專利名稱：一種檢測地溝油的方法及試紙與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及食品安全檢測領域和免疫熒光檢測技術領域，特別涉及一種檢測地溝油的方法及試紙與應用。
背景技術：
地溝油是質量、衛生極差，過氧化值、酸價、水分、羰基價、丙二醛、AFBI (黃曲霉毒素Aflatoxin Bl(AFBI))等指標嚴重超標的非食用油。餐飲業廢棄油脂中含有大量的有毒有害物質，人類食用后會產生頭暈、惡心、嘔吐、腹瀉、失眠、乏力、消化不良、肝區不適和劇烈腹絞痛等中毒癥狀，長期食用會出現貧血、營養不良，內臟受損，導致人體體重減輕和兒童發育障礙，嚴重者還可能出現中毒性肝病，誘發胃腺癌、腎癌及乳腺、卵巢、小腸等部位癌腫，長期食用對人體健康造成極大危害甚至致癌。有學者對泔水油進行了毒理學研究。研究表明，飼喂泔水油的小白鼠120天后出現死亡現象，到180天死亡率達到60%以上，而對照組的小白鼠沒有出現死亡現象；實驗組中小白鼠行動緩慢，有病狀，肝臟表面有一個黃色脂肪球，肝臟發黃，肝臟細胞變多，呈橢圓形，并有很多細胞處于分裂狀態。地溝油中的重金屬、毒素(如丙烯醛)嚴重超標，過氧化值高于0.4%，遠遠超過國家標準O. 15%。長期攝入會使細胞功能衰竭，誘發多種疾病，甚至致癌。日本曾發生食用過氧化值為7. 5%的劣質油脂而造成集體急性中毒事件。我國飲食業發達，是全世界消耗食用油最大的國家。在我國，地溝油的原料獲得比較容易，并且工藝簡單，幾個簡單的設備就可以加工，每年產生至少500萬噸地溝油。由于執法取證困難及違法成本低，在利益的驅動下一些不法投機者將地溝油用在食品中，對社會和食品安全造成非常大的危害。目前國內尚無可靠的檢測地溝油的方法，這使得執法部門無法對市場進行有效的監控。要減少不法投機者將地溝油用在食品中，除提高違法者的違法成本和建立市場準入制度外，還需要建立一套快速鑒別地溝油的檢測系統，為執法者執法時提供技術支持。目前國內尚未有檢測地溝油的統一標準。現行的國家強制性標準《食用植物油衛生標準》(2716-2005)中，關于食用油的理化指標檢測包括酸價、過氧化值、浸出油溶劑殘留、游離酚(棉籽油)、總砷、鉛、黃曲霉毒素、苯并芘、農藥殘留共9項指標，分別對植物原油和植物食用油進行不同的標準檢測。市場上已經有幾種類型的快速檢測技術或方法，分別為電導率檢測法、膽固醇檢測法、薄層層析技術等快速檢測方法，這些方法在應用上各有優勢，但都存在缺陷，如下所述電導率檢測法因為油脂在烹飪過程中接觸了洗滌劑、金屬器皿，或長期停留在重金屬環境中，因此地溝油的電導率值明顯高于普通食用油。武漢工業學院曾經找到一種30 分鐘內檢測地溝油的方法。通過檢測油的電導率，得出地溝油電導率是一級食用油的5 7倍的結論。這種方法對于“泔水油”的檢測相對有效。然而它的缺陷在于僅僅適用于地溝油添加量在20%以上的食品油檢測；另外只適用于物理壓榨法制備的油品，化學浸出法制備的油品電解質高容易造成假陽性。
膽固醇檢測法因為地溝油是多種動、植物油脂的混合物，其中動物脂肪中普遍含有膽固醇，而在人們食用的正規植物油中一般不含或只含有極少量的膽固醇。利用這一特性可以鑒別出某些地溝油，但同樣要求地溝油的添加量在10%以上。當有些食用油由于添加了棕櫚油，比較容易在低溫條件下形成結晶造成假陽性。薄層層析方法由于地溝油和深度油炸油中含有大部分食用油所不含的醛、酮類極性化合物，在展開劑作用下油樣中的各種成分在硅膠板上擴散分離，經過顯色劑顯色后可觀察到色譜板上不同的薄層斑點，記下原點至主斑點中心及展開劑前沿的距離，計算比移值(RF)。拖尾斑中主要是醛、酮類極性化合物。但是薄層層析法對于一些未經純化的油 (比如芝麻油、花椒油等)和加入其他成分的油(如辣椒油)，容易出現假陽性。綜上所述，現有的方法準確度不高，特異性不強。2011年10月12日我國衛生部新聞發言人鄧海華透露，目前征集到的5種地溝油檢測方法特異性不強，有關部門將再向社會公開征集方法。因此，開發靈敏度高、特異性強的用于地溝油的檢測技術迫在眉睫。

發明內容
