專利名稱：一種深層散射介質中的三維成像系統(tǒng)及方法
技術領域：
本發(fā)明提出了一種在深層散射介質中進行三維成像的系統(tǒng)及方法。利用超短脈沖線聚焦光束激發(fā)產(chǎn)生雙光子熒光，實現(xiàn)對散射介質中，尤其是生物組織內(nèi)部，熒光標記物的三維空間分布成像。該發(fā)明適用于生物學、醫(yī)學，生物物理和環(huán)境科學等領域的研究和應用。
背景技術：
熒光顯微技術以其高靈敏度、高空間分辨率、豐富的分子對比機制成為生物醫(yī)學研究中必不可少的設備。由于光的散射效應的存在，普通的熒光顯微鏡只能對很薄(〈10微米)的樣品或者是樣品表面很薄的一層進行成像，才能得到較理想的高分辨圖像。對于散射 介質內(nèi)的熒光體的顯微成像，目前要借助共聚焦或雙光子激發(fā)等手段，來去除焦點以外各處發(fā)出的突光影響，同時結合激光掃描成像技術來實現(xiàn)。激光掃描成像技術采用的是掃描聚焦的光斑來逐點激發(fā)產(chǎn)生熒光，并同時進行數(shù)據(jù)采集，圖像是由計算機按掃描的順序重建而得到。這種逐點掃描的方式對于三維的厚組織的成像存在明顯的不足。首先是獲取三維圖像的低效性比如對于一塊厚組織成像，要獲得一幅512x512x200的三維圖像，如果掃描的速度是Ik行/秒，大致需要2分鐘時間，在這段時間內(nèi)被觀察的對象很有可能早已改變了原先所在的位置，甚至于已完全離開了掃描觀察的區(qū)域，使得很多快速的動態(tài)過程無法觀測。其次是無法實時得到三維視場的體視效果，因為得到全部三維信息需要對整個視場范圍進行200次幅掃描(每幅512x512)。傳統(tǒng)的體視顯微技術可以實時得到體視效果，但是無法對散射介質中的熒光體進行成像。針對上述問題我們提出了用線聚焦的光束替代普通掃描熒光顯微成像技術中的點聚焦光束，來實現(xiàn)散射介質中的立體成像。實現(xiàn)線聚焦的最常用方法是用透鏡聚焦一個圓錐形的波前，在聚焦區(qū)域產(chǎn)生所謂的準貝塞爾光束，這種光束在有限的聚焦區(qū)域里具有貝塞爾光束的特性。貝塞爾光束具有“無衍射”的特性，即其光場分布的粗細不隨光束的傳播而變化，而且其居于中心的中心光瓣的束腰大小接近于衍射極限的大小。另外，貝塞爾光束在遇到障礙物時，中心光束會自行修復其缺失，具有“自愈和”的特性。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有的三維技術采用逐點掃描獲取三維圖像的低效性且無法對散射介質中的熒光體進行成像的技術問題，本發(fā)明提供一種深層散射介質中的三維成像系統(tǒng)及方法，本發(fā)明提出了用線聚焦的光束替代普通掃描熒光顯微成像技術中的點聚焦光束，來實現(xiàn)散射介質中的三維成像。本發(fā)明的技術解決方案一種深層散射介質中的三維成像系統(tǒng)，其特殊之處在于包括沿光路傳播方向依次設置的光源、貝賽爾光束產(chǎn)生及掃描裝置、熒光收集系統(tǒng)、信號探測部件以及圖像采集系統(tǒng)，
