準曲線。
4、硫酸鹽還原菌實時檢測(1)實時PCR反應體系(25μL)，如表1所示。
表1

并在孔板上設陰性對照，以水為對照樣。
(2)實時PCR反應程序95℃預變性5min，94℃變性5s，60℃退火溫度30s，72℃延伸45s，40個循環，72℃延伸2min；溫度轉換率為20℃/s。在每個循環的60℃(退火)時進行熒光信號檢測。
(3)檢測結果判定陽性對照中CT值(域值循環數)小于28，陽性樣品中擴增曲線明顯；陰性對照CT值大于35，陰性對照中無擴增曲線。
本實施方式步驟4中油田污泥或污水污泥樣品按以下步驟獲得(一)1mL污泥震蕩5min，然后在3000r/min的條件下離心3～5min，留上清液；(二)加入上清液2倍體積的10×PBS進行洗滌，震蕩5min，然后在12000r/min的條件下離心5min，去掉上清液；(三)加入10×PBS緩沖液100μL，然后超聲波40s；(四)用上海華舜生物有限公司出品的DNA小量細菌提取試劑盒進行后續的DNA提取。
本實施方式陽性質粒中插入的基因序列中589bp～608bp與本實施方式用于檢測硫酸鹽還原菌的上游引物基因序列一致；陽性質粒中插入的基因序列中805bp～821bp與本實施方式用于檢測硫酸鹽還原菌的下游引物基因序列一致；陽性質粒中插入的基因序列中734bp～753bp與本實施方式用于檢測硫酸鹽還原菌的熒光探針的基因序列一致。
本實施方式采用美國MJ公司生產的MJResearch Opticon TM2實時熒光系統進行熒光定量PCR。
根據熒光定量PCR儀測出的數據和硫酸鹽還原菌熒光定量檢測標準曲線可以定量的計算出樣品中硫酸鹽還原菌的數量。本實施方式檢測記數更加準確，假陽性大幅降低。本實施方式檢測結果僅需要6個小時，大大節省了檢測時間，在油田實際生產中更具有實際指導意義。
具體實施方式
四本實施方式采用熒光定量PCR法檢測硫酸鹽還原菌，與具體實施方式
三的不同點是步驟3(1)中經檢測pGEM-T-DSR的濃度為5.65×107copies/μL。
步驟3(3)質粒溶液(10×)梯度稀釋。以稀釋后的質粒溶液為模板，以水為對照組，以FP、RP為引物，進行熒光定量RT-PCR檢測，并由計算機繪制出以pGEM-T-DSR為底物的PCR擴增曲線圖(如圖1所示)。圖1中從左至右6條曲線依次是模板濃度為5.65×107copies/μL、5.65×106copies/μL、5.65×105copies/μL、5.65×104copies/μL、5.65×103copies/μL和0 copies/μL(對照組)的PCR擴增曲線。在實時熒光定量RT-PCR的40個循環結束后，利用分析軟件Opticon Monitor2.02，根據輸入的模板量和產生的熒光信號，計算出硫酸鹽還原菌熒光定量檢測標準曲線(如圖2所示)。其它步驟及參數與實施方式三相同。
本實施方式硫酸鹽還原菌熒光定量檢測標準曲線公式Y＝-0.30X+11.21；相關系數為r2＝0.999。結果表明，樣品拷貝數與其相應的CT值具有良好的相關性，可用于硫酸鹽還原菌的定量檢測。
本實施方式與常規檢測方法絕跡稀釋法(most probable number，MPN)-Griess法檢測結果進行比較，兩種檢測方法的檢測結果如表2所示。
表2

檢測結果說明本實施方式檢測方法的檢測精度比常規方法(絕跡稀釋法)提高兩個數量級。
序列表<110>哈爾濱工業大學<120>用于檢測硫酸鹽還原菌的引物和熒光探針<160>6<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于檢測硫酸鹽還原菌的上游引物，根據APS基因在硫酸鹽還原菌中的保守性結構框架而設計。
<400>1cgctgaaatg accatgatgg 20<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于檢測硫酸鹽還原菌的下游引物，根據APS基因在硫酸鹽還原菌中的保守性結構框架而設計。
<400>2cgcgcatttc acgaagc 17<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測硫酸鹽還原菌的探針基因序列，根據APS基因在硫酸鹽還原菌中的保守性結構框架而設計。
<400>3ctgaagcctt acgaagatcg 20<210>4<211>921<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>陽性質粒中插入的基因序列。
