專利名稱：一種測定糖化血紅蛋白百分比的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學免疫，具體而言是涉及一種可以直接測定糖化血紅蛋白百分比的 方法及其試劑。
背景技術：
糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HbAlc)是人體血液中紅細胞內的血紅 蛋白與血糖結合的產物。糖化血紅蛋白可以穩(wěn)定可靠地反映出檢測前120天內的平均血糖 水平，且受抽血時間，是否空腹，是否使用胰島素等因素干擾不大。因此，國際糖尿病聯(lián)盟推 出了新版的亞太糖尿病防治指南，明確規(guī)定糖化血紅蛋白是國際公認的糖尿病監(jiān)控“金標 準”。如果空腹血糖或餐后血糖控制不好，糖化血紅蛋白就不可能達標。常用的測定糖化血紅蛋白百分比的方法有離子交換層析、高效液相色譜、免疫法、 酶法等。其中離子交換層析、高效液相色譜法需要特定的儀器，價格昂貴，不適用于中小型 醫(yī)院的使用。酶法檢測糖化血紅蛋白是利用氧化還原反應，需要多種酶的參與。而臨床上 常使用的免疫學方法有兩種，一種是需要單獨測定血液樣本中的總血紅蛋白和糖化血紅蛋 白的濃度，并且隨后計算糖化血紅蛋白與總血紅蛋白的比值的免疫競爭抑制法，另一種是 可以直接測定糖化血紅蛋白百分比的膠乳凝集法，此法需要在使用前配制抗體工作液，且 配制好的抗體工作液穩(wěn)定期較短。臨床上常使用的可以直接測定糖化血紅蛋白百分比的膠乳凝集法，均需要在使用 前配制抗體工作液，且配制好的抗體工作液穩(wěn)定期較短，一般在10-15天左右即失效，雖然 放置在-io°c以下冷凍可保存數月，但不能反復凍融，不利于日常使用，而且低溫冰箱較難獲得。
發(fā)明內容
介紹本發(fā)明的技術方案前，首先對其原理進行分析說明，以便能夠被更好的理解。 本發(fā)明檢測技術采用定時散色比濁法為檢測原理，可溶性抗原與特異性的抗體反應形成不 溶性復合物，當光線通過反應懸液時發(fā)生散射并由特定蛋白分析儀檢測到，散射光值的多 少與測試樣品中的特定蛋白濃度成一定比例。在本發(fā)明中，利用抗原抗體反應直接測定總 血紅蛋白中糖化血紅蛋白的百分含量，樣品中總血紅蛋白和HbAlc與乳膠有相同的非特異 性吸附而固相化，當加入HbAlc的特異性單克隆抗體后形成乳膠-HbAlc-鼠抗人HbAlc單 克隆抗體的復合物，此復合物由于羊抗鼠IgG抗體而形成凝集，凝集量與乳膠表面固相化 的HbAlc量成一定比例關系。為克服以上現有技術的不足，本發(fā)明提供一種無需在使用前配制抗體工作液即可 直接測定糖化血紅蛋白百分比的方法，其包括如下步驟a.將全血樣本與溶血液混合均勻；b.取適量溶血后的樣本加入懸浮在甘氨酸緩沖液中的乳膠；c.經預定時間后再分別加入抗體A試劑及抗體B試劑；
3
d.混合均勻后在單波長光照射條件下，通過特定蛋白分析儀讀取散射值；e.最后根據所述散射值從標準曲線圖中讀取所述糖化血紅蛋白的百分比；所述抗體A試劑是羊抗鼠IgG抗體和甘氨酸緩沖液的混合液，抗體B是鼠抗人 HbAlc單克隆抗體和甘氨酸緩沖液的混合液。優(yōu)選的，所述步驟c中的預定時間為6. 5分鐘，所述步驟d中的單波長光的波長為 630nmo再優(yōu)選的，所述步驟a中的溶血液是H2O,所述步驟b中的乳膠濃度為0. 1 %、甘 氨酸緩沖液的濃度為15mmol/L，所述步驟c中的羊抗鼠IgG抗體濃度為0. 005mg/ml 0. 007mg/ml、鼠抗人HbAlc單克隆抗體濃度為0. 05mg/ml、甘氨酸緩沖液的濃度為60mmol/ L0進一步優(yōu)選的，所述羊抗鼠IgG的濃度為0. 006mg/ml。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的測定方法以定時散射比濁法為檢測原理，不需要單獨測定血液樣本中的 總血紅蛋白及糖化血紅蛋白含量即可直接確定其中的糖化血紅蛋白百分比，且無需在使用 前配制抗體工作液即可直接測定，即延長了試劑的有效使用時間，又簡化了操作步驟。將步驟c中的預定時間設為6. 5分鐘，步驟d中的單波長光的波長為630nm 690nm,時間是，同類產品都需要10分鐘以上的測試時間。采用波長范圍在630nm 690nm 的單波長光(可見光里面最長的波長)，可獲得最穩(wěn)定的測試結果；同時，在以上預定的波 長范圍內，6. 5分鐘是最佳的測試時間，也即此時間是基于確保測試結果準確及穩(wěn)定的最快 時間。羊抗鼠IgG的濃度范圍為0. 005mg/ml 0. 007mg/ml，是因為此抗體的需要量很 少，采用此低濃度的目的是為了方便加樣。因為兩種抗體是分別加入的，如果濃度過高，無 法加樣(極小體積的加樣很難操作且易導致加樣重復性差)，如濃度過低，則抗體穩(wěn)定性不 好。所以采用此濃度范圍，既方便加樣，抗體穩(wěn)定性又好。