所述光源為激光器，所述貝塞爾光束產(chǎn)生及掃描裝置包括沿光路設置的平移臺、錐鏡、第一透鏡I、振鏡以及4f系統(tǒng)；所述4f系統(tǒng)包括第二透鏡和第三透鏡，所述第二透鏡放置在振鏡的反射光路上，第二透鏡2和第三透鏡3之間的距離L=f2+f3，其中f2為第二透鏡的焦距，f3為第三透鏡的焦距，所述錐鏡放置在平移臺上，所述錐鏡與第一透鏡之間的距離等于第一透鏡的焦距Π，所述振鏡8放置在第一透鏡和第二透鏡的焦點重合處，所述信號探測部件的輸入端朝向熒光收集系統(tǒng)的熒光輸出端，所述信號探測部件的輸出端與圖像采集系統(tǒng)的輸入端連接。上述熒光收集系統(tǒng)包括雙色鏡以及物鏡，所述雙色鏡放置在第三透鏡的透射光路上，所述物鏡放置在雙色鏡的透射光路上，物鏡的另一端放置有樣品。上述信號探測部件為光電倍增管或單光子探測器。·
還包括準直擴束系統(tǒng)，所述準直擴束系統(tǒng)設置在光源和貝賽爾光束產(chǎn)生及掃描裝置之間，所述準直擴束系統(tǒng)包括沿光源傳輸方向設置的擴束器5和光闌6。還包括聚光鏡13和第二光電倍增管15，所述聚光鏡設置在樣品的一側，與物鏡相對，所述聚光鏡的透射端朝向第二光電倍增管15。一種深層散射介質中的三維成像方法，其特殊之處在于包括以下步驟I光源產(chǎn)生一束激光；2將激光轉變?yōu)闇守惾麪柟馐?將準貝塞爾光束通過第一透鏡聚焦，在振鏡上產(chǎn)生準貝塞爾光束的傅立葉頻譜，形成兩個正交的掃描光場；4將掃描光場通過雙色鏡后透射至物鏡焦區(qū)，在物鏡的焦區(qū)產(chǎn)生聚焦的、在z方向線狀延伸的準貝塞爾光束；5獲取圖像5. I轉動振鏡,準貝塞爾光束作為激發(fā)光對樣品做垂直光軸的橫向掃描,收集所產(chǎn)生的熒光并進行光電轉換，通過圖像采集系統(tǒng)得到樣品的第一幅兩維圖像；5. 2橫向移動錐鏡，然后轉動振鏡，準貝塞爾光束作為激發(fā)光對樣品做垂直光軸的第二次橫向掃描，收集所產(chǎn)生的熒光并進行光電轉換，通過圖像采集系統(tǒng)得到樣品的第二幅兩維圖像；5. 3對掃描得到的兩幅兩維圖像進行體視合成，獲得樣品的三維分布信息。上述步驟5具體為，物鏡收集樣品所產(chǎn)生的熒光，并通過雙色鏡反射給光電倍增管進行光電轉換或聚光鏡收集樣品所產(chǎn)生的熒光，并透射給第二光電倍增管。在激光束轉變?yōu)闇守惾麪柟馐斑€經(jīng)過準直擴束。本發(fā)明所具有的優(yōu)點I、本發(fā)明采用了能夠產(chǎn)生沿光傳播方向形成線聚焦的準貝塞爾光束作為激發(fā)光，代替現(xiàn)有的雙光子激發(fā)熒光掃描顯微技術中產(chǎn)生點聚焦的高斯光束，將原本的平面掃描變成了體積掃描，實現(xiàn)了快速獲取散射介質內(nèi)部熒光分布圖像。2、本發(fā)明使得聚焦線的延伸方向與光軸方向形成一個傾斜角，對同一個樣品分別用帶有不同傾斜角的聚焦線進行兩次掃描成像，然后再將兩幅圖分別顯示給觀察者的左右兩眼實現(xiàn)三維立體的成像效果。


圖I本發(fā)明錐鏡所產(chǎn)生準貝賽爾光束；圖2通過移動錐鏡實現(xiàn)雙視角掃描示意圖；圖3本發(fā)明三維成像系統(tǒng)的結構示意圖；圖4本發(fā)明獲取第一個視角的兩維圖像的流程；圖5本發(fā)明獲取第二個視角的兩維圖像的流程。
具體實施方式