本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種檢測地溝油的方法。本發明的另一目的在于提供實現所述檢測地溝油的方法的試紙。本發明的再一目的在于提供所述試紙的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種檢測地溝油的方法，為免疫學檢測方法，是以細菌脂多糖抗體和/或脂溶性蛋白抗體作為抗體進行檢測；所述的檢測地溝油的方法，具體包含以下步驟待檢樣品與抗體A反應后，加入葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物反應，通過檢測熒光的裝置進行檢測，從而確定待檢樣品中是否含有地溝油；該方法中的條件可以是酶聯免疫吸附方法中常規反應條件，也可以是膠體金試紙條中常用的反應條件；所述的抗體A為細菌脂多糖單克隆抗體或細菌脂溶性蛋白單克隆抗體中的一種或兩種；更優選為細菌脂多糖抗體；所述的抗體A優選為通過名稱為雜交瘤細胞株gzcdc-ETXOOl的單克隆細胞株制備得到，該單克隆細胞株于2011年12月4日保藏位于中國湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO C2011111 ；所述的抗體B同樣為細菌脂多糖單克隆抗體或細菌脂溶性蛋白單克隆抗體中的一種或兩種；更優選為細菌脂多糖抗體；所述的抗體B優選為通過名稱為雜交瘤細胞株gzcdc-ETXOOl的單克隆細胞株制備得到，該單克隆細胞株于2011年12月4日保藏位于中國湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO C2011111 ；所述的葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物優選通過以下步驟制備得到(I)將熒光素分子與以親水鏈為骨架的葡聚糖分子反應，得到結合熒光素的葡聚糖分子；(2)將結合熒光素的葡聚糖分子與抗體B反應,純化,得到葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物；
所述的葡聚糖優選為分子量20，000 30，000的葡聚糖；所述的熒光素優選為異硫氰酸熒光素；所述的純化優選通過凝膠層析法進行分離純化；由于葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物與其他物質(葡聚糖、抗體B和熒光素)之間分子量存在明顯差別，因而可以用分子篩純化材料進行層析，葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物由于分子量大，首先從純化柱中洗脫出來，而相對分子量較小的葡聚糖、抗體B和熒光素則在上述峰值之后才緩慢從純化柱中洗脫出來；所述的葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物更優選通過以下步驟制備得到(I)結合熒光素的葡聚糖分子的制備用有機溶劑溶解熒光素，在磁力攪拌條件下，滴加在含葡聚糖的醋酸溶液中，避光反應，使得熒光素上的碳原子與葡聚糖上的二乙烯砜反應以便進行標記偶聯；反應結束后，將PH值調至8. 8 9. 2，離心，取沉淀，得到結合熒光素的葡聚糖分子；其中，熒光素和葡聚糖按質量比I : 8 10進行配比；(2)葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物初產物的制備洗滌步驟⑴得到的沉淀， 再用醋酸溶液溶解沉淀，接著將PH值調節為4. 8 5. 2 ;在磁力攪拌條件下，滴加入抗體B 溶液，反應，得到葡聚糖-抗體B-突光素混合標記物初產物；抗體B的用量按Img突光素配比IOmg免疫球蛋白計算；(3)葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物的制備使用葡聚糖凝膠裝柱，用pH值
6.8 7. 2,0. 002 O. OlM的磷酸緩沖液(PB)平衡；將步驟(2)得到的葡聚糖、抗體B和熒光素混合標記物初產物上樣，再用pH值6. 8 7. 2、0. 002 O. OlM的磷酸緩沖液洗脫， 當黃綠色熒光出現在洗脫液時，收集全部黃綠色熒光溶液；將黃綠色熒光溶液透析，得到葡
聚糖-抗體B-熒光素混合標記物；
步驟(I中所述的有機溶劑優選為無水乙醇；
步驟(I中所述的熒光素優選為異硫氰酸熒光素；
步驟(I中所述的熒光素溶解于有機溶劑的濃度優選為I 2mg/ml ;更優選為lmg/ml ；
步驟(I中所述的葡聚糖優選為分子量20，000 30，000的葡聚糖；
步驟(I中所述的含葡聚糖的醋酸溶液中葡聚糖的濃度優選為5 10mg/ml ;醋酸的濃度優選為 2 O. 5mol/L ；
步驟(I中所述的反應的時間優選為2 6小時；更優選為4小時；
步驟(I中所述的PH優選通過氫氧化鈉進行調節；更優選通過lOmol/LNaOH溶液進行調節；
