專利名稱：一種利用流式細胞儀檢測抗原表達水平的方法
技術領域：
本發明涉及流式細胞術技術領域，更具體地講，涉及一種利用流式細胞儀檢測弱抗原表達水平的流式細胞分析方法。
背景技術：
流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段。它以激光為激發光源，可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數，具有速度快、精度高、準確性好等優點，成為當代最先進的細胞定量分析技術，被廣泛應用于醫學臨床以及各個生物研究領域。當前，絕大多數流式細胞儀在理論性能參數上認為能檢測到單個細胞上低至100個熒光分子數的弱抗原。但是在實際工作中，不同實驗室對這類弱抗原表達的結果判斷存在很大偏差。目前在實際操作中，通常會通過常規設置同型對照或陰性對照的方法來判定目的抗原的表達。這對于強陽性和陰性標本容易判斷，但抗原表達量低時，結果很難判斷。即使在操作中選用熒光強度最強的熒光素如藻紅蛋白(PE)標記的單抗也無法改善結果。也有研究者嘗試采用間接標記法來改善抗原表達弱的數據分析問題。但間接標記法一方面耗時長，增加了細胞的丟失；另一方面非特異性熒光背景強，因此該方法并不適合臨床標本和細胞數少的樣本的檢測。平均熒光強度是目前檢測弱抗原表達水平最常用的統計學指標。但對于小樣本事件來說，分析者無法通過抗原表達強度高于同型對照的多少去判斷結果有無統計學差異。因此，如果能研發一種簡單客觀的統計分析方法，最大限度地減少檢測弱抗原表達的實驗誤差和主觀判斷誤差，將會有效推動流式細胞術在多應用領域的實用價值。

發明內容
針對上述現有技術中流式細胞儀無法準確檢測弱抗原表達的問題，本發明提供了一種利用流式細胞儀檢測抗原表達水平的方法。該方法可以增加弱抗原檢測的準確性，避免人為的誤差。為實現上述的發明目的，本發明采用如下的技術手段—種利用流式細胞儀檢測抗原表達水平的方法，首先將目的細胞進行免疫熒光染色，然后將染色后的細胞上流式細胞儀檢測、進行數據計算和分析。在設定所述流式細胞儀的參數時，將待測熒光通道的分辨率降低；獲取同型對照或陰性細胞以及目的細胞待測抗原的幾何平均熒光強度(Geometric Mean, Geo Mean)，再計算出各自的幾何平均熒光強度率，以同型對照或陰性細胞的幾何平均熒光強度率為界值，若目的細胞待測抗原的幾何平均熒光強度率比同型對照或陰性細胞的幾何平均熒光強度率高出預定值，則為該待測抗原表達。具體地，上述方法包括如下的具體步驟(I)將目的細胞進行免疫熒光染色；(2)設置流式細胞儀性能參數，上機檢測分析；設置待測熒光通道的分辨率為256 ;通過對同型對照或陰性細胞的檢測，在前向散射光(forward scatter, FS) /待測抗原熒光通道雙參數圖上調節電壓，使前向散射光/待測抗原熒光通道的幾何平均熒光強度相等，即幾何平均熒光強度率為1. O ;獲取目的細胞待測抗原幾何平均熒光強度，計算幾何平均熒光強度率；(3)數據分析若目的細胞待測抗原幾何平均熒光強度率高于同型對照或陰性細胞幾何平均熒光強度率O. 1，則為待測抗原表達。其中較優地，所述目的細胞為濃度為± IO6細胞/100 μ I的單細胞懸液。其中較優地，所述幾何平均熒光強度率計算方法為待測抗原或同型對照或陰性細胞的幾何平均熒光強度/目的細胞前向散射光的幾何平均熒光強度。其中較優地，所述抗原為單個細胞上至少100個熒光分子數的弱抗原。與現有技術相比較，本發明具有以下幾個方面的優點1.采用降低熒光通道分辨率的技術思路，有效避免了后期數據分析中由人為因素造成的實驗誤差，提高了結果判斷的真實性和客觀性；2.采用幾何平均熒光強度分析，對偏態分布和細胞數·極低的抗原表達結果更具統計學意義；3.建立一個新的流式統計學指標幾何平均熒光強度率，有效避免了儀器在不同時間段可能存在的電壓等儀器參數的輕微偏差，以及不同時間點不同批次樣本對結果的影響，提高了對目的細胞測定的準確度和精確度。


