專利名稱：一種抗體及其應用、制備方法
技術領域：
本發明涉及人白介素-23受體胞外區結構域(hIL-23R-CHR)的特異性單克隆抗體及其用途，本發明還涉及產生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞株9H3保藏號=CCTCCC201240。
背景技術：
免疫系統的功能在于保護個體免受細菌、多細胞有機體和病毒等感染原及癌癥的損害。這種系統包括若干類型的淋巴細胞和骨髓細胞單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)、嗜酸性粒細胞、T細胞、B細胞及中性粒細胞。這些淋巴細胞和髓系細胞通常產生稱為細胞因子的信號蛋白(肽)。免疫反應包括炎癥，即，免疫細胞在全身或在身體特定部位積聚。當感染原或外來物質入侵時，刺激免疫細胞分泌細胞因子，細胞因子繼而調節免疫細胞的增殖、發育、分化或遷移。當免疫反應涉及過量的炎癥因子時，它可能產生病理后果。hIL-23 與 hIL_23R 的關系人白介素-12(hIL_12)是由p35和p40兩個亞基組成的異二聚體細胞因子，主要由單核巨噬細胞(ΜΦ)和樹突狀細胞(DC)產生。hIL-12具有促進分化的CD4+T輔助細胞I(Thl)增殖，促進細胞毒性T細胞(CTL)的形成，提高NK細胞的細胞毒性，誘導T細胞和NK細胞產生INF-Y、TNF-a和IL-6等細胞因子，這些免疫細胞因子的過表達跟銀屑病、克羅恩病(CD)、炎癥性腸病(IBD)和風濕性關節炎(RA)等自身免疫疾病密切相關。而人白介素23 (hIL-23)則是近期發現的類似于hIL-12的促炎癥細胞因子，屬于IL-12家族，由單獨的pl9亞單位和hIL-12的p40亞單位組成。hIL_23主要由活化的DCs、ΜΦ以及記憶性T細胞和NK細胞分泌。hIL-23在ThO向Thl7細胞分化的起始及維持Thl7分化、發育中起關鍵性作用。hIL-23能促進T細胞尤其是CD4+T細胞增殖，促進T細胞、抗原遞呈細胞(APC)產生IFN- Y與IL-12，并對DC的共刺激功能起調節作用。近來的研究揭示hIL_23在銀屑病、⑶、IBD和RA等自身免疫性疾病發病機制中較hIL-12處于更重要的地位。因此，hIL_23和hIL-12拮抗劑研究與開發已成為相關疾病新藥創制的焦點。hIL-23的受體是由hIL_12 0 I與hIL_23R共同組成的受體復合物。除了 hIL_12R的共有亞基hIL-12Ri3 1，pl9亞基特異性受體hIL_23R是造血因子受體超家族的一個新成員。hIL-23R包含一個細胞外區域、一個單跨膜區域和一個有252個氨基酸的胞質區域。其胞外區不同于其他造血因子受體超家族成員的三個膜纖維蛋白連接，而是由一個信號序列、一個N端免疫球蛋白樣結構域和2個細胞因子受體區域組成。hIL-23與hIL-12共用Jak-stat 信號分子，如 Jak2、Tyk2、STATl、STAT3、STAT4 和 STAT5，而 hIL_23R 主要是運用Jak2和STAT3信號分子。hIL-23R 與 IL-17 的關系IL-17通常指的是IL-17A，屬于IL-17家族，主要由Thl7產生。Thl7是最近研究發現的一類不同于Thl和Th2的⑶4+T細胞亞群。目前Thl7的調控機制仍不十分清楚，對于Thl7分化過程的研究提出兩種模型一種認為，Thl和Thl7的早期分化階段是一致的，后期分化不同是由于hIL-12和hIL-23選擇性的作用于同時表達hIL_12R/hIL_23R的“前Thl細胞”;另一個模型認為，Thl和Thl7代表的是完全不同的細胞系，從一開始的分化過程就不同。后來證實的確存在與Thl無關的Thl7分化途徑。TGF-β和IL-6是Thl7分化的啟動者，hIL-23是Thl7的活化和維持者。