專利名稱：用于預(yù)測肺腺癌生存時間的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測肺腺癌生存時間功能的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肺癌是世界范圍內(nèi)常見的癌癥且是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因之一。在我國肺癌發(fā)病率和死亡率高居各惡性腫瘤之首。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際腫瘤研究所(TheInternational Agency for Research on Cancer, IARC)統(tǒng)計，我國 2008 年肺癌發(fā)病率為35/10萬人，并且該機(jī)構(gòu)估計至2025年，我國將每年新增肺癌100萬例。根據(jù)衛(wèi)生部2010年衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒，截止2009年，全國肺癌死亡率為30. 83/10萬人，高于第二高死亡率的肝癌逾4/10萬人。肺癌一般分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)兩種組織學(xué)類型。非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌病例數(shù)的85%，并進(jìn)一步分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌等。在過去的30年中，我國肺癌組織學(xué)類型發(fā)生改變，自1970年起，腺癌發(fā)病率快速增長，并逐步取代鱗癌，成為我國肺癌最常見類型。患者在確診肺癌時，超過半數(shù)的人已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，其中僅15%的患者生存時間大于或等于5年，盡管肺癌的5年生存率只有15%，但僅占16%的早期診斷為肺癌的患者其5年生存率可達(dá)到49%。目前的影像學(xué)和病理學(xué)的技術(shù)和方法，多運(yùn)用于篩查和確診肺癌，盡管具有一定敏感性，但對降低肺癌患者病死率的作用不大；而發(fā)展特異性細(xì)胞因子標(biāo)志物作為預(yù)測肺腺癌患者生存時間的方法，可以有效地篩選出治療肺癌的生物學(xué)靶點，同時為臨床醫(yī)生提供一項治療效果的客觀指標(biāo)。因此，探索具有預(yù)測生存周期價值的新型簡易生物標(biāo)記物不僅有益于提高肺癌患者的治療效果和生存周期，還會帶來巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于預(yù)測肺腺癌生存時間的試劑盒。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)測肺腺癌生存時間的試劑盒，其特征在于，由細(xì)胞因子及其酶標(biāo)抗體，PH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液，pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，血清蛋白稀釋液，終止液，四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，正常人血清和陽性對照血清組成；其中，所述的細(xì)胞因子為包括趨化因子配體28，皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子，人生長調(diào)節(jié)致癌基因，白介素-29，可與糖蛋白D競爭皰疹病毒進(jìn)入T細(xì)胞位點的TNF樣誘導(dǎo)蛋白，單核細(xì)胞趨化因子-4，巨噬細(xì)胞刺激蛋白a，胸腺表達(dá)趨化因子在內(nèi)的8種細(xì)胞因子。優(yōu)選地，所述pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液為將I. 59克碳酸鈉和2. 93克碳酸氫鈉加至IL蒸餾水中而得。優(yōu)選地，所述pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液為將0. 2克磷酸二氫鉀，2. 9克十二水合磷酸氫二鈉，8. 0克氯化鈉，0. 2克氯化鉀，0. 5mL吐溫-20加至IL蒸餾水中而得。優(yōu)選地，所述的血清蛋白稀釋液為將0. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液而得。優(yōu)選地，所述的終止液為2M硫酸溶液。優(yōu)選地，所述的四甲基聯(lián)苯胺底物溶液為將0. 5mL溶液濃度為10mg/5mL的四甲基聯(lián)苯胺的無水乙醇溶液，IOmL pH值為5. 0的底物緩沖液與32uL體積濃度為0. 75vol %的過氧化氫水溶液混合而得；其中，所述pH值為5.0的底物緩沖 液為含0.2M磷酸氫二鈉和0. IM檸檬酸的蒸餾水溶液。本發(fā)明的優(yōu)點是I、本發(fā)明首次提出包括趨化因子、炎癥相關(guān)因子，以及免疫細(xì)胞因子等多種細(xì)胞因子類別在內(nèi)的8種細(xì)胞因子或與其它臨床指標(biāo)組合可成為預(yù)測肺腺癌生存時間的主要指標(biāo)。2、包括趨化因子、炎癥相關(guān)因子，以及免疫細(xì)胞因子等多種細(xì)胞因子類別在內(nèi)的8種細(xì)胞因子作為預(yù)測生存時間指標(biāo)較目前用于診斷肺腺癌的影像學(xué)和病理學(xué)技術(shù)及其它臨床指標(biāo)更為客觀，而且測定此類蛋白表達(dá)水平簡單易行可靠。
具體實施例方式為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以優(yōu)選實施例，作詳細(xì)說明如下。實施例一種用于預(yù)測肺腺癌生存時間的試劑盒，由細(xì)胞因子及其酶標(biāo)抗體，pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液，PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，血清蛋白稀釋液，終止液，四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，正常人血清和陽性對照血清組成；其中，所述的細(xì)胞因子為包括趨化因子配體28，皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子，人生長調(diào)節(jié)致癌基因，白介素-29，可與糖蛋白D競爭皰疹病毒進(jìn)入T細(xì)胞位點的TNF樣誘導(dǎo)蛋白，單核細(xì)胞趨化因子-4，巨噬細(xì)胞刺激蛋白a，胸腺表達(dá)趨化因子在內(nèi)的8種細(xì)胞因子。所述pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液為將I. 59克碳酸鈉和2. 93克碳酸氫鈉加至IL蒸餾水中而得。所述PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液為將0. 2克磷酸二氫鉀，2. 9克十二水合磷酸氫二鈉，8. 0克氯化鈉，0. 2克氯化鉀，0. 5mL吐溫-20加至IL蒸餾水中而得。