專利名稱：一種快速分離測定水體中尼古丁的方法
技術領域：
本發明涉及一種快速分離測定水體中尼古丁的方法。
背景技術：
打擊制假造假窩點是煙草打假的工作重點。但是隨著制售假煙網絡化、專業化程度的提高，制假窩點的隱蔽性越來越強，導致煙草打假普遍存在調查取證困難的問題。尼古丁是煙草特有的生物堿，其含量不僅是評價煙葉質量和香煙品質的一個重要指標，也可作為嫌疑點是否存在煙草制品生產的一種判斷的依據。從嫌疑點取得的水體，通過一定的方法進行檢測，如存在著一定量的尼古丁，可初步推測該嫌疑點可能存在煙草制品生產。為了測定尼古丁，國內外的研究人員做了大量的工作，S. A Al-Tamrah等建立了分光光度法測定煙草中尼古丁的含量，趙立紅等通過連續流動分析法測定煙草中尼古丁的含量，許燕娟等用毛細管氣相色譜法測定煙草中的煙堿、降煙堿、麥斯明、二烯煙堿、新煙堿、去氫新煙堿、2，3'-聯二吡啶、可替寧8種主要生物堿。但是，分光光度法和流動注射光度法缺乏選擇性；氣相色譜法基體干擾大、靈敏度低；氣質方法具有較好的選擇性，但是對于復雜的基質，具有相同質荷比的離子碎片出現的幾率較高，為了獲得較好的選擇性，往往也需要達到較好的色譜基線分離。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是煙草制假窩點隱蔽性強、打假普遍存在調查取證困難的問題，提供了一種快速分離測定水體中尼古丁的方法。該方法確證性高，檢出限低，前處理簡便、快捷。為了解決上述技術問題，本發明采用如下的技術方案一種快速分離測定水體中尼古丁的方法，該方法包括了樣品的前處理、色譜分離和質譜檢測，其特征在于樣品經離心過濾后，先采用液相色譜柱分離，再進行甲醇-水體系洗脫，最后通過電噴霧串聯三重四級桿質譜監測尼古丁可能出現的碎片。進一步，樣品經離心過濾的具體步驟是樣品離心后取清液通過混纖微孔過濾膜過濾。進一步，液相色譜柱分離所采用的色譜柱為反相C18色譜柱；甲醇-水體系洗脫所用的甲醇-水體系，體積比為95 5;洗脫程序為等度洗脫；流速400ul/min;柱溫30°C;進樣量10 u I o進一步，通過電噴霧串聯三重四級桿質譜監測尼古丁可能出現的碎片的具體步驟是采用ESI源，正離子化模式，氣簾氣壓力設置為0. 17MPa，霧化氣0. 55MPa，碰撞氣0.04Mpa，離子源溫度為550°C，離子化電流設為3iiA，多反應監測(MRM)監測質核比m/z130.1。進一步，該快速分離測定水體中尼古丁的方法可運用于煙草打假的調查取證工作。
本發明的有益之處在于液相色譜-電噴霧串聯三重四級桿質譜(LC-ES1-MS/MS)是近年來發展起來的一種聯用方法。其電噴霧離子化技術是一種較溫和的電離方式，可以在不破壞分子結構的基礎上獲得待測物質的相關信息(如分子量)。加以適當的碰撞能量，線性離子阱質譜可以在二級或多級質譜水平上獲得離子碎片信息，在很大程度上排除了色譜共流出物和在一級質譜中具有相同質荷比物質的干擾。因此，用液相色譜質譜聯用來進行測定尼古丁的含量具有選擇性好、靈敏度高等特點。上述技術方案的意義在于I、從技術學角度，提供了一種煙草打假的調查取證手段；2、采用煙草特有的尼古丁作為判斷依據，確證性高；3、采用液相色譜質譜聯用法進行檢測，檢出限低、前處理簡便、快捷。


圖1空白樣品加標的總離子流圖；圖2尼古丁 MS/MS譜圖及可能出現的離子碎片；圖3尼古丁標準工作曲線。
