專利名稱：一種早期乳腺腫瘤診斷的決策樹模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于診斷早期乳腺腫瘤的決策樹模型，為乳腺腫瘤的早期診斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
背景技術(shù)：
乳腺癌的癥狀可多種多樣，常見的有乳腺腫塊，乳腺疼痛，乳頭溢液、糜爛或皮膚凹陷，腋窩淋巴結(jié)腫大等。乳腺腫瘤多為良性，乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤.祖國醫(yī)學(xué)對(duì)乳腺癌有較詳細(xì)的論述.如“乳核”、“乳發(fā)”、“妒乳”等皆與乳癌有相似之處。并認(rèn)為由于情志不舒，肝氣郁結(jié)或沖任失調(diào)，氣血不暢等所致氣滯血瘀.蘊(yùn)結(jié)乳中而成。在我國乳腺癌發(fā)病率為11. 61/10萬人口，其發(fā)病率比較高。值得慶幸的是乳腺癌的發(fā)病率偏前，而死亡率偏后，這說明乳腺癌的治療效果在惡性腫瘤中是比較好的。一直被認(rèn)為是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的黃金工具一雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù) (2D-PAGE)所能檢測到的蛋白質(zhì)也只是蛋白質(zhì)組中的一小部分，許多種蛋白質(zhì)尤其是低分子量蛋白(MW<20kD)不能用此方法析出，需要用先進(jìn)的技術(shù)手段進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究。而最近幾年才發(fā)展起來的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法一表面加強(qiáng)激光解析電極飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)具有特殊的固相層析表面能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)保留在其上，經(jīng)離子化后用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)其進(jìn)行檢測，直接從未處理的生物樣品獲取蛋白質(zhì)組圖譜。利用經(jīng)過特殊處理的固相支持物制成蛋白質(zhì)芯片，根據(jù)蛋白質(zhì)物理、化學(xué)性質(zhì)的不同，可以非特異性或特異性地結(jié)合各種蛋白質(zhì)，并在質(zhì)譜儀中受到激光轟擊，各種結(jié)合蛋白質(zhì)會(huì)被激發(fā)而形成帶電離子，根據(jù)不同電離子在電場中飛行的時(shí)間長短，形成強(qiáng)弱不同的質(zhì)譜峰，進(jìn)而形成圖譜用于分析。這項(xiàng)技術(shù)與2D-PAGE相比，操作簡單，靈敏度高，檢測需要的樣品量少。近年來該技術(shù)在差異表達(dá)蛋白質(zhì)組、蛋白質(zhì)相互作用及疾病檢測方面得到了廣泛的應(yīng)用，尤其適合于多肽及低分子量蛋白質(zhì)譜分析。該技術(shù)在尋找前列腺、乳腺、卵巢腫瘤等疾病的診斷標(biāo)記物方面已經(jīng)取得了較大進(jìn)展。本發(fā)明從決策樹的角度，建立了一種可用于診斷早期乳腺腫瘤的模型，為乳腺腫瘤的早期診斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用Ciphergen公司的蛋白質(zhì)芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜儀系統(tǒng)，檢測早期乳腺腫瘤和健康人血清的蛋白質(zhì)譜，利用軟件分析早期乳腺腫瘤與正常人血清不同的對(duì)照蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)新的早期乳腺腫瘤相關(guān)性蛋白質(zhì)，制作成決策樹模型，用于診斷早期乳腺腫瘤。本發(fā)明將早期乳腺腫瘤和健康人血清分別利用Ciphergen公司蛋白質(zhì)芯片檢測， 得到數(shù)據(jù)利用該公司的Biosystems軟件的Biomarker wizard功能，分別對(duì)早期乳腺腫瘤和正常組樣品的蛋白質(zhì)波譜進(jìn)行比較，得出特異的蛋白質(zhì)圖譜，再根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)早期乳腺腫瘤與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的蛋白質(zhì)峰，并使用MathWorks公司的Matlab 2009a 軟件對(duì)早期乳腺腫瘤與對(duì)照組差異顯著特異蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，選取4個(gè)質(zhì)譜峰(分別為m/z4505，m/z5689，m/z7580，m/zll245)時(shí)正確率最高，為79%。利用這4個(gè)質(zhì)譜峰建立了早期乳腺腫瘤與正常人的決策樹模型，利用該模型，將受檢人血清中相應(yīng)的蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比與本發(fā)明模型逐一進(jìn)行比對(duì)，可為早期乳腺腫瘤診斷提供輔助指導(dǎo)。決策樹模型的檢測方法如下1.血清處理采集早期乳腺腫瘤患者術(shù)前血和正常對(duì)照外周靜脈血后立即放入4°C冰箱保存， 備用。檢測時(shí)，融解冰凍血清，離心，取血清樣品加緩沖液，振搖。2.芯片的平衡芯片孔中加入醋酸鈉溶液，平衡芯片2次，每次5min。3.稀釋取血清樣品，加入尿素，振蕩30min，加入醋酸鈉溶液中，混勻稀釋。4.上樣取稀釋后的血清樣品加入平衡好的芯片加樣孔，置芯片于搖床孵育90min。5.樣品洗脫取醋酸鈉溶液加入芯片加樣孔，洗脫2次，每次5min。取去離子水沖洗芯片。6.芯片與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)取能量吸收劑加入芯片加樣孔，待自然揮發(fā)后再重復(fù)加吸收劑一次。7.芯片檢測將芯片置于蛋白芯片閱讀機(jī)中，用加有標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的芯片校正儀器。設(shè)置芯片閱讀儀參數(shù)，用CipheEgen Pmteinchip 3. 1. 1軟件收集數(shù)據(jù)。其中縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對(duì)含量，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(M/Z)。經(jīng)過臨床試用，該決策樹模型可以較好地區(qū)分早期乳腺腫瘤和正常對(duì)照，該決策樹正確率為79%。