步驟(I中所述的pH優選為9 ；
步驟(I中所述的離心的條件優選為8000 IOOOOrpm離心5 10分鐘；
步驟(2中所述的洗滌優選使用蒸餾水進行洗滌，洗滌至液體為無色為止；
步驟(2中所述的醋酸溶液的濃度優選為質量百分比I 5% ;更優選為質量百分比2%
步驟(2中所述的醋酸溶液的用量優選為按溶解熒光素的濃度I 2mg/ml計算用量。
步驟(2中所述的PH優選通過氫氧化鈉進行調節；更優選通過lOmol/LNaOH溶液
7進行調節；步驟(2)中所述的抗體B溶液的濃度優選為15 25mg/mL ;更優選為20mg/mL ；步驟⑵中所述的反應的時間優選為15 25分鐘；更優選為20分鐘；步驟(3)中所述的葡聚糖凝膠優選為Sephadex_G50凝膠；步驟⑶中所述的洗脫的速度優選為lml/min ；步驟(3)中所述的透析的條件優選為使用截留分子量I萬的透析袋和O. Olmol/L、 pH7. 9 8. I的磷酸鹽緩沖液，O 4°C透析過夜；實現上述檢測地溝油的方法的試紙條，包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結合墊、層析膜和吸水墊；其中，結合墊包被有葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物；層析膜上具有一條檢測帶和一條質控帶，檢測帶上固定有抗體A，質控帶固定有能與葡聚糖-熒光素標記的抗體B特異結合的抗抗體；檢測帶靠近結合墊，質控帶靠近吸水墊；所述的抗體A為細菌脂多糖單克隆抗體或細菌脂溶性蛋白單克隆抗體中的一種或兩種；更優選為細菌脂多糖抗體。所述的抗體A優選為通過名稱為雜交瘤細胞株gzcdc-ETXOOl的單克隆細胞株制備得到，該單克隆細胞株于2011年12月4日保藏位于中國湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO C2011111 ；所述的抗體B同樣為細菌脂多糖單克隆抗體或細菌脂溶性蛋白單克隆抗體中的一種或兩種；更優選為細菌脂多糖抗體；所述的抗體B優選為通過名稱為雜交瘤細胞株gzcdc-ETXOOl的單克隆細胞株制備得到，該單克隆細胞株于2011年12月4日保藏位于中國湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO C2011111 ；所述的抗體A和所述的抗體B可以相同，也可以不同；所述的抗抗體優選為羊抗鼠IgG抗體；所述的結合墊優選為玻璃纖維膜或聚酯膜；所述的層析膜優選為硝酸纖維素膜；所述的試紙條的制備方法，包含以下步驟(I)用稀釋液將葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物稀釋到以抗體B計算，濃度為 0. 01 0. 03mg/ml，然后將結合墊浸泡在稀釋液中2 5分鐘，經過烘干或者真空冷凍干燥后，再裝配到試紙條底板上；稀釋液的組成為pH7. 4,0. OlM的PBS緩沖液中加入NaN3和 BSA, NaN3的終濃度為質量百分比0. 1%,BSA的終濃度為質量百分比1% ；(2)在層析膜上設置兩條帶，一條檢測帶和一條質控帶；檢測帶上固定有抗體A ; 質控帶固定有能與葡聚糖-熒光素標記的抗體B特異結合的抗抗體；(3)在步驟(2)的層析膜的一側貼上樣品吸收墊和結合墊，另一側貼上吸水墊；樣品吸收墊、結合墊、層析膜和吸水墊依次緊密相連，層析膜的檢測帶靠近結合墊，質控帶靠近吸水墊；利用切割機進行試紙條的切割，得到試紙條。步驟(2)中所述的固定是指按照普通免疫檢測試紙制作工藝，利用點膜機將檢測抗體、質控抗體劃線到層析膜上進行封閉，其目的是在檢測時作為檢測帶和質控帶；所述的試紙條的應用，包含以下步驟(I)在樣品吸收墊上加入待測油樣；在毛細作用下，樣品液向吸水墊一端泳動，抗原存在的情況下為抗原在結合墊處與葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物形成免疫復合物， 再進一步泳動，免疫復合物與檢測帶處的抗體A結合形成類似雙抗體夾心的免疫復合物， 剩余的葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物移動至質控帶(C線)反應形成條帶，為陽性結果；抗原不存在的情況下，結合墊處的葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物直接涌動至質控帶(C線)，與抗抗體結合；(2)通過熒光檢測裝置檢測；(3)結果的判斷檢測帶不顯示，質控帶顯示條帶，表明試紙條有效，待測油樣不是地溝油；檢測帶顯示條帶，質控帶顯示條帶，表明待測油樣為地溝油；檢測帶不顯示，質控帶不顯示，表明試紙條無效；檢測帶顯示條帶，質控帶不顯示，表明試紙條無效(如圖I所示)；步驟(2)中所述的熒光檢測裝置優選為便攜式熒光檢測儀。