所述的血清蛋白稀釋液為將0. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液而得。所述的終止液為2M硫酸溶液。所述的四甲基聯(lián)苯胺底物溶液為將0. 5mL溶液濃度為10mg/5mL的四甲基聯(lián)苯胺的無水乙醇溶液，IOmL pH值為5. 0的底物緩沖液與32uL體積濃度為0. 75V01%的過氧化氫水溶液混合而得，所述pH值為5. 0的底物緩沖液為含0. 2M磷酸氫二鈉和0. IM檸檬酸的蒸餾水溶液。上述試劑盒的使用方法如下I、包被用0. 05M pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液將細(xì)胞因子稀釋至蛋白質(zhì)含量為l-10ug/mL。在每個聚苯乙烯的反應(yīng)孔中加0. ImL,于4°C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液洗3次，每次3分鐘。2、加樣分別加一定血清蛋白稀釋液稀釋后的待檢樣品、正常人血清和陽性對照血清0. ImL至上述已包被的反應(yīng)孔中，置37°C孵育I小時后用pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液洗3次，每次3分鐘。
3、加辣根過氧化物酶標(biāo)抗體在各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)抗體0. ImL, 37°C孵育0. 5-1小時后用pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液洗3次，每次3分鐘。4、加底物液顯色在各反應(yīng)孔中加入四甲基聯(lián)苯胺底物溶液0. lmL，37°C下孵育10-30分鐘。5、終止反應(yīng)在各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0. 05mL。6、結(jié)果判定在ELISA檢測儀上，于450nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值。若大于規(guī)定的陰性對照OD值2. I倍，即為陽性。
以正常對照品蛋白表達(dá)水平作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，肺腺癌患者血清蛋白譜表達(dá)量除以此標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合生存時間的信息，從而確定患者血清蛋白譜中與生存時間相關(guān)的細(xì)胞因子。其中，大于或等于2. 4為增高，小于2. 4為降低。本發(fā)明通過收集經(jīng)過臨床病理診斷確診為肺癌的有482例患者，再根據(jù)病理類型區(qū)分，確定為肺腺癌的患者276例，通過隨機(jī)化方法抽樣了 29例肺腺癌患者血清，并完成為期2年的生存時間隨訪。同時在992名健康志愿者的血清庫中，通過隨機(jī)化方法抽樣了 14例正常人血清。應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測血清內(nèi)40種細(xì)胞因子，采用Stepwise多因素回歸分析及Kaplan-Meier生存分析,篩選肺腺癌患者血清蛋白譜中與生存時間相關(guān)的細(xì)胞因子(P < 0. 05)。最終確定肺腺癌患者血清蛋白譜中有8種細(xì)胞因子表達(dá)與生存時間存在相關(guān)型，包括4種細(xì)胞因子正相關(guān)和4種細(xì)胞因子負(fù)相關(guān)(如表I所示)。表I多種細(xì)胞因子在肺腺癌患者與正常人血清中與生存時間的相關(guān)性

權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)測肺腺癌生存時間的試劑盒，其特征在于，由細(xì)胞因子及其酶標(biāo)抗體，PH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液，pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，血清蛋白稀釋液，終止液，四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，正常人血清和陽性對照血清組成； 其中，所述的細(xì)胞因子為包括趨化因子配體28，皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子，人生長調(diào)節(jié)致癌基因，白介素-29，可與糖蛋白D競爭皰疹病毒進(jìn)入T細(xì)胞位點的TNF樣誘導(dǎo)蛋白，單核細(xì)胞趨化因子-4，巨噬細(xì)胞刺激蛋白a，胸腺表達(dá)趨化因子在內(nèi)的8種細(xì)胞因子。
2.如權(quán)利要求I所述的用于預(yù)測肺腺癌生存時間的試劑盒，其特征在于，所述PH值為9.6的碳酸鹽緩沖液為將I. 59克碳酸鈉和2. 93克碳酸氫鈉加至IL蒸餾水中而得。
3.如權(quán)利要求I所述的用于預(yù)測肺腺癌生存時間的試劑盒，其特征在于，所述PH值為7.4的磷酸鹽緩沖液為將0. 2克磷酸二氫鉀，2. 9克十二水合磷酸氫二鈉，8. O克氯化鈉，0. 2克氯化鉀，0. 5mL吐溫-20加至IL蒸餾水中而得。
4.如權(quán)利要求I所述的用于預(yù)測肺腺癌生存時間的試劑盒，其特征在于，所述的血清蛋白稀釋液為將0. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液而得。
5.如權(quán)利要求I所述的用于預(yù)測肺腺癌生存時間的試劑盒，其特征在于，所述的終止液為2M硫酸溶液。
6.如權(quán)利要求I所述的用于預(yù)測肺腺癌生存時間的試劑盒，其特征在于，所述的四甲基聯(lián)苯胺底物溶液為將0. 5mL溶液濃度為10mg/5mL的四甲基聯(lián)苯胺的無水乙醇溶液，IOmLPH值為5. 0的底物緩沖液與32uL體積濃度為0. 75V01%的過氧化氫水溶液混合而得； 其中，所述pH值為5. 0的底物緩沖液為含0. 2M磷酸氫二鈉和0. IM檸檬酸的蒸餾水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于預(yù)測肺腺癌生存時間功能的試劑盒，其特征在于，由細(xì)胞因子及其酶標(biāo)抗體，pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液，pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，血清蛋白稀釋液，終止液，四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，正常人血清和陽性對照血清組成；所述的細(xì)胞因子為包括趨化因子，炎癥相關(guān)因子，免疫細(xì)胞因子等多種細(xì)胞因子類別在內(nèi)的8種細(xì)胞因子。本發(fā)明可協(xié)助預(yù)測肺腺癌生存周期。
文檔編號G01N33/574GK102749449SQ20121026430
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者楊達(dá)偉, 王向東, 白春學(xué) 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院