hIL-23在Thl7細胞分化過程中具體的作用機制被認為與STAT-3有關，因為hIL-23可以介導STAT-3的磷酸化過程，使STAT-3激活從而促進IL-17的分泌。故hIL-23R對Thl7細胞亞群來說是一個關鍵的作用因子。hIL23/hIL23R_Thl7/IL17軸在自身免疫性疾病中的致病性也已被證實。減少被鼠白介素-23(mIL-23)刺激的IL-17的產生就可以減少EAE在小鼠模型中的發生，同時運用IL-17的抗體可以提供部分的保護作用。更進一步的研究表明，重組基因mIL-23pl9能夠加劇小鼠的結腸炎，相反抗mIL-23pl9抗體的治療就能夠改善EAE。因此Thl7細胞在炎癥免疫性疾病中具有重要作用，可以作為一個新的藥物作用靶分子。hIL_23R與自身免疫性疾病的關系研究表明，hIL_23R與由hIL-23/IL_17通路引起的炎癥免疫性疾病密切相關。銀屑病是一個常見的、慢性的T細胞介導的炎癥性皮膚疾病。研究發現銀屑病患者在皮膚損害處hIL-23pl9和p40mRNA的水平顯著增高。Ann Begovich等人的相關研究亦證實hIL-23R遺傳變異體與銀屑病緊密相關。另外，mIL-23高表達的轉基因小鼠模型進一步證實hIL-23/hIL-23R通路在銀屑病病理學形成過程中發揮中軸作用。上述研究結果提示hIL-23/hIL-23R通路可能是銀屑病一個重要的干預治療靶向。強直性脊柱炎(AS)是最常見的炎癥性關節炎之一。研究發現在hIL_23R基因上多個SNP與AS密切相關。Fraser Cummings JR等研究亦發現IL-23R基因上多個SNPs均跟克羅恩氏病顯著相關。而Buing等人則進一步驗證位于hIL-23R上的SNPrsl 1209026 (Arg381Gln)對于炎癥性腸病來說是一個保護性的標志。這些研究結果表明hIL-23R/Thl7通路可能參與AS進程。近來研究中，通過P40敲除小鼠證明阻斷hIL-23和hIL_12可以有效治療許多的炎性及自身免疫性疾病。但是當通過P40亞基阻斷hIL-12時會增加機體對微生物感染的敏感性。hIL-23pl9/hIL_23R在自身免疫性疾病的發病以及抗腫瘤、抗感染和移植排斥等方面發揮積極的作用。人白介素-23受體胞外區結構域(hIL-23R-CHR，GenBank CAH70406. I其中第124-313位氨基酸為目的序列)屬于人白介素-23受體(hIL_23R)胞外區，是與hIL-23結合的有效功能區(Parham C，Chirica M，Timans J等(2002) JImmunol 168 (11) :5699-5708)。阻斷 hIL_23R_CHR 對于阻斷 hIL_23pl9/hIL_23R，治療關節炎、炎性腸病、系統性紅斑狼瘡、銀屑病、多發性硬化或哮喘都有重要的意義，有望成為hIL-23/IL-17介導的炎性及自身免疫性疾病治療的有效靶點。本發明單克隆抗體是針對hIL-23R-CHR，可以封閉天然的hIL_23R的功能，進而可以防治由hIL23/hIL23R_Thl7/IL17軸介導的炎性及自身免疫性疾病。

發明內容
一種抗體，其特征在于其包括氨基酸序列具有SEQ ID NO :7_12中任意一種以上所示的序列或其變異體、同源物或衍生物。
所述的抗體包括重鏈可變結構域Vh和輕鏈可變結構域 '，其中c)重鏈可變結構域Vh依次包含高變區⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3，所述⑶RHl的氨基酸序列為SEQ ID NO 7 ;所述CDRH2的氨基酸序列為SEQ ID NO 8 ;所述CDRH3的氨基酸序列為 SEQ ID NO 9 ；d)輕鏈可變結構域Vl依次包含高變區⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3，所述⑶RLl的氨基酸序列為SEQ ID NO 10 ;所述CDRL2的氨基酸序列為SEQ ID NO 1 ;所述CDRL3的氨基酸序列為 SEQ ID NO 12o所述的抗體為小鼠雜交瘤細胞株9Η3保藏號為CCTCC NO C201240產生單克隆抗體，其抗體氨基酸序列為SEQ ID NO 130上述任意一種抗體在治療由hIL-23介導的炎性或免疫性疾病藥物中的應用。