各組成部分的作用和實現(xiàn)如下超短脈沖激光器產(chǎn)生的皮秒或飛秒脈沖可以在樣品上通過雙光子吸收效應產(chǎn)生熒光，其信號強度正比于激光強度的平方，這種非線性效應導致熒光信號被定位在縱向延伸的貝塞爾零級光束聚焦線上，從而使高穿透深度的體掃描成為可能。擴束準直部分，可以對飛秒脈沖進行空間整形，為后面的掃描裝置提供更理想的高斯光束。貝賽爾光束產(chǎn)生和掃描裝置貝塞爾光束可以通過很多方法來產(chǎn)生，一個比較簡單的方法是用基模高斯光束通過圓錐鏡形成的零階準貝塞爾光束，假設圓錐鏡的張角為Y，材料的折射率為n，高斯光束的束腰半徑為\，波長為λ，那么貝塞爾光束的幾何光學傳播方向和光軸Z方向的夾角a C1,最大傳播距離Zmax,中心光瓣的半徑A和軸上的光強分布1(0，ζ)可表示為α 0=(η-1) YZmax=W0/ (tan α )r0=2. 405 λ / (2 π sin α 0)Ib (O, ζ) α 02ζ/λ · exp [-2 ( α 0z/w0)2](I)產(chǎn)生的貝塞爾光束由第一透鏡I聚焦到振鏡上，再通過焦距為f2的第二透鏡2和焦距為f3的第三透鏡3組成的4f系統(tǒng)，入射到物鏡的入瞳。第二透鏡2和第三透鏡3的相距L=fl+f2。為了產(chǎn)生兩個傾斜的聚焦線，錐鏡放在一個可以橫向移動的平移臺上。貝塞爾光束最終被投射到物鏡焦區(qū)，通過雙光子吸收產(chǎn)生熒光信號。部分反向傳播的熒光信號被顯微物鏡收集并通過光電探測器(如光電倍增管)接收變?yōu)殡娦盘枺?jīng)采集系統(tǒng)和計算機的處理，用于重建熒光圖像。由于物鏡的收集的體積只限于其設計的焦點區(qū)域，所以不能很有效的收集聚焦線上發(fā)出的熒光。為了盡可能的多收集產(chǎn)生的熒光，可以采用聚光鏡進行前向收集，聚光鏡所收集的熒光信號可以最后匯總到另一個第二光電探測器15上，其信號輸出與物鏡收集的信號疊加后，就可以得到整個體積幅圖像。重建體視圖，需要獲得圖面說明。本發(fā)明采用了能夠產(chǎn)生沿光傳播方向形成線聚焦的準貝塞爾光束作激發(fā)光，代替現(xiàn)有的雙光子激發(fā)突光掃描顯微技術中產(chǎn)生點聚焦的高斯光束，將原本的平面掃描變成了體積掃描，實現(xiàn)了快速獲取散射介質內(nèi)部突光分布圖像。由于從點掃描改成線掃描，突光的收集也有所不同，透鏡收集的熒光基本局限在焦點附近發(fā)出的，適合于點掃描成像。對于線掃描我們提出的收集方式，來充分獲取聚焦線上各處發(fā)出的熒光
為了實現(xiàn)三維體視圖像的生成，我們提出如下方法讓準貝塞爾光束產(chǎn)生的聚焦線的延伸方向與光傳播的方向形成一個傾斜角，如果對同一個樣品分別用帶有不同傾斜角的聚焦線進行兩次掃描成像，然后再將兩幅圖分別顯示給觀察者的左右兩眼，就可以實現(xiàn)三維立體的成像效果。用帶有不同傾斜角度的聚焦線得到的圖像，類似于立體視覺中人眼左右兩眼的觀察方向的角度的差別，這個角度就是產(chǎn)生體視的關鍵所在。產(chǎn)生這種傾斜的聚焦線的方法為I、如圖3所示，轉動振鏡；2、如圖4所示，橫向移動錐鏡，通過切換錐鏡的橫向位置，使投射在振鏡上的聚焦環(huán)微移，轉動振鏡，進而通過4 f系統(tǒng)使入射在物鏡上的光環(huán)產(chǎn)生微移，通過物鏡使得聚焦場與光軸的夾角在兩個視角上切換。