<400>4gggtctgtcc gccatcaaca cctacctggg tgaaaacgac gccgacgact acgtccgcat 60ggtccgcacc gaccttatgg gcctggttcg cgaagacctt atcttcgacg taggccgtca 120cgttgacgac tccgtgcatc tatttgaaga ttggggcctt ccctgctgga tcaagggcga 180agacggccac aacctgaacg gcgctgccgc caaggctgct ggcaagagcc tgcgcaaggg 240cgatgcccct gtgcgttccg gccgctggca gatcatgatc aacggtgaat cctacaagtg 300catcgtggcc gaagctgcca agaatgccct gggtgaagac cgcatcatgg aacgtatctt 360catcgtgaag ctgcttctcg ataagaacac ccccaaccgc atcgccggcg ccgtgggctt 420caacctgcgc gccaacgaag tgcacatctt caaagccaac accatcatgg tggccgctgg 480cggtgccgtt aacgtgtacc gtccccgctc caccggtgaa ggcatgggcc gtgcatggta 540tcctgtgtgg aacgctggtt ctacctacac catgtgcgct caggttggcg ctgaaatgac 600catgatggaa aaccgcttcg tgcccgcccg cttcaaggac ggttacggcc ccgtgggtgc 660gtggttcctc ctgttcaagg ccaaagccac taactccaag ggtgaagatt attgcgccac 720caaccgcgcc atgctgaagc cttacgaaga tcgcggctac gccaagggcc atgtcattcc 780gacctgcctg cgtaaccaca tgatgcttcg tgaaatgcgc gaaggccgcg gccccatcta 840catggacacc aagagcgccc tgcagaacac cttcgcgacc ctgaacgaag aacagcagaa 900ggatcttgaa tccgaagctt g 921<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>硫酸鹽還原菌標準品的上游引物。
<220>
<221>misc_feature<222>(4，7，13，19)<223>k＝g或t/u；y＝t/u或c<400>5gggyctktcc gcyatcaaya c 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>硫酸鹽還原菌標準品的下游引物。
<400>6gcacatgtcg aggaagtctt c 2權利要求
1.用于檢測硫酸鹽還原菌的引物，其特征在于用于檢測硫酸鹽還原菌的上游引物基因序列為5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列為5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’。
2.用于檢測硫酸鹽還原菌的熒光探針，其特征在于用于檢測硫酸鹽還原菌的熒光探針由報告熒光基團、淬滅熒光基團和探針基因序列組成；探針基因序列為5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探針基因序列5’端標記的報告熒光基團是FAM，探針基因序列3’端標記的淬滅熒光基團是TAMRA。
全文摘要
用于檢測硫酸鹽還原菌的引物和熒光探針，它涉及用于檢測微生物的引物和探針。它解決了目前SRB菌的定量檢測方法存在檢測時間長、非特異性高、檢測結果偏低的缺陷。上游引物5’－CGCTGAAATGACCATGATGG－3’；下游引物5’－CGCGCATTTCACGAAGC－3’。熒光探針由報告熒光基團、淬滅熒光基團和探針基因序列組成；探針基因序列為5’－CTGAAGCCTTACGAAGATCG－3’，探針基因序列5’端標記的報告熒光基團是FAM，探針基因序列3’端標記的淬滅熒光基團是TAMRA。本發明引物和熒光探針特異性高，使用本發明的引物和熒光探針進行熒光定量PCR檢測硫酸鹽還原菌，檢測時間短、從樣本的模板DNA提取到熒光定量PCR檢測全過程僅需6h。
文檔編號G01N33/52GK101089195SQ20071007233
公開日2007年12月19日 申請日期2007年6月8日 優先權日2007年6月8日
發明者魏利, 馬放, 李維國 申請人:哈爾濱工業大學