所述的免疫性疾病為關節炎、炎性腸病、系統性紅斑狼瘡、銀屑病、多發性硬化或哮喘。所述的關節炎是類風濕性關節炎。所述的炎性腸病是克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎。上述的抗體用于hIL_23R的檢測方法，其特征在于檢測方法中應用標記物結合的單克隆抗體，其中標記物包括酶標記物、突光標記物、膠體金標記物或放射性標記物。保藏信息雜交瘤細胞株9H3，保藏單位為中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號=CCTCC NO :C201240，保藏時間為2012年3月29日。注本發明涉及雜交瘤細胞株9H3，系細胞株，無分類名和拉丁名。有益效果本發明獲得一株穩定分泌抗hIL-23R_CHR特異性抗體的雜交瘤細胞株9H3 (保藏編號CCTCC C201240)，其分泌的單克隆抗體明顯抑制Thl7分化免疫排斥模型中IL-17A的分泌，并體內實驗顯示該單抗可以有效改善EAE小鼠、膠原誘發關節炎(CIA)小鼠及IBD樣HLA-B27大鼠癥狀的嚴重程度。體內體外實驗顯示，該單抗是治療hIL23/hIL23R-Thl7/IL17軸介導的炎性及自身免疫性疾病的潛在藥物。


圖I為單抗9H3SDS-PAGE分析。其中，泳道I為辛酸-硫酸銨沉淀單克隆抗體，泳道2為S印horose-200柱純化單克隆抗體。圖2為單抗9H3Western的結果。圖3為單抗9H3酶結合物S印hadex G200柱(2. 6cmX 100cm)層析洗脫曲線。圖4為單抗9H3細胞ELISA的結果。圖5為hIL-23刺激對脾淋巴細胞IL-17A分泌的影響。圖6為單抗9H3對hIL_23刺激脾淋巴細胞IL-17A分泌的影響。圖7為單抗9H3組與對照組EAE小鼠臨床評分。圖8為單抗9H3組與對照組HLA-B27大鼠臨床評分。圖9為單抗9H3組與對照組CIA小鼠臨床評分。圖10為單抗可變結構域測序報告。其中，第47-379位為單抗9H3重鏈可變結構域核苷酸序列；第425-757位為單抗9H3輕鏈可變結構域核苷酸序列。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
，進一步闡述本發明，這些實施例僅用于說明本發明而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下對本發明制備單克隆抗體及其制備方法的簡單改造，都屬于本發明要求保護的范圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、動物免疫hIL-23R-CHR蛋白(抗原制備方法及鑒定參照發明專利重組質粒pET32a-hIL-23R-CHR及其構建表達，專利申請號號:201110096271. 8，申請日期2011. 04. 18 ;核酸序列為SEQ ID NO 1 ;氨基酸序列為SEQ ID NO :2)，溶于生理鹽水，與弗氏完全佐劑等體積混合，經充分乳化后，接種于BALB/c小鼠(揚州大學比較醫學中心提供，SCXK (蘇)2007-0001)腹腔，10 μ ghIL_23R_CHR蛋白/200 μ L/只；于基礎免疫后，間隔兩周采用相同的抗原劑量與等體積弗氏不完全佐劑混合，進行加強免疫；于第二次加強免疫后一周，以間接ELISA法測定免疫小鼠抗血清效價。以正常鼠血清為陰性對照，以(測定孔A值-空白值)/(陰性對照孔A值-空白值)>2. I為判定標準，進行測定。