兩幅不同視角的體掃描圖像可以通過目前的立體顯示技術來再現(xiàn)觀察樣品的體視效果。實施例 為了高效激發(fā)突光標記樣品中的雙光子突光,并高速對樣品掃描，激發(fā)光源一般采用高重復頻率(如80MHz)的超短脈沖鎖模激光器。例如可以采用Sepctra-Physics公司的Mai Tai超快飛秒激光器，它具有較寬的光譜調(diào)節(jié)范圍(690nnTl040nm)，可以激發(fā)常見的熒光標記物產(chǎn)生雙光子熒光。脈沖寬度一般選擇在10(Γ200飛秒，更大的脈寬會降低雙光子激發(fā)效率，從而減弱貝賽爾光束激發(fā)的深度。 顯微物鏡在本發(fā)明中既作為掃描貝塞爾光束的組件，也作為反向熒光收集的組件。為使掃描場能夠在不同掃描角度下具有較好的貝塞爾聚焦場，宜采用大入瞳直徑的物鏡(約6mm以上)。為了使提高散射的熒光光子的收集效率，根據(jù)文獻DucroS，M. etal. Journal of Neuroscience Methods 198, 172 - 180 (2011).應米用低放大倍率、高數(shù)值孔徑的物鏡。擴束裝置與光闌使得入射到錐鏡中心的光斑保持均勻，同時保證合適的尺寸，能夠充分利用掃描振鏡的有效尺寸，最終通過4 f系統(tǒng)在物鏡入瞳處產(chǎn)生合適大小環(huán)狀光場分布。本發(fā)明利用錐鏡產(chǎn)生貝塞爾光束，錐鏡所產(chǎn)生的遠場光束的發(fā)散角隨著底角角度的增加而增大，采用小底角的(例如2° )的錐鏡，使得后面的4 f系統(tǒng)能夠中繼整個光束。振鏡的掃描角度范圍決定了觀察樣品的視場大小，但是最大掃描角度不能超過后續(xù)4f系統(tǒng)和物鏡入瞳的孔徑限制。
權利要求
1.一種深層散射介質中的三維成像系統(tǒng)，其特征在于包括沿光路傳播方向依次設置的光源、貝賽爾光束產(chǎn)生及掃描裝置、熒光收集系統(tǒng)、信號探測部件以及圖像采集系統(tǒng)， 所述光源為激光器， 所述貝塞爾光束產(chǎn)生及掃描裝置包括沿光路設置的平移臺、錐鏡、第一透鏡(I)、振鏡以及4f系統(tǒng)；所述4f系統(tǒng)包括第二透鏡和第三透鏡，所述第二透鏡放置在振鏡的反射光路上，第二透鏡(2)和第三透鏡(3)之間的距離L=f2+f3，其中f2為第二透鏡的焦距，f3為第三透鏡的焦距，所述錐鏡放置在平移臺上，所述錐鏡與第一透鏡之間的距離等于第一透鏡的焦距Π，所述振鏡(8)放置在第一透鏡和第二透鏡的焦點重合處， 所述信號探測部件的輸入端朝向熒光收集系統(tǒng)的熒光輸出端，所述信號探測部件的輸出端與圖像采集系統(tǒng)的輸入端連接。
2.根據(jù)權利要求I所述的深層散射介質中的三維成像系統(tǒng)，其特征在于所述熒光收集系統(tǒng)包括雙色鏡以及物鏡，所述雙色鏡放置在第三透鏡的透射光路上，所述物鏡放置在雙色鏡的透射光路上，物鏡的另一端放置有樣品。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的深層散射介質中的三維成像系統(tǒng)，其特征在于所述信號探測部件為光電倍增管或單光子探測器。
