專利名稱：一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于酶聯免疫檢測技術領域，具體涉及一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的試劑盒。
背景技術：
呋喃西林(Nitrofurazone)等硝基呋喃類抗生素因其廣譜、高效、廉價等特點被廣泛應用于家畜、家禽、水產、蜂等動物傳染疾病的預防和治療。氨基脲(SEM)是呋喃西林的代謝產物，它在此類藥物中毒性最強，在動物源性食品中的殘留可通過食物鏈傳遞給人類，長期攝入有致畸胎、致癌等副作用。美國、日本和歐盟目前已全面規定禁止使用呋喃類抗菌物質。我國農業部文件農牧發[2002] I號也規定動物源性食品中呋喃唑酮、呋喃它酮的檢出限為不得檢出。呋喃西林在動物體內很快代謝，其中常以檢測其代謝產物作為殘留標示，目前歐盟對硝基呋喃類代謝物的檢測方法靈敏度規定為lug/kg。已報道用于檢測硝基呋喃類抗生素代謝物殘留的方法主要有HPLC、LC-MS、LC-MS/MS和酶聯免疫法(ELISA)等。HPLC、LC-MS、LC_MS/MS等方法靈敏度高、準確性好，常作為藥物殘留檢測的確認方法，在我國LC-MS/MS技術更是被作為此類藥物在動物源性食品中檢測的國標法。然此類方法對儀器和操作人員要求都較高，一個樣品檢測要幾百元，檢測時間也很長，不能滿足現場抽檢的需求和推廣應用。ELISA技術以其快速、靈敏、特異性高等特點已成為目前藥品殘留檢測的有效方法之一。

發明內容
本發明的目的在于提供一種具有高靈敏度、特異性、準確度、精確度且操作簡單的酶聯免疫吸附檢測試劑盒，用于定量快速檢測蜂蜜、各種水產畜禽組織生物樣品中的呋喃西林代謝物，以及飼料中的原型藥。一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的試劑盒，該試劑盒包括:呋喃西林代謝物特異性抗體、酶標板、呋喃西林代謝物辣根過氧化物酶標記物、呋喃西林代謝物標準品、酶標物稀釋液、顯色劑、清洗液、終止液和樣品稀釋液。所述的清洗液為0.05% -0.5%吐溫-20磷酸鹽緩沖液。所述的顯色劑為過氧化氫；或者過氧化脲、鄰苯二胺與穩定劑K按5: 5: 1(體積比)混合而成；或者過氧化脲、四甲基聯苯胺與穩定劑K按5: 5: I (體積比)混合而成；在4°C下可以穩定保存兩年不變色。所述的酶標物稀釋液為含酶穩定劑AH和酶保護劑KEN的磷酸鹽緩沖液。所述的穩定劑K、含酶穩定劑AH和酶保護劑均購自美國InternationalDiagostica System 公司。所述呋喃西林代謝物酶標記物為濃縮液，使用時用酶標物稀釋液溶解為工作液即
可直接使用。
所述的呋喃西林代謝物標準品用磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L, pH7.4)配置成濃度分別為 0ng/mL、0.05ng/mL、0.15ng/mL、0.45ng/mL、l.35ng/mL、4.05ng/mL 的溶液。所述的終止液為2mol/L的鹽酸溶液。所述的濃縮樣品稀釋液為含I % BSA的5倍濃縮磷酸鹽緩沖液。所述呋喃西林代謝物特異性抗體包被在酶標板上。所述呋喃西林代謝物特異性抗體為動物抗呋喃西林代謝物的多克隆抗體，用呋喃西林代謝物與載體蛋白偶聯物作為免疫原通過免疫動物制得。所述動物為兔、鼠或羊。一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的方法，按照如下步驟進行:(I)樣品前處理:對于肌肉、肝臟、魚、蝦的組織，供試樣用均質器均質樣本，取
1.0±0.05g的均質物進行以下操作；對于蜂蜜樣品直接稱取1.0±0.05g的供試樣進行以下操作；(2)加入4mL蒸餾水，0.5mLlM鹽酸和150 μ L50mM的4-硝基苯甲醛溶液，渦旋混勻30s，60°C水浴3h，每隔Ih渦旋振蕩一次；(3)加入5mL0.1M磷酸氫二鉀和0.4mLlM氫氧化鈉溶液，混勻加入6mL乙酸乙酯，振蕩l-40min,室溫條件下，4000g離心IOmin,收集3mL上層液體至IOmL玻璃試管,50 60°C水浴氮氣吹干；(4)加入ImL正己烷，渦旋混勻30s，然后加入ImL樣品稀釋液復溶，振蕩混勻30s，室溫條件下3000g離心5min棄去上層有機相，取下層水相50 μ L用于分析；對于飼料樣品，稱取1.0±0.05g粉碎的樣本加入IOmL乙腈，65°C超聲波提取15min,室溫下4000rpm離心IOmin,取上清液2mL，于50 