小鼠抗血清終點效價均為I : 12，8000以上。選擇血清hIL-23R_CHR特異性抗體效價最高的小鼠用于細胞融合，并于融合前3天，腹腔接種20 μ ghIL-23R-CHR蛋白進行沖擊免疫。實施例2、單克隆抗體的制備I.細胞融合細胞融合采用聚乙二醇法無菌操作取如實施例I所述免疫的小鼠脾臟，制成細胞懸液，離心，細胞計數；將I X IO8脾細胞與2X107SP2/0細胞混合，IOOOrpm離心IOmin,棄上清液，將離心管置于37°C水浴中；取Iml預熱至40°C的50% PEG緩慢滴加到細胞沉淀上，以基礎培養基懸浮細胞；IOOOrpm離心lOmin，棄上清液，加HAT培養基重懸細胞，分裝于96孔細胞培養板，將培養板置于37°C、5%的CO2濕潤細胞培養箱中培養，5天后用新鮮HAT換出培養板孔中1/2培養基，10天后用HT培養基換出HAT。2.融合細胞的篩選及克隆化培養采用有限稀釋法克隆化雜交瘤細胞以hIL-23R_CHR蛋白作為篩選包被抗原，山羊抗小鼠IgM-HRP/IgG-HRP作為檢測抗體。陽性孔雜交瘤細胞經亞克隆一篩選一亞克隆一篩選一亞克隆一擴大培養。具體的，用小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合后，接種于96孔細胞板HAT選擇性培養基上。經三次亞克隆，建立了穩定分泌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為9H3，所分泌的單克隆抗體命名為9H3。本發明人于2012年3月29日將所述雜交瘤細胞株保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢，武漢大學)，其保藏號分別為CCTCC NO :C201240。3.單克隆抗體的生產及純化取10周齡雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射O. 5ml降植烷；一周后接種如上所述處于對數生長期的雜交瘤細胞5 X IO5個/只；7-10天后采集腹水,5000rpm離心15min,收集上清液；腹水經二氧化硅預處理后，以辛酸-硫酸銨沉淀法沉淀免疫球蛋白，最后通過Sephorose-200柱層析，獲得純化單抗，采用SDS-PAGE鑒定單抗純度。結果見附圖1，說明該純化方法對腹水中單抗的純化效果很好。該單克隆抗體送至南京思普金生物科技有限公司測序，結果見圖10.該單克隆抗體命名為單克隆抗體9H3，其氨基酸序列為SEQ ID NO 13 ；其中該單抗重鏈可變結構域Vh核苷酸序列為SEQ ID NO :3，氨基酸序列為SEQ ID N0:4，重鏈可變結構域Vh依次包含高變區⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3，所述⑶RHl的氨基酸序列為SEQID NO 7 ;所述CDRH2的氨基酸序列為SEQ ID NO 8 ;所述CDRH3的氨基酸序列SEQ ID NO 9。輕鏈可變結構域'核苷酸序列為SEQ ID NO :5，氨基酸序列為SEQ ID NO :6，輕鏈可變結構域\依次包含高變區CDRL1、CDRL2和CDRL3，所述CDRLl的氨基酸序列為SEQ ID NO 10 ;所述CDRL2的氨基酸序列為SEQ ID NO 11 ;所述CDRL3的氨基酸序列SEQ IDNO :12。實施例3、單克隆抗體的特性鑒定I.抗體亞類的鑒定采用小鼠單克隆抗體獨特型分型試劑盒(IS02-1KT, sigma-aIdrich)鑒定單克隆抗體的亞類。結果雜交瘤細胞株9H3CCTCC C201240分泌的單克隆抗體的重鏈為IgG1，輕鏈為Kappa型。2.單克隆抗體親和力測定采用間接ELISA法測定單抗親和常數。