專利名稱：基于五鄰體蛋白的favi抗體間接elisa檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒，尤其是一種基于五鄰體蛋白的FAVI 抗體間接ELISA檢測試劑盒。
背景技術：
I群禽腺病毒(f0Wl adenovirus group I，FAVI)歸于腺病毒科禽腺病毒屬，具有共同的群抗原，基于分子結構的差異可分為5個種(FAV A-E)，基于交叉中和試驗結果可分為12個血清型(FAV1-12)。該群病毒包括常規的禽腺病毒(代表株為雞胚致死孤兒)，在世界范圍內廣泛存在，較多的存在于禽類體內，而不發病。雖然FAVI不是引起發病的重要病原，但可與其他病原共同作用于家禽，具有繼發性。近年來，由FAVI引起的包涵體肝炎、 心包積液綜合征和砂囊糜爛的感染呈上升趨勢，在國內外引起了廣泛的關注。研究表明，該病與傳染性法氏囊和傳染性貧血有關。此外，該病既可經卵垂直傳遞污染雞胚，也可經排泄物水平傳播，這給防控該病帶來了巨大的困難。目前，采用普通PCR法檢測FAVI臨床樣品，耗時費力，無法快速處理和診斷大量樣品；利用血清學檢測方法，如中和試驗，由于存在交叉反應而不能確切診斷，且需在動物、雞胚或組織培養細胞等活體內進行；瓊脂凝膠免疫擴散由于沉淀素擴散需孵育2天，拖延了診斷時間敏感性又低。因此，快速、準確、簡便的診斷是防治該病的關鍵，特別是尋找一種優勢抗原對其診斷具有相當重要的意義，也能為FAVI抗體監測和流行病學調查提供可靠保證。五鄰體、六鄰體和纖維蛋白是FAVI的三個主要結構蛋白，它們共同構成病毒核衣殼。其中，每個五鄰體由基底和伸出表面的一根末端有頂球的纖維組成，有助于病毒黏附于細胞表面；五鄰體還可與細胞表面的病毒受體結合，在病毒感染細胞過程中起著非常重要的作用。研究表明，當腺病毒纖維蛋白太短時，五鄰體通過其Arg-Gly-Asp (RGD)序列與細胞表面的整聯蛋白作用，介導腺病毒的侵入和內化。同時，五鄰體保守性較好，能刺激機體產生抗體中和病毒體。因此，五鄰體蛋白在FAVI的致病性、診斷、預防與控制等方面具有重要意義。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種快速、準確、簡便、適于大批量檢測的基于五鄰體蛋白的FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒，以便于I群禽腺病毒抗體的臨床檢測、流行病學調查和主動免疫效果檢測。為解決上述技術問題本發明采用如下技術方案基于五鄰體蛋白的FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒，包括包被酶標板、陰性標準血清、陽性標準血清、羊抗雞IgG酶標二抗、洗滌液、稀釋液、底物液和終止液，包被酶標板以I群禽腺病毒五鄰體重組蛋白作為包被抗原。I群禽腺病毒五鄰體蛋白由序列表SEQ. ID. No. 1的截短的五鄰體基因編碼。
I群禽腺病毒五鄰體重組蛋白來自大腸桿菌原核表達。包被酶標板是用包被液將包被抗原稀釋至1 30 μ g/mL，加入96孔酶標板， 100 μ L/孔，置于37°C溫育Ih后，4°C過夜；用PBST洗板3次，拍干，用封閉液封閉酶標板， 37°C溫育lh，用PBST洗板3次，拍干制得；封閉液為5%脫脂奶；包被液為pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液。羊抗雞IgG酶標二抗是以辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG。陰性標準血清是SPF雞胚孵育所產2 5日齡雛雞的血清；陽性標準血清是經I群禽腺病毒模擬自然感染的方式滴鼻、點眼兩次后的SPF雞血清；洗滌液是含有0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，PH為7. 4 ；稀釋液是BSA;底物液是TMB-H2A溶液；終止液是2M H2SO4。磷酸鹽緩沖液由NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g，KH2PO4 0. 2g, Na2HPO4. 12H20 2. 9g，吐溫-20 500uL，加蒸餾水定容至1000mL3M PH值到7. 4制成。TMB-H2O2 溶液由 TMB 緩沖液 10ml、TMB 溶液 0. 5ml、H2O2 32ul 組成；TMB 緩沖由 Na2HPO4 18. 27g，檸檬酸4. 665g，用900mL溶解，調PH至5. 5，加水至IOOOmL制成；TMB溶液由5mL無水乙醇溶解TMB IOmg制成。根據I群禽腺病毒五鄰體蛋白的特性，本發明利用五鄰體蛋白的抗原表位作為包被抗原，以辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG為酶標二抗，制成了 FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒。該試劑盒具有抗原制備工藝簡單、生物安全度高、成本低廉、易于生產和應用等特點。使用本發明，以雞血清為檢測樣品，建立起利用五鄰體重組蛋白作為包被抗原的間接 ELISA檢測方法，該法特異性強、靈敏度高、重復性好、適于大批量檢測，可用于I群禽腺病毒抗體的臨床檢測、流行病學調查和主動免疫效果檢測。