本發明的原理由于餐飲業泔水一般在外界放置3天以上才用于制備地溝油。由于泔水含有大量的營養成分，細菌能夠在其中大量繁殖。在制備地溝油的工藝工程，一般將泔水煮沸2小時，脂類物質充分釋放至上層，與此同時細菌結構受到破壞，與此同時細菌外膜上的脂溶性蛋白和脂多糖也隨之融入地溝油中。目前的地溝油的制備工藝中，不能將殘留的細菌脂溶性蛋白和脂多糖去除。合格的油品中細菌脂溶性蛋白和脂多糖可以忽略不計。因此，以細菌脂溶性蛋白抗體和/或細菌脂多糖抗體為檢測抗體，對地溝油檢測，特異性強。由于在地溝油中的細菌脂溶性蛋白和脂多糖是痕量的，常規抗體標記所使用的辣根過氧化物酶存在敏感性差的問題，熒光素標記抗體技術，可極大提高檢測試劑的敏感性。 就標記抗體而言，常規的熒光素標記只有少量熒光素分子，與單位抗體結合，因而其陽性信號/背景信號之間的讀數比值過低。本發明特別使用葡聚糖-抗體-熒光素混合標記技術。 基于每個葡聚糖分子能含有1000個divinyls μ Ifone (二乙烯砜)活性基團，除少部分的 divinyls μ Ifone活性基團自身偶聯之外(形成類似口罩的結構)，每個葡聚糖分子中絕大部分的divinyls μ Ifone活性基團可與熒光素或抗體分別進行偶聯。因此，先將葡聚糖活化與成百上千的熒光素分子結合，結合后的葡聚糖-熒光素混合物再與抗體結合，利用這種技術陽性信號/背景信號之間的讀數比值成百上千的提高。本發明所提供的紙條，原理包括雙抗體夾心法和間接法兩種免疫學方法。雙抗體夾心法是檢測帶的反應方法，待測抗原在結合墊處與葡聚糖-抗體-熒光素混合物中的抗體結合，形成免疫復合物，該免疫復合物在層析膜上進行泳動并與膜上的檢測帶抗體進行結合，形成固化的免疫復合物；間接法是質控帶的反應方法，葡聚糖-熒光素混合物標記的抗體在膜上泳動并與質控帶上的抗抗體進行結合，形成固化的免疫復合物。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果(I)首先，本發明以細菌的脂溶性蛋白和/或脂多糖作為抗原進行檢測，特異性強。(2)本發明提供的免疫熒光學檢測方法，特別提供了實現該方法的試紙條，操作簡單、檢測時間短(15分鐘以內)、靈敏度高的特點，能夠彌補上述電導率檢測法、膽固醇檢測法、薄層層析技術等靈敏度低、特異性差的缺點。(3)另外，本發明所提供的試紙條在使用時，結合微型熒光信號測試設備進行檢
9測。由于微型熒光信號測試設備可用于熒光信號的定量檢測。因此，本發明所提供的試紙條可以實現檢測結果的定量化，克服了現有技術中金標試紙條只能定性的不足之處。


圖I是本發明所提供的試紙條的結果判讀示意圖，其中T為檢測帶，C為質控帶。圖2是本發明提供的試紙條的結構示意圖，其中1為樣品吸收墊，2為結合墊，3 為層析膜，4為底板,5為吸水墊。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例I抗體A和抗體B的制備抗體A和抗體B都屬于抗相同物質的單克隆抗體，即細菌(肺炎克萊伯菌)脂多糖或脂溶性蛋白單克隆抗體，具體制備方法為(I)細菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原的合成把甲基化的牛血清白蛋白(BSA)、戊二醛、細菌(肺炎克萊伯菌)脂多糖和細菌脂溶性蛋白按摩爾比I : 25 80的比例混合后，用O. OlM碳酸鈉溶液調節混合物溶液pH到 9. 0，40°C反應6小時，使細菌脂多糖和脂溶性蛋白連接到載體蛋白上，得到細菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原。(2)使用細菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原免疫小鼠①以細菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原與等量弗氏完全佐劑乳化后，采用皮下多點注射(100 μ g/0. 2mL.