測定實施例2中所獲得純化的單抗蛋白濃度，取一定濃度的純化被檢單抗，按間接ELISA法測定。結果9H3的親和常數為I. 03 X IO9 · 親和力較高。3. Western雜交檢測抗體特異性hIL-23R-CHR 與 5XSDS 上樣緩沖液混勻，100°C煮沸 3_5min，進行 SDS-PAGE 電泳。電泳后取下膠，裁剪合適的PVDF膜和濾紙。常溫轉膜1.5h。轉膜后用3% BSA封閉2h。用純化的單克隆抗體孵育過夜。次日用O. 05% Tween-TBS清洗，加HRP標記的山羊抗小鼠二抗，隨后用ECL顯色。如圖2所示，單克隆抗體9H3與hIL-23R_CHR蛋白呈特異性顯色。實施例4、酶標抗體的制備參照劉秀梵主編，單克隆抗體在農業上的應用，第一版，安徽科學技術出版社，1994,61-62中所述方法，對腹水單抗9H3進行辣根過氧化物酶(HRP)標記；將標記物經Sephadex G200凝膠層析純化,分部收集,合并第一峰。Sephadex G200凝膠層析結果見圖3，酶標單抗質量鑒定結果見表I。表I單抗9H3的辣根過氧化物酶標記物(9H3-HRP)的質量鑒定
權利要求
1.一種抗體，其特征在于其包括氨基酸序列具有SEQ ID NO :7-12中任意一種以上所示的序列或其變異體、同源物或衍生物。
2.根據權利要求I所述的抗體，其特征在于所述的抗體包括重鏈可變結構域Vh和輕鏈可變結構域'，其中 a)重鏈可變結構域Vh依次包含高變區⑶RH1XDRH2和⑶RH3，所述⑶RHl的氨基酸序列為SEQ ID NO 7 ;所述CDRH2的氨基酸序列為SEQ ID NO 8 ;所述CDRH3的氨基酸序列為SEQ ID NO 9 ； b)輕鏈可變結構域Vl依次包含高變區⑶RL1XDRL2和⑶RL3，所述⑶RLl的氨基酸序列為SEQ ID NO 10 ;所述0)1^2的氨基酸序列為SEQ ID NO 11 ;所述0)1^3的氨基酸序列為 SEQ ID NO 12o
3.根據權利要求2所述的抗體，其特征在于所述的抗體為小鼠雜交瘤細胞株9Η3保藏號為CCTCC NO C201240產生單克隆抗體，其抗體氨基酸序列為SEQ ID NO :13。
4.一種制備權利要求1-3任意一種抗體在治療由hIL-23介導的炎性或免疫性疾病藥物中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征所述的免疫性疾病為關節炎、炎性腸病、系統性紅斑狼瘡、銀屑病、多發性硬化或哮喘。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述的關節炎是類風濕性關節炎。
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述的炎性腸病是克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎。
8.根據權利要求1-3所述的抗體用于hIL-23R的檢測方法，其特征在于檢測方法中應用標記物結合的單克隆抗體，其中標記物包括酶標記物、突光標記物、膠體金標記物或放射性標記物。
全文摘要
本發明涉及一種人白介素-23受體胞外區結構域(hIL-23R-CHR)特異性單克隆抗體。本發明還涉及產生單克隆抗體的雜交瘤細胞株(保藏號CCTCC NOC201240)和單克隆抗體的制備方法。本發明另外還涉及hIL-23R-CHR單克隆抗體在治療炎性及免疫性疾病中的用途，所述炎性及免疫性疾病的特征是存在升高水平的hIL-17。
文檔編號G01N33/577GK102924599SQ20121034780
公開日2013年2月13日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年4月19日
發明者高向東, 趙虎, 賈國棟, 姚文兵, 郭薇 申請人:中國藥科大學