具體實施例方式從嫌疑點取得的水體，經離心過濾后，先采用液相色譜柱分離，再進行甲醇-水體系洗脫，最后通過電噴霧串聯三重四級桿質譜監測尼古丁可能出現的碎片。具體步驟如下(I)樣品采集從嫌疑點取得的有代表性的水體，密封待測；(2)樣品處理將上述樣品搖勻，取IOmL離心(7800r/min) 15min,后取清液通過混纖微孔過濾膜過濾，棄去最初的5mL，保留ImL樣品進樣檢測；(3)色譜分離離心過濾后的樣品先采用液相色譜柱分離，分離所采用的色譜柱為反相C18色譜柱；再進行甲醇-水體系洗脫。色譜柱Phenomenex Luna 5uC18(150X4. 6mm, 5um);流動相甲醇-水(95 5, V V)等度洗脫；流速 400ul/min ;柱溫30°C ;進樣量lOiil。(4)質譜檢測采用ESI源電離，正離子化模式，氣簾氣壓力設置為0. 17MPa，霧化氣0. 55MPa，碰撞氣0. 04Mpa,離子源溫度為550°C，離子化電流設為3 y A，多反應監測(MRM)監測質核比m/z 130.1。為了探索用液相色譜質譜聯用法測定水體中尼古丁的含量，進行了大量的實驗，具體如下I實驗部分1.1儀器、材料與試劑美國AB SCIEX 5500電噴霧串聯三重四級桿質譜；美國Agilent 1290超高效液相色譜儀；美國Millipore超純水儀；高速冷凍離心機(德國SIGMA，配25mL離心管)；() 2 y m混纖微孔過濾膜；尼古丁(> 99.5%，sigma);甲醇(色譜純，百靈威化學試劑公司)。1. 2儀器條件
1.2.1色譜方法色譜柱PhenomenexLuna 5u C18 (150 X 4. 6mm, 5um);流動相甲醇-水(95 : 5，V : V)等度洗脫 r iOS400ul/min ;柱溫 30°C ;進樣量 IOy I。1. 2.1質譜方法質譜檢測采用ESI源，正離子化模式，氣簾氣壓力設置為0. 17MPa，霧化氣0. 55MPa，碰撞氣0. 04Mpa，離子源溫度為550°C，離子化電流設為3iiA。多反應監測(MRM)監測質核比m/z 130.1。1. 3樣品處理從嫌疑企業排污口取得有代表性的廢水樣品，搖勻，取IOmL離心(7800r/min) 15min,后取清液通過混纖微孔過濾膜過濾,棄去最初的5mL,保留ImL樣品進樣檢測。 2結果與討論2.1流動相的選擇參考相關文獻，分別對甲醇-水(95 5，V/V)等度洗脫，乙腈-磷酸鹽(1+9)緩沖溶液(pH = 3，含0. 02mmol/L庚烷磺酸鈉)等度洗脫和乙腈-0. 5%醋酸鈉水溶液梯度洗脫進行了比較，結果發現后兩種流動相都不能很好地分離尼古丁和樣品中的其他成分，而在甲醇水(95 5，V/V)等度洗脫下，尼古丁與其他成分的分離效果很好，且峰形尖銳。所以本實驗采用甲醇-水(95 5，V/V)作為流動相，在這一條件下的空白樣品加標的總離子流圖如圖1所示。2. 2質譜條件的確定本實驗用注射泵直接進樣得到尼古丁的二級質譜圖(圖2)。尼古丁的吡咯環、批啶環斷裂形成碎片m/z 84.0和80. O。由于吡咯環胺的丟失能夠形成帶有共軛雙鍵體系的碎片，這種碎片結構比較穩定，加之胺比較容易從分子丟失，所以，碎片m/z 130. 1、132. 0和106. 2的相對豐度較大。同時隨著能量的增加，還會出現m/z 117.0等碎片。本實驗選取相對豐度較大的特征子離子m/z 130.1作為檢測對象。2. 3線性范圍及檢出限用尼古丁標準溶液分別配制0. 80,4. 00,8. 00,20. 00,40. 00,80. 00ug/l的標準系列，在設定色譜條件下進行分析。