圖1是I群禽腺病毒五鄰體重組蛋白的SDS-PAGE圖，圖中M是DNA分子量標準， 1是pGEX-4T-l空菌體表達產物，2和5是五鄰體融合蛋白表達產物，3和4是五鄰體融合蛋白未誘導。圖2是應用本發明基于五鄰體蛋白的FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒的檢測方法流程圖。
具體實施例方式一、包被抗原五鄰體重組蛋白的制備本發明中所用的包被抗原是利用引物PCR擴增I群禽腺病毒五鄰體的抗原表位， 將截短的五鄰體基因插入表達載體PGEX-4T-1中構建重組質粒pGEX-penton，再將該重組質粒轉化大腸桿菌DH5ci中進行原核表達而形成的重組蛋白(如圖1)。(羅思思，謝芝勛， 鄧顯文，等.I群禽腺病毒五鄰體基因的克隆及原核表達[J].廣東農業科學，2011，38 (7) 154-157)。五鄰體重組蛋白經包涵體純化后，作為試劑盒中包被酶標板的包被抗原。
二、ELISA檢測試劑盒所用試劑的準備與配制(1)辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG酶標二抗購自KPL公司；(2)包被酶標標板的制備用包被液將包被抗原稀釋至1 30 μ g/mL,加入96孔酶標板，100 μ L/孔，置于37°C溫育Ih后，4°C過夜；用PBST洗板3次，拍干，每孔加入封閉液200 μ L，置于37°C封閉lh，用PBST洗板3次，拍干制得；包被液碳酸鹽緩沖液=Na2CO3 1. 59g, NaHCO3 2. 93g，加蒸餾水定容至IOOOmL, il PH值到9. 6 ；封閉液5%脫脂奶，5g脫脂奶用PBST定容至IOOmL ；(3)洗滌液含有0. 05 %吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，即PBST =NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g，KH2PO4 0. 2g，Na2HPO4. Iffl2O 2. 9g，吐溫-20 500uL，加蒸餾水定容至 IOOOmL, il PH 值到 7. 4 ；(4)稀釋液1 % BSA Ig牛血清白蛋白BSA用PBST定容至IOOmL ；(5)底物液(TMB-H2O2 溶液)=TMB 緩沖液(Na2HPO4 18. 27g，檸檬酸 4. 665g， 用900mL溶解，調PH至5. 5，加水至IOOOmL) IOmL, TMB溶液(TMB IOmg, 5mL無水乙醇溶解)0. 5mL, H2O2 32uL ；(6)終止液2M H2SO4 :21. 7mL濃硫酸緩慢加入178. 3mL蒸餾水中。三、ELISA操作方法(如圖2)(1)包被用包被液將包被抗原稀釋至1 30 μ g/mL,加入96孔酶標板，100 μ L/ ？L置于37°C溫育Ih后，4°C過夜；用PBST洗板3次，拍干；(2)封閉每孔加入5%的脫脂奶200yL，置于37°C封閉45min，用PBST洗板3次， 拍干；(3)與血清結合設陰性標準孔和陽性標準孔，其余孔加入待檢樣品，IOOyL/孔， 于37°C溫育Ih后，用PBST洗板3次，拍干；(4)與酶標二抗結合辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG用1 % BSA以1 1000 1 8000倍稀釋，100 μ L/孔，置于37°C溫育Ih后，用PBST洗板3次，拍干；(5)顯色每孔加入IOOuL底物顯色液，于37°C避光作用IOmin ；(6)終止每孔加入50uL終止液，酶標儀檢測0D450值；(7)結果判定計算檢測50份SPF陰性血清樣品的0D450平均值X和標準差SD，若樣品( 450值> X+3SD，判為陽性；若樣品( 450值< X+3SD，判為陰性。計算得X為0. 182， SD為0. 051，根據統計學原則，陰性樣本的X+3SD為陰、陽性臨界值，即該法的陰陽性臨界值為 0. 182+3X0. 051 = 0. 335 若樣品 0D450 值> 0. 335，為陽性，若樣品 0D450 值< 0. 335， 為陰性。四、FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒的實際應用1.臨床樣品檢測(1)樣品采集隨機采集10份臨床樣品，以靜脈采集活禽市場雞血液，析出的血清為待檢樣品；(2)檢測具體方法同上；(3)結果與判定測定各樣品的0D450值，根據上述的標準判定，結果如表1。表1臨床樣品ELISA檢測結果
