一種igf家族蛋白聯合檢測芯片的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種IGF家族蛋白聯合檢測芯片，該芯片包括：玻片，采用活性氨基丙基硅烷包被；多個微陣列，經芯片點陣將所述微陣列固定在所述玻片上；墊片，將各個微陣列分隔成不同的雜交區；其中，每個所述微陣列上含有對應于一種胰島素樣生長因子家族蛋白的一種特異性抗體；還包括以下反應試劑：用生物素標記的檢測抗體混合液；封閉液，采用5％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液；標準蛋白混合物；采用熒光染料HyLight555（激發波長550nm，發射波長566nm）標記的鏈霉親和素。本發明所述的IGF家族蛋白聯合檢測芯片能完成目前ELISA、免疫印跡法等傳統方法不能完成的多項檢測指標、高通量、高靈敏度的檢測，非常適合于針對IGF-1信號通路眾多目標蛋白多聯同時檢測。
【專利說明】—種IGF家族蛋白聯合檢測芯片
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學【技術領域】，涉及一種蛋白聯合檢測芯片，特別是涉及一種針對胰島素樣生長因子(IGF)家族蛋白的聯合檢測芯片。
【背景技術】
[0002]胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor, IGF)信號系統通過與細胞膜上的特異受體之間的相互作用在調節細胞增殖、分化和凋亡等方面扮演著重要的生理作用。IGF信號系統由以下三部分組成:配體(IGF-1、IGF-2和胰島素)、受體(IGF-1R、IGF-2R、胰島素受體(IR)、IGF-1R/IR雜合受體(HR)等)和六種IGF高親和性結合蛋白(IGFBP1-6)。其中，IGF-1和IGF-2在胎兒發育和出生后生活中通過內分泌、旁分泌和自分泌機制發揮重要的作用。IGF的有絲分裂，分化和抗凋亡特性是主要由IGF-1R來介導的。當IGF-1或IGF-2與受體結合時，IGF-1R可通過MEK/ERK或PI3K/Akt信號通路來分別促進細胞增殖或抑制細胞凋亡，因而增加致癌風險。在IGF家族的蛋白中，IGF-1、IGF-1R和IGF-2與癌癥形成是正相關的。與之相反，IGFBP是重要的代謝調控因子，這類蛋白通過與IGF的高親和性結合來抑制IGF的活性。在細胞表面，各種IGFBP競爭性地結合IGF，以阻遏IGF與IGF-1R的相互作用。
[0003]IGF信號系統在理論界和醫藥公司都深受關注。研究表明，IGF系統的失調被認為是包括糖尿病、心血管基部以及多種癌癥的關鍵因素。臨床研究的結果使人們關注IGF系統的復雜性。其中一個主要的復雜方面是:這些配體不是僅僅能高親和性地結合到它們系統自身的受體上，例如，IGF-1結合到IGF-1R上，它們還可以與其他受體以不同的親和性進行交互，例如，IGF-2可結合IGF-1R、IR和HR。血清IGF水平是由更高親和性的IGFBP來調控的。不同的IGFBP與IGF-1和IGF-2之間的相對親和性是不同的。除了與IGF結合的功能之外，IGFBP還進行其他不依賴于IGF的功能。
[0004]許多以IGF-1R作為靶向目標的藥物在動物實驗和臨床前期都有明顯的效果，但真正能用于臨床藥用的卻鳳毛麟角。其中的主要問題在于目前的實驗方法只是針對單一的IGF蛋白進行試驗，而缺乏對多種IGF家族蛋白所組成的系統的綜合研究。為了獲得藥物功效的完整了解，未來以IGF為標靶的抗癌藥物開發非常需要充分考慮IGF系統的所有復雜性.為了深入了解IGF信號通路的復雜性，需要同時檢測多個IGF家族蛋白。但是，目前的實驗方法和檢測芯片并不能滿足這一需求。
[0005]對于細胞因子和信號蛋白的定性檢測和定量檢測，目前常用的是的檢測方法主要包括:酶聯免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫印跡法(western blot)、流式細胞儀(Flow-Cytometry)等。酶聯免疫吸附法具有靈敏度高、特異性較好、操作簡便等優點，但一次試驗只能檢測單一指標，通量低、成本高。放射免疫分析雖然靈敏度高，是容易造成放射性污染。免疫印跡法能測定分子的大小，且無非特異的反應，但操作繁瑣，靈敏度低，且只能檢測單一指標。流式細胞儀能在細胞水平上檢測細胞因子的水平，但卻存在低靈敏、低通量、高成本等缺點。上述方法能用于檢測單個蛋白表達水平，但卻不適合IGF多蛋白系統 的檢測。

【發明內容】