只)方式對4只4周齡的雌性BALB/c小鼠(購自廣東省實驗動物中心)進行皮下免疫；②初次免疫4周后，取細菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，對小鼠采用皮下注射加強免疫(100 μ g/只)；以后每三周加強免疫I次；③融合前三天，采用尾靜脈注射細菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原水溶液 (50 μ g/只)，準備進行細胞融合實驗。(3)細胞融合雜交瘤技術篩選抗細菌脂多糖和脂溶性蛋白單克隆抗體①將I X IO8脾細胞(從步驟(2)免疫后的小鼠脾臟中獲取)與2X IO7骨髓瘤細胞SP2/0 (中科院上海細胞所)混合于50mL融合管中，加DMEM培養基至30mL，IOOOrpm離心7min，將上清盡量吸凈。②在手掌上輕擊融合管底部，使沉淀細胞松散均勻，置40°C水浴中預熱。用ImL吸管在I分鐘內加入預熱至40°C的質量百分比50% PEG8000 (pH 8. O) lmL，邊加邊輕輕搖動混勻。用5mL吸管在90秒內加25mL預熱至37°C的不完全DMEM培養基，室溫靜置lOmin。 800rpm離心7分鐘,棄上清。③加入5mL HAT完全培養基，輕輕吹吸沉淀細胞，使其懸浮并混勻，然后補加HAT 培養基至90mL。分裝至融合前一天培養的含有飼養細胞的96孔細胞培養板，每孔100 μ L ; 培養板置37°C 5% CO2培養箱內培養。④培養至第5天，用HT完全培養基換出孔內一半的HAT培養液。培養至第7天，用HT培養基換出孔內全部培養液。⑤每天觀察雜交瘤細胞生長情況，待雜交瘤細胞長至10%以上孔底面積時，吸出培養液，進行抗體檢測；用競爭抑制ELISA方法，篩選出分泌抗細菌脂多糖和脂溶性蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將一株親和力高的雜交瘤細胞株于2011年12月4日保藏位于中國湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心，名稱為雜交瘤細胞株 gzcdc-ETXOOl，保藏編號為 CCTCC NO :C2011111。(4)腹水生產及細菌脂多糖和脂溶性蛋白單克隆抗體純化 ①選用標準BALB/c小鼠(廣東省實驗動物中心)，先用降植烷進行小鼠腹腔注射， 一周后每只老鼠按照5X IO6雜交瘤細胞gzcdc-ETXOOl接種到小鼠腹腔中去。I周后采集腹水，將腹水置于37°C靜置2小時后，13000rpm離心lOmin，除去細胞成分和其他的沉淀物， 收集上清,再過玻璃纖維柱,收集到澄清的腹水。②細菌脂多糖和脂溶性蛋白單克隆抗體純化采用辛酸-硫酸銨法進行初步純化，取ImL透析后粗提物加入ImL預裝柱，用0. OlM的PBS(pH7. 4)進行洗滌，加入ImL IOOmM 甘氨酸(PH2. 7)進行洗脫，重復6次。收集流出液，ImL/管，并用50 μ I IM Tris中和反應。 采用SDS-PAGE電泳檢測其純度及濃度，同時使用ELISA檢測純化抗體效價。細菌脂多糖抗體純度達到85%以上，濃度為8. 25mg/ml，效價達到I 2. 19 X IO6。實施例2熒光素混合標記物結合墊的制備I、葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物的制備(I)結合熒光素的葡聚糖分子的制備稱取IOmg異硫氰酸熒光素(FITC)，溶于 IOmL無水乙醇中，在磁力攪拌條件下逐滴加入到20mL葡聚糖濃度為10mg/ml的醋酸溶液 (0. 2mol/L)中，避光反應4小時，使FITC上的碳原子與葡聚糖上的二乙烯砜反應以便進行標記偶聯。用10mol/L NaOH調節pH值至9, IOOOOrpm離心5min，取沉淀。(2)葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物初產物的制備用蒸餾水洗滌沉淀，直至濾液澄清呈無色為止。將沉淀重新用質量百分比2%的醋酸溶液溶解，用lOmol/L NaOH調節pH值至5,在磁力攪拌條件下逐滴加入IOmL抗體B蛋白溶液(20mg/mL,按實施例I步驟