權利要求
1.一種基于五鄰體蛋白的FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒，包括包被酶標板、陰性標準血清、陽性標準血清、羊抗雞IgG酶標二抗、洗滌液、稀釋液、底物液和終止液，其特征在于所述包被酶標板以I群禽腺病毒五鄰體重組蛋白作為包被抗原。
2.根據權利要求1所述的基于五鄰體蛋白的FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述I群禽腺病毒五鄰體蛋白由序列表SEQ. ID. No. 1的截短的五鄰體基因編碼。
3.根據權利要求1所述的基于五鄰體蛋白的FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述I群禽腺病毒五鄰體重組蛋白來自大腸桿菌原核表達。
4.根據權利要求1所述的基于五鄰體蛋白的FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述包被酶標板是用包被液將包被抗原稀釋至1 30 μ g/mL,加入96孔酶標板， 100 μ L/孔，置于37°C溫育Ih后，4°C過夜；用PBST洗板3次，拍干，用封閉液封閉酶標板， 37°C溫育lh，用PBST洗板3次，拍干制得；所述封閉液為5%脫脂奶；所述包被液為pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液。
5.根據權利要求1所述的基于五鄰體蛋白的FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述羊抗雞IgG酶標二抗是以辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG。
6.根據權利要求1所述的基于五鄰體蛋白的FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述陰性標準血清是SPF雞胚孵育所產2 5日齡雛雞的血清；所述陽性標準血清是經I群禽腺病毒模擬自然感染的方式滴鼻、點眼兩次后的SPF雞血清；所述洗滌液是含有0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，pH為7. 4 ；所述稀釋液是BSA;所述底物液是TMB-H2A溶液；所述終止液是2M H2SO4。
7.根據權利要求4所述的基于五鄰體蛋白的FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述磷酸鹽緩沖液由 NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g，KH2PO4 0. 2g，Na2HP04. 12Η202· 9g，吐溫-20 500uL,加蒸餾水定容至IOOOmL,調PH值到7. 4制成。
8.根據權利要求4所述的基于五鄰體蛋白的FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述TMB-H2A溶液由TMB緩沖液10ml、TMB溶液0. 5ml, H2O2 32ul組成；所述TMB緩沖由Na2HPO4 18. 27g，檸檬酸4. 665g，用900mL溶解，調PH至5. 5，加水至IOOOmL制成；所述TMB溶液由5mL無水乙醇溶解TMB IOmg制成。
全文摘要
本發明公開了一種基于五鄰體蛋白的FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒，其包被酶標板以I群禽腺病毒五鄰體重組蛋白作為包被抗原。本發明根據I群禽腺病毒五鄰體蛋白的特性，本發明利用五鄰體重組蛋白的抗原表位作為包被抗原，以辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG為酶標二抗，制成了FAVI抗體間接ELISA檢測試劑盒。該試劑盒具有抗原制備工藝簡單、生物安全度高、成本低廉、易于生產和應用等特點。使用本發明，以雞血清為檢測樣品，建立起利用五鄰體重組蛋白作為包被抗原的間接ELISA檢測方法，該法特異性強、靈敏度高、重復性好、適于大批量檢測，可用于I群禽腺病毒抗體的臨床檢測、流行病學調查和主動免疫效果檢測。
文檔編號G01N33/68GK102445548SQ20111036100
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者劉加波, 龐耀珊, 羅思思, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所