4.根據(jù)權利要求3所述的深層散射介質中的三維成像系統(tǒng)，其特征在于還包括準直擴束系統(tǒng)，所述準直擴束系統(tǒng)設置在光源和貝賽爾光束產(chǎn)生及掃描裝置之間，所述準直擴束系統(tǒng)包括沿光源傳輸方向設置的擴束器(5)和光闌(6)。
5.根據(jù)權利要求3所述的深層散射介質中的三維成像系統(tǒng)，其特征在于還包括聚光鏡(13)和第二光電倍增管(15),所述聚光鏡設置在樣品的一側，與物鏡相對，所述聚光鏡的透射端朝向第二光電倍增管(15)。
6.一種深層散射介質中的三維成像方法，其特征在于包括以下步驟 I光源產(chǎn)生一束激光； 2將激光轉變?yōu)闇守惾麪柟馐? 3將準貝塞爾光束通過第一透鏡聚焦，在振鏡上產(chǎn)生準貝塞爾光束的傅立葉頻譜，形成兩個正交的掃描光場； 4將掃描光場通過雙色鏡后透射至物鏡焦區(qū)，在物鏡的焦區(qū)產(chǎn)生聚焦的、在z方向線狀延伸的準貝塞爾光束； 5獲取圖像 5. I轉動振鏡，準貝塞爾光束作為激發(fā)光對樣品做垂直光軸的橫向掃描，收集所產(chǎn)生的熒光并進行光電轉換，通過圖像采集系統(tǒng)得到樣品的第一幅兩維圖像； 5. 2橫向移動錐鏡，然后轉動振鏡，準貝塞爾光束作為激發(fā)光對樣品做垂直光軸的第二次橫向掃描，收集所產(chǎn)生的熒光并進行光電轉換，通過圖像采集系統(tǒng)得到樣品的第二幅兩維圖像； 5.3對掃描得到的兩幅兩維圖像進行體視合成，獲得樣品的三維分布信息。
7.根據(jù)權利要求6所述的深層散射介質中的三維成像方法，其特征在于所述步驟5具體為，物鏡收集樣品所產(chǎn)生的熒光，并通過雙色鏡反射給光電倍增管進行光電轉換或聚光鏡收集樣品所產(chǎn)生的熒光，并透射給第二光電倍增管。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的深層散射介質中的三維成像方法，其特征在于在激光束轉變?yōu)闇守惾麪柟馐?前還經(jīng)過準直擴束。
全文摘要
一種深層散射介質中的三維成像系統(tǒng)，包括沿光路傳播方向依次設置的光源、貝賽爾光束產(chǎn)生及掃描裝置、熒光收集系統(tǒng)、信號探測部件以及圖像采集系統(tǒng)，貝塞爾光束產(chǎn)生及掃描裝置包括沿光路設置的平移臺、錐鏡、第一透鏡、振鏡以及4f系統(tǒng)；本發(fā)明解決了現(xiàn)有的三維技術采用逐點掃描獲取三維圖像的低效性且無法對散射介質中的熒光體進行成像的技術問題，采用了能夠產(chǎn)生沿光傳播方向形成線聚焦的準貝塞爾光束作為激發(fā)光，代替現(xiàn)有的雙光子激發(fā)熒光掃描顯微技術中產(chǎn)生點聚焦的高斯光束，將原本的平面掃描變成了體積掃描，實現(xiàn)了快速獲取散射介質內(nèi)部熒光分布圖像。
文檔編號G01N21/64GK102944540SQ20121038489
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月11日 優(yōu)先權日2012年10月11日
發(fā)明者葉彤, 楊延龍, 姚保利, 雷銘, 鄭娟娟, 嚴紹輝, 但旦 申請人:中國科學院西安光學精密機械研究所