[0006]針對現有技術的操作繁瑣、檢測指標單一、靈敏度低等不足，本發明的目的在于提供一種新型的針對胰島素樣生長因子(IGF)信號通路的蛋白聯合檢測芯片，以實現IGF家族蛋白的高通量、高靈敏度、高特異性和低成本檢測，具有廉價、便利、靈敏、準確、高通量、標本用量少、能在普通實驗室推廣和規模化等優點。
[0007]本發明所述的IGF家族蛋白聯合檢測芯片包括:玻片，采用活性氨基丙基硅烷包被；多個微陣列，經芯片點陣將所述微陣列固定在所述玻片上；墊片，將各個微陣列分隔成不同的雜交區；其中，每個所述微陣列上含有對應于一種胰島素樣生長因子家族蛋白的一種特異性抗體；還包括以下反應試劑:用生物素標記的抗體混合液；封閉液，采用5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液；標準蛋白混合物，包含若干種所述的胰島素樣生長因子家族蛋白混合物，以及不同濃度的用封閉液稀釋的標準蛋白混合物；采用熒光染料HyLight 555(激發波長550nm,發射波長566nm)標記的鏈霉未和素。
[0008]根據本發明所述的蛋白聯合檢測芯片的進一步特征，每個所述玻片上固定有16個獨立的微陣列，每個微陣列具有4個重復點樣的抗體點。
[0009]根據本發明所述的蛋白聯合檢測芯片的進一步特征，所述玻片上還包括固定有生物素標記的抗牛I gG抗體的陽性對照點。
[0010]根據本發明所述的蛋白聯合檢測芯片的進一步特征，所述特異性抗體包括針對如下胰島素樣生長因子家族蛋白的抗體:IGF-ι、IGF-1R、IGF-2、IGF-2R、IGFBP-U IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-6 和胰島素。
[0011]根據本發明所述的蛋白聯合檢測芯片的進一步特征，所述玻片在芯片點陣時，控制溫度為70-75F，濕度為40-45%，并在點陣后室溫靜置過夜。
[0012]根據本發明所述的蛋白聯合檢測芯片的進一步特征，所述玻片在芯片點陣后，通過以下步驟進行處理:用含5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液封閉，各個獨立的微陣列分別用細胞培養上清、人類血清、組織裂解液或者不同濃度的封閉液稀釋的標準蛋白混合物孵育過夜，洗滌去除不結合的蛋白，然后在各個微陣列中加入生物素標記的相應的抗體，孵育，洗滌，用熒光染料HyLight 555 (激發波長550nm，發射波長566nm)標記的鏈霉親和素室溫孵育，洗滌，干燥。
[0013]根據本發明所述的蛋白聯合檢測芯片的進一步特征，所述玻片在完成實驗操作后通過以下步驟來計算待測樣品中各種胰島素樣生長因子家族蛋白的濃度:用激光掃描儀在Cy3波長下掃描成像；用數據提取軟件找到各個微陣列點并輸出數碼讀數；用配套芯片處理軟件自動計算出待測樣品中各個蛋白的濃度.根據本發明所述的蛋白聯合檢測芯片的進一步特征，所述玻片的實驗操作通過以下步驟進行:用含5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液封閉，各個獨立的微陣列分別用待測樣品或者不同濃度的用封閉液稀釋的標準蛋白混合物孵育過夜，洗滌去除不結合的蛋白，然后在各個微陣列中加入生物素標記的抗體混合液，孵育，洗滌，再用熒光染料HyLight 555 (激發波長550nm,發射波長566nm)標記的鏈霉未和素室溫孵育，洗漆，干燥。
[0014]根據本發明所述的蛋白聯合檢測芯片的進一步特征，所述完成實驗操作的玻片通過以下步驟來計算待測樣品中各種胰島素樣生長因子家族蛋白的濃度:用激光掃描儀掃描成像；用數據提取軟件找到各個微陣列點并輸出數碼讀數；用配套芯片處理軟件自動計算出待測樣品中各個蛋白的濃度。
[0015]所述的待測樣品選自:細胞培養上清、人類血清、組織裂解液。
[0016]本發明所述的IGF家族蛋白聯合檢測芯片是經過優化設計的抗體芯片，能完成目前ELISA、免疫印跡法等傳統方法不能完成的多項檢測指標、高通量、高靈敏度的檢測，非常適合于針對IGF-1信號通路眾多目標蛋白多聯同時檢測，有利于更好的說明IGF-1家族成員在生物體內的相互關系和作用，為生物制藥公司更有效的藥物篩選提供重要的實驗工具。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1顯示IGF家族蛋白聯合檢測芯片的特異性。熒光染料標記的鏈霉親和素孵育后，用Genepix 4000B掃描得到每個芯片的特異信號。信號強度通過Genepix軟件解析，并顯示芯片的特異性。
[0018]圖2顯示IGF家族蛋白聯合檢測芯片的標準曲線。每個標準抗原在各自的濃度范圍內以3倍梯度稀釋，并與芯片孵育。使用IGF-1R專用的分析軟件分析數據和建立標準曲線(R2 > 0.97)。