(4)由雜交瘤細胞株gzcdc-ETXOOl制備得到)。反應20分鐘后得到葡聚糖、抗體B和熒光素混合標記物初產物。(3)葡聚糖-抗體B-突光素混合標記物的制備用Sephadex_G50裝25cm層析柱， 凝膠沉淀約18cm(離管口 7cm，避免凝膠柱干掉)，用pH7. 0,0. 005M磷酸緩沖液(PB)平衡洗脫約10分鐘，流速控制為Iml/分鐘。吸取上述標記液上凝膠柱，注意不可使柱面干掉。用 pH7.0、0.005M磷酸緩沖液洗脫，流速控制為Iml/分鐘。當黃綠色熒光出現在洗脫液時，用試管收集全部黃綠色熒光溶液。黃色熒光溶液洗脫較慢，用蒸餾水洗脫約15分鐘，直至黃色熒光消失，停止洗脫后，將柱內凝膠回收入凝膠瓶內。接著將收集到的物質經透析(截留分子量I萬的透析袋和0. 01mol/L、pH7. 9 8. I的磷酸鹽緩沖液，O 4°C冰箱透析過夜) 后置于pH 7. 4、0. OlM的PBS緩沖液中，加入NaN3 (終濃度為質量百分比0. 1% )和BSA (終濃度為質量百分比1% )，得到葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物，4°C避光保存。2、結合墊制備將步驟⑴制備得到的葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物20mg稀釋于2000ml PBS緩沖液(pH 7. 4,0. 01M，含終濃度為質量百分比0. I %的NaN3和終濃度為質量百分比1%的BSA)中，葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物的終濃度為O. 01mg/ml。再將抗體結合墊(玻璃纖維膜或聚酯膜)浸泡于2000ml的混合標記物中，作用時間控制在2 5分鐘， 取出后37°C氣套式烘箱烘干，在45%濕度下避光保存備用。實施例3地溝油高靈敏性熒光檢測試紙的制備I、生產一種地溝油檢測免疫熒光試紙條所需材料①硝酸纖維膜由美國Millipore/NC進口，硝酸纖維膜的規格為30cmX3m/ ΗΑΗΥ00010 一條免疫熒光試紙條所需硝酸纖維膜面積為2. 5cmX0. 9cm。生產10萬人份高靈敏度熒光定量試紙條所需要硝酸纖維膜總面積為2. 5cmXO. 9cmX 10 萬=2. 25X 105cm2 ；生產10萬人份試紙條所需硝酸纖維膜的總卷數2. 25 X 105cm2/30 X 300cm2 = 25 卷。②檢測T線上所需抗細菌脂多糖或者脂溶性蛋白單克隆抗體抗細菌脂多糖或者脂溶性蛋白單克隆抗體(采用實施例I制備的細菌脂多糖和脂溶性蛋白單克隆抗體)的總量0. 5mg/ml X 2. O μ 1/cmX O. 3cmX 10萬=30mg。③檢測控制線C線上羊抗鼠IgG 羊抗鼠IgG 的總量lmg/ml X 2. O μ 1/cmX O. 3cmX 10 萬=60mg。④用于結合墊的葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物所需單克隆抗體的總量0.01mg/mlX20y 1父10萬=20mg2.纖維膜上的C(質控線)、T(檢測線)的噴制將上述制備好的硝酸纖維膜分別噴制60ml抗細菌脂多糖或者脂溶性蛋白單克隆抗體，濃度為O. 5mg/ml,2.0y Ι/cm噴射于硝酸纖維膜T線的位置。然后同時將60ml羊抗鼠IgG，濃度為lmg/ml，2. O μ 1/cm噴射于硝酸纖維膜C線的位置。3、標記物結合墊，樣品墊的組裝將實施例2制備好的結合墊組裝到上述硝酸纖維膜上結合墊的位置(此時硝酸纖維膜已噴射有C線，T線)。最后，同樣原理，將樣品墊組裝到試紙條中樣品墊的位置。4、分切及成品組裝樣品吸收墊、結合墊、包被有檢測線和質控線的硝酸纖維膜、吸水墊，首尾相互銜接，優化銜接條件，按順序固定于不干膠底板上；用切割機按一定規格切成條，組裝試紙條， 如圖2所示。實施例4油樣品的預處理清洗I支分液漏斗并檢查氣密性，放入烘干箱烘干備用。加標本地溝油20ml+內毒素檢測用水(LAL)20ml。振蕩混勻后，放入80°C烘干箱內加熱。每隔lOmin，進行振蕩混勻，再放入烘干箱內靜置實現油水分離。反復這樣約Ih后，將分液漏斗取出，打開閥門，收集水相部分液體，進行內毒素檢測。實施例5有益效果檢驗I、地溝油特異性檢測模擬地溝油的制備將300ml潲水置于燒杯中，加熱至50°C 5分鐘，然后沉淀，取上層油樣；將油樣放置70°C水浴中，加入10 50mL質量百分比5%食鹽水進行洗滌，去水層，再洗滌，直至沒有膠狀物出現為止；將洗滌后的油升溫至105 110°C，攪拌脫水I 2 小時，直至液面無水汽和氣泡。最后收集到約3ml地溝油。制備的地溝油用實施例4的方法進行處理后，滴加到本發明的免疫熒光試紙上，利用便攜式熒光檢測儀(ESE-Quant FLU0， QIAGEN公司產品)進行檢測，特異性試驗結果表明反應呈陽性。然后選用不同種類合格食用油按照上述方法進行檢測，所選用的合格食用油均購自超市，具體見表I :表I