圖1乳腺腫瘤與正常人鑒別的決策樹模型圖中m/z表示特異蛋白的質(zhì)荷比，case代表早期乳腺腫瘤病人，ctrl代表正常人。
具體實(shí)施例方式1.材料1. 1檢測血清取受試者靜脈血5ml，在4度冰箱中靜置2小時(shí)后離心(4000rpm，5min).取血清， 置低溫冰箱(負(fù)80度)或液氮保存，備用。1. 2所需主要試劑與儀器乙酸鈉、乙腈、三氟乙酸、白芥子酸(SPA)均購自上海化學(xué)試劑公司。CMlO蛋白芯片和蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)(PBS II型)購自Ciphergen公司。2.方法2. 1芯片的平衡取200ul 50mmol/L pH 4. 0的醋酸鈉(NaAc)溶液加入芯片的加樣孔中，平衡芯片2次，每次5min。2. 2 稀釋
取6ul 血清樣品，加入 12ul 9mmol/L 尿素，振蕩 30min，加入 222ul 50mmol/L pH 為3. 0的NaAc溶液中，混勻稀釋。2. 3.上樣取稀釋后的血清樣品200ul/孔加入平衡好的芯片加樣孔，置芯片于搖床孵育 90mino2. 4.樣品洗脫取50mmol/L pH 4. 0的NaAc溶液200ul/孔加入芯片加樣孔，洗脫2次，每次5min。 取300ul/孔的去離子水沖洗芯片。2.5.芯片與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)取能量吸收劑SPA (含飽和白芥子酸溶液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%乙腈和0. 15%三氟乙酸)0. 5ul/孔加入芯片加樣孔，待自然揮發(fā)后再重復(fù)加SPA —次。2. 6.芯片檢測將芯片置于蛋白芯片閱讀機(jī)中，用加有AU-in_0ne標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP20芯片校正儀器至0. 1 %范圍內(nèi)。芯片閱讀儀參數(shù)設(shè)置激光強(qiáng)度150，檢測靈敏度7，優(yōu)化范圍1984. 2 9921 u，最高分子量49605u，芯片上的每個(gè)點(diǎn)采集130次。用CipheEgenProteinchip 3. 1. 1 軟件收集數(shù)據(jù)。其中縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對(duì)含量，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(M/Z)。將分析得到的受檢者的血清蛋白波譜根據(jù)決策樹模型(圖1)中特異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比進(jìn)行比較，以判斷受檢者是否患有早期前列腺癌(見實(shí)施實(shí)例)。實(shí)驗(yàn)實(shí)例取受檢者血清，經(jīng)檢驗(yàn)得到其血清蛋白圖譜，按圖1早期乳腺腫瘤與正常組鑒別的決策樹模型，觀察蛋白質(zhì)波峰，先看質(zhì)荷比M/Z為4505的蛋白質(zhì)，其波峰強(qiáng)度系數(shù)A是否 (3. 16，是則再看M/Z為5689的蛋白質(zhì)，其波峰強(qiáng)度系數(shù)A是否彡1. 18，是則為對(duì)照組， 否則為病例組。看質(zhì)荷比M/Z為4505的蛋白質(zhì)，其波峰強(qiáng)度系數(shù)A > 3. 16時(shí)再看M/Z為 11245的蛋白質(zhì)，其波峰強(qiáng)度系數(shù)A是否彡0. 14，是則為對(duì)照組，否則最后看M/Z為7580的蛋白質(zhì)，其波峰強(qiáng)度系數(shù)A是否< 31. 25，是則為病例組，否則為對(duì)照組。以上是對(duì)本發(fā)明的描述而非限定，基于本發(fā)明思想的其它實(shí)施方式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
權(quán)利要求
1.用于乳腺腫瘤早期診斷的決策樹模型，其特征在于由蛋白質(zhì)芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜儀系統(tǒng)檢測的血清蛋白質(zhì)圖譜經(jīng)過軟件統(tǒng)計(jì)分析得到乳腺腫瘤患者多個(gè)特異蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比 (m/z)及其蛋白質(zhì)波峰強(qiáng)度系數(shù)A繪制而成，所說的特異蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比(m/z)分別為m/ z4505, m/z5689, m/z7580, m/z 11245
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種可以用于早期乳腺腫瘤診斷的決策樹模型。本發(fā)明運(yùn)用蛋白質(zhì)芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)，檢測正常人及早期乳腺腫瘤病人的外周血清樣品，找出與乳腺腫瘤患者差異顯著的特異蛋白質(zhì)峰，根據(jù)各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比(m/z)，采用決策樹算法，建立一個(gè)決策樹模型。只要將檢測人血清中相應(yīng)的蛋白質(zhì)的m/z與本發(fā)明的模型進(jìn)行分析，就可以初步用于乳腺腫瘤診斷。其預(yù)測準(zhǔn)確率為79％。
文檔編號(hào)G01N27/62GK102323324SQ20101054538
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2010年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月15日
發(fā)明者曾華宗 申請(qǐng)人:上海聚類生物科技有限公司