圖1是不同百分比的糖化血紅蛋白標準品的標準曲線(每個點代表了一種百分比 的標準品，其中X軸表示糖化血紅蛋白的百分比，Y軸表示散射值)；圖2是本發(fā)明的一個實施例的糖化血紅蛋白試劑和現有技術中的一個糖化血紅 蛋白試劑測定樣本的相關圖(其中X軸表示本試劑的測定結果，Y軸表示現有技術中的一 個試劑的測定結果)。
具體實施例方式以下結合實施例并對照附圖對本發(fā)明的技術方案做進一步詳細的說明。實施例1本實施例的糖化血紅蛋白檢測試劑包含溶血液、乳膠、抗體A試劑及抗體B試劑， 其中溶血液為H2O ；乳膠濃度為0. 1%，懸浮在濃度為15mmol/l的甘氨酸緩沖液中；抗體A 為濃度為0. 006mg/ml的羊抗鼠IgG抗體，混合在濃度為60mmol/l的甘氨酸緩沖液中；抗體 B為濃度為0. 05mg/ml的鼠抗人HbAlc單克隆抗體，混合在濃度為60mmol/l的甘氨酸緩沖液中；全血樣本的用量為5 μ 1，溶血液的用量為500 μ 1，乳膠用量為210 μ 1，抗體A和抗體 B的用量分別為50μ 1和70 μ 1。其中，所述溶血液、乳膠、羊抗鼠IgG抗體及鼠抗人HbAlc 單克隆抗體用量的百分比為1.49% 62. 69% 14. 92% 20.90%。本實施例中，如將所述羊抗鼠IgG的濃度改為0. 005mg/ml或0. 007mg/ml及兩者 之間的其它值，也同樣能夠得到合格的糖化血紅蛋白檢測試劑。實施例2本實施例以定時散射比濁法為檢測原理，直接測定糖化血紅蛋白百分比的方法包 括a.糖化血紅蛋白測定標準曲線的制作，即散射值與多個糖化血紅蛋白標準品的糖 化血紅蛋白百分比-散射值對應數據庫以定時散射比濁法為檢測原理，所需材料包括如 前實施例所述的糖化血紅蛋白檢測試劑，其中的溶血液500μ 1，乳膠210μ 1，抗體A(即濃 度為0. 006mg/ml的羊抗鼠IgG抗體)50 μ 1，抗體B (即濃度為0. 05mg/ml的鼠抗人HbAlc 單克隆抗體)70 μ 1 ；糖化血紅蛋白標準品和特定蛋白分析儀。樣本處理將5 μ 1糖化血紅蛋白標準品，加入500 μ 1溶血液中溶血，溶血完全后 即可檢測。準備每個樣品要用的測量杯，在測量杯中加入5μ 1上述溶血樣本，用移液器加入 210ul乳膠，等待3分鐘之后加入70 μ 1抗體B和50 μ 1抗體Α，混勻后用特定蛋白分析儀 (特定蛋白分析儀是指可測定人體液中的特定蛋白質的分析儀)測定標準品散色值，并于 第30秒讀取此時間段的最低散射值Si，第180秒后讀取散射值S2，反應散射值的計算為S2 與Sl的差值。依據多個散射值與多個標準品定值濃度百分比作不同百分比的糖化血紅蛋 白標準品的標準曲線，即濃度百分比-散射值曲線圖，如圖1所示，其中每個點代表了一種 百分比的標準品，X軸表示糖化血紅蛋白的百分比，Y軸表示散射值。為提高精確度，可將每 個濃度重復測試三次，取平均值。為得到較為準確的檢測結果，檢測過程中測定溫度為37°C ；檢測時特定蛋白分析 儀采用波長為630nm光。b.糖化血紅蛋白快速檢測試劑全血樣本的測定用手指微量全血作為樣本，將 5 μ 1新鮮手指末梢血，加入500 μ 1溶血液中溶血，溶血完全，在測量杯中加入5 μ 1上述溶 血樣本，用移液器加入210ul乳膠，等待3分鐘之后加入70 μ 1抗體B和50 μ 1抗體Α，混勻 后用特定蛋白分析儀測定標準品散色值，檢測時特定蛋白分析儀采用波長為630nm光，并 于第30秒讀取此時間段的最低散射值Sl'，第180秒后讀取散射值S2'，散色值為S2'與 Si'的差值為700。c.查詢C反應蛋白濃度依據前述b步驟測定得到的散色值700，與圖1對照，算 出樣本中糖化血紅蛋白的百分比含量為8.2%。