權利要求
1.一種檢測地溝油的方法，其特征在于是以細菌脂多糖抗體和/或脂溶性蛋白抗體作為抗體進行檢測。
2.根據權利要求I所述的所述的檢測地溝油的方法，其特征在于包含以下步驟待檢樣品與抗體A反應后，加入葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物繼續反應，通過檢測熒光的裝置進行檢測，從而確定待檢樣品中是否含有地溝油；所述的抗體A為細菌脂多糖單克隆抗體或細菌脂溶性蛋白單克隆抗體中的一種或兩種；所述的抗體B為同樣為細菌脂多糖單克隆抗體或細菌脂溶性蛋白單克隆抗體中的一種或兩種；所述的抗體A與所述的抗體B是相同的蛋白或是不同的蛋白。
3.根據權利要求2所述的所述的檢測地溝油的方法，其特征在于包含以下步驟所述的抗體A為通過名稱為雜交瘤細胞株gzcdc-ETXOOl的單克隆細胞株制備得到，該單克隆細胞株于2011年12月4日保藏位于中國湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO C2011111 ；所述的抗體B為通過名稱為雜交瘤細胞株gzcdc-ETXOOl的單克隆細胞株制備得到，該單克隆細胞株于2011年12月4日保藏位于中國湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO C2011111o
4.根據權利要求2所述的所述的檢測地溝油的方法，其特征在于包含以下步驟所述的葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物通過以下步驟制備得到(1)將熒光素分子與以親水鏈為骨架的葡聚糖分子反應，得到結合熒光素的葡聚糖分子;(2)將結合熒光素的葡聚糖分子與抗體B反應,純化,得到葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物。
5.根據權利要求4所述的所述的檢測地溝油的方法，其特征在于包含以下步驟所述的葡聚糖為分子量20，000 30，000的葡聚糖；所述的熒光素為異硫氰酸熒光素；所述的純化為通過凝膠層析法進行分離純化。
6.根據權利要求4所述的所述的檢測地溝油的方法，其特征在于包含以下步驟所述的葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物通過以下步驟制備得到(1)結合熒光素的葡聚糖分子的制備用有機溶劑溶解熒光素，在磁力攪拌條件下，滴加在含葡聚糖的醋酸溶液中，避光反應，使得熒光素上的碳原子與葡聚糖上的二乙烯砜反應以便進行標記偶聯；反應結束后，將PH值調至8. 8 9. 2，離心，取沉淀，得到結合熒光素的葡聚糖分子；其中，熒光素和葡聚糖按質量比I : 8 10進行配比；(2)葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物初產物的制備洗滌步驟⑴得到的沉淀，再用醋酸溶液溶解沉淀，接著將PH值調節為4. 8 5. 2 ;在磁力攪拌條件下，滴加入抗體B溶液，反應，得到葡聚糖、抗體B和熒光素混合標記物初產物；抗體B的用量按Img熒光素加入 IOmg免疫球蛋白計算；(3)葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物的制備使用葡聚糖凝膠裝柱，用pH值6.8 7.2,0. 002 O. OlM的磷酸緩沖液平衡；將步驟(2)得到的葡聚糖、抗體B和熒光素混合標記物初產物上樣，再用pH值6. 8 7. 2、O. 002 O. OlM的磷酸緩沖液洗脫，當黃綠色熒光出現在洗脫液時，收集全部黃綠色熒光溶液；將黃綠色熒光溶液透析，得到葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物。