以標準系列峰面積對其質量濃度進行線性回歸，計算線性回歸方程、線性范圍，以3倍信噪比計算檢出限，如圖3所示。結果發現，在0. 50 50. Oug/I范圍線性良好，相關系數為0. 9995，檢出限為0. 05ug/l。2. 4準確度和精密度實驗準確移取IOml樣品，添加3個不同質量水平(分別為低于、約等于、高于真實含量)的尼古丁標準溶液，按上述樣品處理方法和色譜條件進行實驗，計算尼古丁添加回收率以及測定結果的相對標準偏差，結果如表I所示加標回收率為96. 03% 97. 90%,相對標準偏差小于0. 80% (n = 5)表I樣品回收率Table I Recovery experiment
權利要求
1.ー種快速分離測定水體中尼古丁的方法，該方法包括了樣品的前處理、色譜分離和質譜檢測，其特征在于樣品經離心過濾后，先采用液相色譜柱分離，再進行甲醇-水體系洗脫，最后通過電噴霧串聯三重四級桿質譜監測尼古丁可能出現的碎片。
2.如權利要求I所述的ー種快速分離測定水體中尼古丁的方法，其特征在于樣品經離心過濾的具體步驟是樣品離心后取清液通過混纖微孔過濾膜過濾。
3.如權利要求I或2所述的ー種快速分離測定水體中尼古丁的方法，其特征在于液相色譜柱分離所采用的色譜柱為反相C18色譜柱；甲醇-水體系洗脫所用的甲醇-水體系，體積比為95 5 ;洗脫程序為等度洗脫；流速400ul/min ;柱溫30°C ;進樣量10 μ I。
4.如權利要求I或2所述的ー種快速分離測定水體中尼古丁的方法，其特征在于通過電噴霧串聯三重四級桿質譜監測尼古丁可能出現的碎片的具體步驟是采用ESI源，正離子化模式，氣簾氣壓カ設置為O. 17MPa，霧化氣O. 55MPa，碰撞氣O. 04Mpa,離子源溫度為550°C，離子化電流設為3μΑ，多反應監測(MRM)監測質核比m/z 130.1。
5.如權利要求3所述的ー種快速分離測定水體中尼古丁的方法，其特征在于通過電噴霧串聯三重四級桿質譜監測尼古丁可能出現的碎片的具體步驟是采用ESI源，正離子化模式，氣簾氣壓カ設置為O. 17MPa，霧化氣O. 55MPa，碰撞氣O. 04Mpa,離子源溫度為550°C，離子化電流設為3μΑ，多反應監測(MRM)監測質核比m/z 130.1。
6.如權利要求I或2所述的ー種快速分離測定水體中尼古丁的方法，其特征在于該方法可運用于煙草打假的調查取證工作。
7.如權利要求3所述的ー種快速分離測定水體中尼古丁的方法，其特征在于該方法可運用于煙草打假的調查取證工作。
8.如權利要求4所述的ー種快速分離測定水體中尼古丁的方法，其特征在于該方法可運用于煙草打假的調查取證工作。
9.如權利要求5所述的ー種快速分離測定水體中尼古丁的方法，其特征在于該方法可運用于煙草打假的調查取證工作。
全文摘要
本發明提供了一種快速分離測定水體中尼古丁的方法。樣品經離心過濾，采用液相色譜柱分離，甲醇-水體系洗脫，電噴霧串聯三重四級桿質譜監測尼古丁可能出現的碎片，在6min內快速分離測定水體中尼古丁。該方法檢出限低、準確率高、操作簡便、快捷，非常適合煙草打假的調查取證工作，具有廣泛的應用和推廣價值。
文檔編號G01N30/88GK102980964SQ20121000223
公開日2013年3月20日 申請日期2012年1月5日 優先權日2012年1月5日
發明者張建平, 鄧其馨, 黃朝章, 謝衛, 許寒春, 趙藝強, 吳清輝, 蘇明亮, 白雪平, 蔡國華, 陳哲峰 申請人:福建中煙工業有限責任公司, 廈門煙草工業有限責任公司