圖1a為細胞分布呈偏態分布的示意圖。圖1b為細胞分布呈正態分布的示意圖。圖2顯示了一例慢性淋巴細胞白細胞外周血樣本的FS/同型對照gGl-PE (FL2通道)的幾何平均熒光強度達到一致(比值為1. O)。圖3為一例慢性淋巴細胞白血病外周血樣本中腫瘤細胞中ZAP-70-PE與同型對照IgGl-PE的擬合圖(黑色分布為同型對照，灰色線為ZAP-70)，分析后幾何平均熒光強度率為1. 25，判斷腫瘤細胞表達ZAP-70。圖4為一例慢性淋巴細胞白血病外周血樣本中腫瘤細胞中ZAP-70-PE與同型對照IgGl-PE的擬合圖，分析后幾何平均熒光強度率為O. 86，判斷腫瘤細胞不表達ZAP-70。圖5顯示了按現有技術對一例慢性淋巴細胞白血病ZAP-70的檢測結果。圖6顯示了 246例慢性淋巴細胞白血病細胞的ZAP-70幾何平均熒光強度率增益范圍與IgVH發生突變的符合率。圖7a顯不了一例急性白血病骨髓樣本中白血病細胞中⑶137L按原方法表達為18%，判斷為陽性。圖7b顯示了采用本發明所述方法分析后幾何平均熒光強度率為1. 42，判斷腫瘤細胞不表達⑶137L。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡述本發明。下述實施例中，所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Samtoook等人在《分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1:檢測慢性淋巴細胞白血病腫瘤細胞ZAP-70表達水平1.單個核細胞的制備新鮮送檢的慢性淋巴細胞白血病外周血標本2ml，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，調單細胞懸液濃度為±IO6細胞/100μ I。上述目的細胞可以根據實際情況中樣本的不同而選擇不同現有技術進行制備，樣本可以是骨髓、外周血或淋巴結等。2.細胞的免疫熒光染色。2.1每管加制備好的單細胞懸液100μ 1，共兩管。兩管均加入⑶3 +⑶5-FITC/CD19-PerCP鼠抗人單抗(來自BD Pharmingen公司，美國)各20 μ 1，旋渦混勻后，室溫避光反應30分鐘。
2. 2 PBS洗I次，1000轉/每分，離心去上清。2. 3 FIX液固定細胞30分鐘后離心去上清。2. 4 Perm液對細胞打孔5分鐘后，待測管加ZAP_70_PE鼠抗人單抗，對照管加IgG2a-PE同型對照(均來自BD Pharmingen公司，美國)各20ul，室溫避光孵育15分鐘，PBS洗細胞一次后去上清。3.加入500uLPBS，上機檢測分析。3.1設置熒光通道的分辨率為256。3.2上同型對照管，設門取⑶5 +⑶19+雙陽性腫瘤細胞群，在FS/FL2雙參數圖上調節電壓，使FS/FL2的幾何平均熒光強度相等，即幾何平均熒光強度率為I (參見圖2)。3. 3上待測管，收獲細胞，分析待測管中腫瘤細胞FS和ZAP-70的幾何平均熒光強度。4.計算幾何平均熒光強度率，腫瘤細胞ZAP-70幾何平均熒光強度率高于同型對照O. 1，為陽性(參見圖3)，反之為陰性(參見圖4)。在現有技術中，通過常規熒光標記方法處理樣本后上機，在數據采集時采用如下步驟5.1熒光通道常規采用的分辨率為1024。5.2界定方法①上同型對照管，設門取⑶5 +⑶19+雙陽性腫瘤細胞群，在IgGl-PE單參數圖上設置陰陽性界定門；或采用界定方法②設門取CD5單陽性T淋巴細胞，在CD5-FITC/IgGl-PE為陽性對照界定陰陽性界定門(這兩種方法均來源于國外相關文獻)。5. 3上待測管，收獲細胞，分析待測管中⑶5 +⑶19+雙陽性腫瘤細胞的ZAP-70表達率(參見圖5，根據相關文獻彡20%為陽性)。IgVH基因突變被認為是慢性淋巴細胞白血病(CLL)最公認的預后檢測指標，但由于該項檢測價格昂貴，步驟繁瑣難以廣泛開展。2003年Crespo在《新英格蘭醫學雜志》發表文章認為IgVH是否突變與流式檢測的ZAP-70具有明顯相關性而受到廣泛關注。由于ZAP-70是個弱抗原，陰陽性難以界定，現有技術中普遍采用的“20%”為陽性的標準極大地受到人為因素的影響。因此，在隨后的幾年里，由于缺乏標準化的檢測方案，加之主觀判斷導致的結果誤差，該方法受到廣泛爭議而限制其進一步的應用。針對現有技術所存在的缺陷，本發明提供了一個全新的弱抗原檢測理念和分析方法。