7.根據權利要求6所述的所述的檢測地溝油的方法，其特征在于步驟(I)中所述的有機溶劑為無水乙醇；步驟(I)中所述的熒光素為異硫氰酸熒光素；步驟(I)中所述的熒光素溶解于有機溶劑的濃度為I 2mg/ml ；步驟(I)中所述的葡聚糖為分子量20，000 30，000的葡聚糖；步驟(I)中所述的含葡聚糖的醋酸溶液中葡聚糖的濃度為5 10mg/ml ;醋酸的濃度為 O. 2 O. 5mol/L ；步驟(I)中所述的反應的時間為2 6小時；步驟(I)中所述的PH通過氫氧化鈉進行調節；步驟⑴中所述的PH為9;步驟(I)中所述的離心的條件為8000 IOOOOrpm離心5 10分鐘；步驟(2)中所述的洗滌為使用蒸餾水進行洗滌，洗滌至液體為無色為止；步驟(2)中所述的醋酸溶液的濃度為質量百分比I 5% ;步驟⑵中所述的醋酸溶液的用量為按溶解熒光素的濃度I 2mg/ml計算用量； 步驟(2)中所述的pH通過氫氧化鈉進行調節；步驟⑵中所述的抗體B溶液的濃度為15 25mg/mL ；步驟⑵中所述的反應的時間為15 25分鐘；步驟(3)中所述的葡聚糖凝膠為Sephadex_G50凝膠；步驟(3)中所述的洗脫的速度為lml/min ；步驟(3)中所述的透析的條件為使用截留分子量I萬的透析袋和O. 01mol/L、pH7. 9 8.I的磷酸鹽緩沖液,O 4°C透析過夜。
8.實現權利要求I 7任一項所述的檢測地溝油的方法的試紙條，其特征在于包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結合墊、層析膜和吸水墊；其中，結合墊包被有葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物；層析膜上具有一條檢測帶和一條質控帶，檢測帶上固定有抗體A，質控帶固定有能與葡聚糖-熒光素標記的抗體B特異結合的抗抗體；檢測帶靠近結合墊，質控帶靠近吸水墊；所述的抗體A為細菌脂多糖單克隆抗體或細菌脂溶性蛋白單克隆抗體中的一種或兩種；所述的抗體B為同樣為細菌脂多糖單克隆抗體或細菌脂溶性蛋白單克隆抗體中的一種或兩種；所述的抗體A與所述的抗體B是相同的蛋白或是不同的蛋白。
9.根據權利要求8所述的試紙條，其特征在于所述的抗體A為通過名稱為雜交瘤細胞株gzcdc-ETXOOl的單克隆細胞株制備得到，該單克隆細胞株于2011年12月4日保藏位于中國湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO C2011111 ；所述的抗體B為通過名稱為雜交瘤細胞株gzcdc-ETXOOl的單克隆細胞株制備得到，該單克隆細胞株于2011年12月4日保藏位于中國湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO C2011111 ；所述的抗抗體為羊抗鼠IgG抗體；所述的結合墊為玻璃纖維膜或聚酯膜；所述的層析膜為硝酸纖維素膜。
10.根據權利要求8所述的試紙條的制備方法，其特征在于包含以下步驟(1)用稀釋液將葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物稀釋到以抗體B計算，濃度為O.01 O. 03mg/ml，然后將結合墊浸泡在稀釋液中2 5分鐘，經過烘干或者真空冷凍干燥后，再裝配到試紙條底板上；稀釋液的組成為pH7. 4,0. OlM的PBS緩沖液中加入NaN3和 BSA, NaN3的終濃度為質量百分比O. 1%,BSA的終濃度為質量百分比1% ；(2)在層析膜上設置兩條帶，一條檢測帶和一條質控帶；檢測帶上固定有抗體A;質控帶固定有能與葡聚糖-熒光素標記的抗體B特異結合的抗抗體；(3)在步驟(2)的層析膜的一側貼上樣品吸收墊和結合墊，另一側貼上吸水墊；樣品吸收墊、結合墊、層析膜的檢測帶、層析膜的質控帶和吸水墊依次排布；利用切割機進行試紙條的切割，得到試紙條。
全文摘要
本發明公開一種檢測地溝油的方法及試紙與應用。該方法以細菌脂多糖抗體和/或脂溶性蛋白抗體作為抗體進行檢測。具體為通過雜交瘤細胞株gzcdc-ETX001制備得到的抗體為抗體A和抗體B；將熒光素分子與葡聚糖分子反應，得到結合熒光素的葡聚糖分子，再將其與抗體B反應，純化，得到葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物；將待檢樣品與抗體A反應后，加入葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物繼續反應，通過檢測熒光的裝置檢測，從而確定待檢樣品中是否含有地溝油。實現該方法的試紙中的結合墊包被有葡聚糖-抗體B-熒光素混合標記物；層析膜上的檢測帶固定有抗體A，質控帶固定有能與葡聚糖-熒光素標記的抗體B特異結合的抗抗體。該試紙條靈敏，易于使用。
文檔編號G01N33/577GK102590514SQ201210005898
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者侯水平, 姬澤薇, 李軍濤, 楊智聰, 陳守義 申請人:廣州市疾病預防控制中心