本實施例中也可采用靜脈抗凝血作為全血樣本；本實施例的整個檢測過程僅需 6. 5分鐘，而目前臨床上使用的可以直接測定糖化血紅蛋白百分比的膠乳凝集法，需要在使 用前配制抗體工作液，且配制好的抗體工作液穩(wěn)定期較短，使用繁瑣且費時。如圖2所示，顯示了本試劑和現有技術中一個試劑的測定樣本的相關圖。其中X 軸表示本試劑測定結果，Y軸表示現有技術中一個試劑的測定結果，相關系數r2 = 0. 9901， 回歸方程為y = 1. 0039X+0. 0074。二者測定結果采用假設檢驗配對t檢驗得出ρ > 0. 05，說明二者之間無差異。實施例3糖化血紅蛋白快速檢測試劑的靈敏度驗證實施例準備測定用糖化血紅蛋白快速 檢測試劑，如前述實施例所述的試劑，以及高值及低值質控品，特定蛋白分析儀。取具有溯 源性的高值質控物、低值質控物各一份，對每份質控物進行10次檢測，將檢測結果計算平 均值、標準差和變異系數。結果見表1 表 1 由表1中變異系數可知，本發(fā)明提供的C反應蛋白檢測方法具有較高的精密度。實施例4準確度驗證實施例取具有溯源性的血清高值質控物、血清低值質控物各一份，用 試劑分別進行檢測，各檢測5次，計算平均值，與質控物靶值進行對照。結果見表2 表2 由表2的測試數據與靶值的對比可知，本發(fā)明提供的C反應蛋白檢測方法具有較 高的準確度。實施例5靈敏度的驗證實施例取具有朔源性的質控品稀釋至檢測范圍下限附近進行測 定，重復測定3次，計算平均值，與質控物靶值進行對照。結果見表3
表3 由表3測試數據與靶值的對比可知，本發(fā)明提供的C反應蛋白檢測方法具有較高 的靈敏度。以上內容是結合具體實施實施例對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā) 明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫 離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的保護 范圍。
權利要求
一種測定糖化血紅蛋白百分比的方法，其特征在于包括如下步驟a.將全血樣本與溶血液混合均勻；b.取適量溶血后的樣本加入懸浮在甘氨酸緩沖液中的乳膠；c.經預定時間后再分別加入抗體A試劑及抗體B試劑；d.混合均勻后在單波長光照射條件下，通過特定蛋白分析儀讀取散射值；e.最后根據所述散射值從標準曲線圖中讀取所述糖化血紅蛋白的百分比；所述抗體A試劑是羊抗鼠IgG抗體和甘氨酸緩沖液的混合液，抗體B是鼠抗人HbA1c單克隆抗體和甘氨酸緩沖液的混合液。
2.如權利要求1所述的測定糖化血紅蛋白百分比的方法，其特征在于所述步驟c中 的預定時間為6. 5分鐘，所述步驟d中的單波長光的波長為630nm 690nm。
3.如權利要求2所述的測定糖化血紅蛋白百分比的方法，其特征在于所述步驟a中 的溶血液是H2O,所述步驟b中的乳膠濃度為0. 1 %、甘氨酸緩沖液的濃度為15mmol/L，所述 步驟c中的羊抗鼠IgG抗體濃度為0. 005mg/ml 0. 007mg/ml、鼠抗人HbAlc單克隆抗體濃 度為0. 05mg/ml、甘氨酸緩沖液的濃度為60mmol/L。
4.如權利要求3所述的測定糖化血紅蛋白百分比的方法，其特征在于所述羊抗鼠IgG 的濃度為0. 006mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及測定糖化血紅蛋白百分比的方法，其包括如下步驟a.將全血樣本與溶血液混合均勻；b.取適量溶血后的樣本加入懸浮在甘氨酸緩沖液中的乳膠；c.經預定時間后再分別加入抗體B試劑及抗體A試劑；d.混合均勻后在單波長光照射條件下，通過特定蛋白分析儀讀取散射值；e.最后根據散射值從標準曲線圖中讀取糖化血紅蛋白的百分比。該方法以定時散射比濁法為檢測原理，無需單獨測定血液樣本中的總血紅蛋白及糖化血紅蛋白含量即可直接確定其中的糖化血紅蛋白百分比，無需預先配制抗體工作液，既延長了試劑的有效使用時間，又簡化了操作步驟，且縮短了樣本的測定時間。
文檔編號G01N33/72GK101915849SQ20101021381
公開日2010年12月15日 申請日期2010年6月30日 優(yōu)先權日2010年6月30日
發(fā)明者余嘉陵, 楊青, 鄭筱雯, 陳明峰 申請人:深圳市國賽生物技術有限公司