[0019]圖3A和圖3B分別顯示IGF-2R (A)和IGFBP-2 (B)在癌癥組織(T)及其癌旁組織(P)樣本中差異表達。制備來自25例病人的肝癌組織及其癌旁組織裂解液，并與IGF信號抗體芯片孵育，然后對數據進行統計分析。IGF-2R和IGFBP-2在肝癌組織及其癌旁組織中的平均濃度具有顯著差異性，P〈0.05 (T檢驗)。
[0020]圖3C顯示了 IGF家族蛋白聯合檢測芯片的代表性數據。
[0021]圖4 A顯示使用Western blot實驗進一步檢測IGFBP-2的表達的代表性數據；圖4B顯示使用回歸分析檢測抗體芯片和Western blot的相關性；圖4C顯示抗體芯片和ELISA的相關性。
[0022]圖5顯示IGF-2R (A)和IGFBP-2 (B)在癌癥組織(T)及其癌旁組織(P)樣本中的正態分布。來自25例病人的肝癌組織及其癌旁組織裂解液被制備，并與IGF信號抗體芯片孵育，然后統計分析數據。
【具體實施方式】
[0023]為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0024]實施例一:本發明所述的IGF家族蛋白聯合檢測芯片的構建
為了開發本發明所述的IGF家族蛋白聯合檢測芯片，首先從供應商篩選現有抗體產品或通過自行開發合適的抗體對。然后將這些抗體對用于創建一個芯片以同時檢測IGF家族的10種蛋白質。
[0025]材料
所有抗體購買于R&D Systems公司(美國明尼蘇達州Minneapolis)或者由RayBiotech公司(美國佐治亞州Norcross)制備。IGF家族蛋白來自R&D公司或由RayBiotech公司制
【權利要求】
1.一種IGF家族蛋白聯合檢測芯片，所述檢測芯片包括: 玻片，采用活性氨基丙基硅烷包被； 多個微陣列，經芯片點陣將所述微陣列固定在所述玻片上； 墊片，將各個微陣列分隔成不同的雜交區； 其中，每個所述微陣列上含有對應于一種胰島素樣生長因子家族蛋白的一種特異性抗體； 還包括以下反應試劑: 檢測抗體混合液，所述抗體采用生物素標記； 封閉液，采用5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液； 標準蛋白混合物，包含若干種所述的胰島素樣生長因子家族蛋白混合物以及用封閉液稀釋的不同濃度的標準蛋白混合物； 采用熒光染料HyLight 555 (激發波長550nm，發射波長566nm)標記的鏈霉親和素。
2.根據權利要求1所述的蛋白聯合檢測芯片，其特征在于:每個所述玻片上固定有至少16個獨立的微陣列，每個微陣列具有4個重復點樣的抗體點。
3.根據權利要求1所述的蛋白聯合檢測芯片，其特征在于:所述玻片上還包括固定有生物素標記的抗牛IgG抗體的陽性對照點。
4.根據權利要求1所述的蛋白聯合檢測芯片，其特征在于:所述特異性抗體包括針對如下胰島素樣生長因子家族蛋白的抗體:IGF-1、IGF-1R、IGF-2、IGF-2R、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-6 和胰島素。
5.根據權利要求1所述的蛋白聯合檢測芯片，其特征在于:所述玻片在芯片點陣時，控制溫度為70-75F，濕度為40-45%，并在點陣后室溫靜置過夜。
6.根據權利要求1所述的蛋白聯合檢測芯片，其特征在于，所述玻片的實驗操作通過以下步驟進行:用含5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液封閉，各個獨立的微陣列分別用待測樣品或者不同濃度的用封閉液稀釋的標準蛋白混合物孵育過夜，洗滌去除不結合的蛋白，然后在各個微陣列中加入生物素標記的抗體混合液，孵育，洗滌，再用熒光染料HyLight555 (激發波長550nm,發射波長566nm)標記的鏈霉未和素室溫孵育，洗漆，干燥。
7.根據權利要求6所述的蛋白聯合檢測芯片，其特征在于，所述完成實驗操作的玻片通過以下步驟來計算待測樣品中各種胰島素樣生長因子家族蛋白的濃度:用激光掃描儀掃描成像；用數據提取軟件找到各個微陣列點并輸出數碼讀數；用配套芯片處理軟件自動計算出待測樣品中各個蛋白的濃度。
8.根據權利要求6或7所述的蛋白聯合檢測芯片，其特征在于，所述的待測樣品選自:細胞培養上清、人類血清、組織裂解液。
【文檔編號】G01N33/68GK103698529SQ201210366988
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年9月28日 優先權日:2012年9月28日
【發明者】黃若磐, 毛應清, 陳蘊如 申請人:廣州瑞博奧生物科技有限公司