具體地說，首先將常規設定的熒光通道的分辨率由1024降低至256 (根據需要，該分辨率也可以進一步降低到其它數值如128等)，即后者每個單位抗原表達量的覆蓋范圍是前者的4倍，例如一種抗原采用分辨率1024的平均熒光強度分別是330、331、332、333，但設置分辨率256后平均熒光強度均為83。此處采用降低儀器分辨率的技術思路，其優點是有效避免了后期數據分析中由人為因素造成的實驗誤差，提高了結果判斷的真實性和客觀性。其次，采用幾何平均熒光強度這一統計學參數取代了常規的算術平均熒光強度。算術平均熒光強度即通常所說的平均數，為目的細胞熒光強度的均值，即Xl + x2 + x3 +…xn/n ;幾何平均熒光強度為xl X x2 X x3 X…xn后開η次根。算術平均熒光強度的缺點是忽視了目的細胞在該通道的分布特點，盡管對于數據為正態分布的曲線范圍而言兩者差異不大，但對于抗原表達弱陽性的細胞需要考慮分布存在偏態分布時，特別是目的細胞數較少時，采用幾何平均熒光強度分析對 偏態分布和細胞數極低的抗原表達結果更具統計學意義，具體如圖1a和圖1b所示結果。再次，本發明建立一個新的流式統計學指標幾何平均熒光強度率，即待測抗原或同型對照的幾何平均熒光強度/目的細胞前向散射光(FS)的幾何平均熒光強度。FS是一項檢測細胞大小的統計學參數，目的細胞中待測抗原的幾何平均熒光強度被該群細胞FS所校正，有效避免了儀器在不同時間段可能存在的電壓等儀器參數的輕微偏差，以及不同時間點不同批次樣本對結果的影響，提高了對目的細胞測定的準確度和精確度。基于上述的弱抗原檢測理念和分析方法，可以利用流式細胞儀準確檢測單個細胞上低至100個左右熒光分子數的弱抗原，而且可以準確檢測的弱抗原也不局限于實施例中記載的這兩種。迄今為止，發明人對246例CLL檢測ΖΑΡ-70的表達，采用原方法和IgVH符合率僅有58% ;采用新的弱抗原檢測理念和分析方法，并進一步比較了待測細胞幾何平均熒光強度增益(O ±0. 2)與IgVH發生突變的符合率。經過對圖6的分析，可以發現幾何平均熒光強度率高于同型對照±0.1左右得到的數據最有價值，兩者符合率可以達到91%。實施例2 :檢測急性白血病白血病腫瘤細胞⑶137L表達水平1.單個核細胞的制備新鮮抽取的急性白血病骨髓標本2ml，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，調單細胞懸液濃度為土 IO6細胞/100 μ I。上述目的細胞可以根據實際情況中樣本的不同而選擇不同現有技術進行制備，樣本可以是骨髓、外周血或淋巴結等。2.細胞的免疫熒光染色。2.1加制備好的單細胞懸液100 μ 1，共兩管。待測管加入CD137L-PE/CD45-PerCP5. 5鼠抗人單抗(來自BD Pharmingen公司，美國)各20 μ 1，對照管IgGl-PE/CD45-PerCP5. 5各20ul，旋渦混勻后，室溫避光反應30分鐘。2. 2 PBS洗I次，1000轉/每分，離心去上清。3.加入500uLPBS，上機檢測分析。3.1設置熒光通道的分辨率為256。3. 2上同型對照管，⑶45/SS設門取原始細胞群，在FS/FL2雙參數圖上調節電壓，使FS/FL2的幾何平均熒光強度相等，即幾何平均熒光強度率為I。3.3上待測管，收獲細胞。在本實施例中，至少收獲2萬個細胞，分析待測管中白血病細胞FS和⑶137L的幾何平均熒光強度。4.計算幾何平均熒光強度率，白血病細胞⑶137 L幾何平均熒光強度率高于同型對照O.1為陽性，反之為陰性(參見圖7a)。在現有技術中，通過常規熒光標記方法處理樣本后上機，在數據采集時采用如下步驟5.1熒光通道通常采用的分辨率為1024。5. 2界定方法上同型對照管，⑶45/SS設門取白血病細胞群，在IgGl-PE單參數圖上設置陰陽性界定門；5.3上待測管，收獲細胞，分析待測管中白血病細胞的⑶137L的表達率(參見圖7b，根據相關文獻彡20%為陽性)。
膜蛋白分子⑶137L是共刺激分子TNFR/TNF超家族成員，主要表達在抗原提呈細胞(APC)表面，也是一種弱抗原。近年，⑶137L分子被發現在不同腫瘤細胞及一些非免疫性細胞中也有表達。發明人用流式細胞術對97例急性白血病(包括29例急性淋巴細胞白血病和68例急性髓系白血病)的白血病細胞上⑶137L的表達，并通過RT-PCR法從mRNA水平印證FCM檢測結果。RT-PCR法可以擴增出465bp的⑶137LmRNA特異性條帶為陽性，共有46例檢測到陽性條帶。它們分成兩組FCM + PCR_/FCM PCR+組和FCM +PCR +/FCM_PCR_組，采用上述現有方法兩者符合率為77. 3%，而采用本發明所提供的弱抗原檢測理念和分析方法，兩者符合率增加至91. 8%。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種利用流式細胞儀檢測抗原表達水平的方法，首先將目的細胞進行免疫熒光染色，然后將染色后的細胞上流式細胞儀檢測、進行數據計算和分析，其特征在于在設定所述流式細胞儀的參數時，將待測熒光通道的分辨率降低；獲取同型對照或陰性細胞以及目的細胞待測抗原的幾何平均熒光強度，再計算出各自的幾何平均熒光強度率，以同型對照或陰性細胞的幾何平均熒光強度率為界值，若目的細胞待測抗原的幾何平均熒光強度率比同型對照或陰性細胞的幾何平均熒光強度率高出預定值，則為該待測抗原表達。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于包括如下的具體步驟(1)將目的細胞進行免疫熒光染色；(2)設置流式細胞儀性能參數，上機檢測分析；設置待測熒光通道的分辨率為256;通過對同型對照或陰性細胞的檢測，在前向散射光/待測抗原熒光通道雙參數圖上調節電壓，使前向散射光/待測抗原熒光通道的幾何平均熒光強度相等，即幾何平均熒光強度率為1. O ;獲取目的細胞待測抗原幾何平均熒光強度，計算幾何平均熒光強度率；(3)數據分析若目的細胞待測抗原幾何平均熒光強度率高于同型對照或陰性細胞幾何平均熒光強度率O. 1，則為待測抗原表達。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述目的細胞為濃度為土 IO6細胞/100 μ I的單細胞懸液。
4.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述幾何平均熒光強度率計算方法為待測抗原或同型對照或陰性細胞的幾何平均熒光強度/目的細胞前向散射光的幾何平均熒光強度。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述幾何平均熒光強度率計算方法為待測抗原或同型對照或陰性細胞的幾何平均熒光強度/目的細胞前向散射光的幾何平均熒光強度。
6.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述抗原為單個細胞上至少100個熒光分子數的弱抗原。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述待測熒光通道的分辨率為256或以下。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述預定值為0.1。
全文摘要
本發明公開了一種利用流式細胞儀檢測抗原表達水平的方法，首先將目的細胞進行免疫熒光染色，然后將染色后的細胞上流式細胞儀檢測、進行數據計算和分析。其中在設定所述流式細胞儀的參數時，將待測熒光通道的分辨率降低；獲取同型對照或陰性細胞以及目的細胞待測抗原的幾何平均熒光強度，再計算出各自的幾何平均熒光強度率，以同型對照或陰性細胞的幾何平均熒光強度率為界值，若目的細胞待測抗原的幾何平均熒光強度率比同型對照或陰性細胞的幾何平均熒光強度率高出預定值，則為該待測抗原表達。本發明有效提高了對目的細胞測定的準確度和精確度，最大限度地減少檢測弱抗原表達的實驗誤差和主觀判斷誤差，將會有效推動流式細胞術在多領域的實用價值。
文檔編號G01N15/14GK102998241SQ201210401110
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月19日 優先權日2012年10月19日
發明者吳雨潔, 陳昕, 李建勇, 仇紅霞 申請人:南京醫科大學第一附屬醫院