60°C水浴環境中氮氣吹干，加入ImL樣品稀釋工作液溶解干燥物，充分混勻后用樣品稀釋液再做10倍稀釋，取50 μ L用于分析；(5)預先進行編號，標記Btl、呋喃西林代謝物標準品和樣品的位置，進行雙孔檢測；從包被有呋喃西林代謝物特異性抗體的酶標板上取下所需數量的微孔，將多余的重新密封并放回2 8°C保存；將酶標物稀釋液、樣品稀釋液、清洗液配制成工作液；在Btl孔中加入50 μ L0.0ng/mL呋喃西林代謝物標準品溶液；在各標準孔中加入50 μ L的呋喃西林代謝物標準品溶液，在各樣品孔中加入50 μ L樣品溶液；立即在所有孔中加入100 μ L的咲喃西林代謝物辣根過氧化物酶標記物，晃動反應板1-1Os ;室溫下溫浴30min ;倒掉微孔中的液體，在所有微孔中加滿清洗液；在吸水紙上拍打；用微量移液器在每個微孔中加入100 μ L顯色齊U，晃動酶標板使之徹底混勻，室溫下顯色IOmin ;每孔中加入100 μ L終止液,混勻在450nm下檢測吸光度，分析檢測結果。本發明試劑盒的檢測原理為:將呋喃西林代謝物抗體包被與固相載體上,加入呋喃西林代謝物標準品或樣本并加入酶標記呋喃西林辣根過氧化物酶標記物工作液，待測樣本中的呋喃西林代謝物與酶標記呋喃西林代謝物競爭固相化的呋喃西林代謝物抗體。通過清洗劑除去未結合的酶標記物，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中呋喃西林代謝物的含量呈負相關，與標準曲線比較即可得出呋喃西林代謝物的濃度范圍。本發明的有益效果:本試劑盒主要采用直接競爭酶聯免疫法定性或定量檢測樣品中呋喃西林代謝物的含量，大大縮短了生產周期。對于不同來源的樣品采用相同的前處理方式，即只需進行一次前處理就可以同時檢測四種不同的硝基呋喃類代謝。提高衍生化溫度到60°C，將樣品的處理時間縮短為3小時，無需再過夜處理。室溫下即可進行檢測，無需保溫37°C。顯色液為混合顯色液，無需分次單獨添加，減少了操作程序。此外，本試劑盒的顯色過程無需避光，直接在室內顯色15nin即可。另外主要試劑以工作液形式提供，可以減少檢測的操作步驟，為使用者節省時間并降低因操作步驟冗繁造成的誤差。本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、高精確度、高準確度、對儀器設備要求低、試劑保存期長、自動化程度高、無放射性同位素污染等優點，可在動物源性食品及飼料產品檢測中發揮重要作用。


圖1為呋喃西林代謝物的標準曲線。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步說明。實施例1呋喃西林代謝物免疫原和酶標抗原的合成傅-克烷基化反應活化呋喃西林藥物代謝物制備免疫原:采用4-NP衍生，利用烷基化劑與呋喃西林藥物代謝物反應，在衍生物中引入具有6碳間隔臂的羧基；應用碳二亞胺法(EDC)與血藍蛋白(KLH)偶聯，合成免疫原，透析提純，_20°C保存備用。傅-克?；磻罨秽髁炙幬锎x物制備酶標記抗原:采用4-NP衍生，利用琥珀酸酐為?；瘎?，活化呋喃西林藥物代謝物，引入連有4碳原子的羧基；應用混合酸酐法與HRP反應制備酶標記抗原；透析提純、_20°C保存備用。實例2呋喃西林代謝物多克隆抗體的制備選取6只體重2 2.5kg健康雄性新西蘭大白兔。將免疫原呋喃西林代謝物-KLH偶聯物與等量弗氏完全佐劑通過注射器對抽法混合成油包水的乳濁液，按lmg/kg體重的量進行首次免疫，采取背部皮下多點注射。每隔兩周加強免疫一次，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，計量及方法同首次免疫。從第三次免疫開始，每次免疫后10天，耳緣靜脈取血1ml，進行抗體效價檢測，當抗體效價不再升高時，不加佐劑進行最后一次(第七次)免疫，大腿肌肉注射，7天后頸動脈放血，室溫凝固2h后4°C過夜。8000r/min離心10分鐘，除去血塊，血清部分用50%飽和硫酸銨溶液沉淀，離心去上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸,再用33%飽和硫酸銨溶液沉淀兩次，沉淀物用盡可能少的磷酸緩沖液溶解，經透析后即得呋喃西林代謝物多克隆抗體。實例3呋喃西林代謝物抗血清效價的測定采用直接ELISA法進行測定。酶標板包被抗呋喃西林代謝物抗血清、洗滌、封閉，并以同樣的稀釋度的陰性血清為對照，第I行I至12孔依次加入倍比稀釋的呋喃西林代謝物辣根過氧化物酶標記物，均為IOOuL/孔，22-23°C溫育10分鐘；再加入辣根過氧化物酶(ARP)底物IOOuL/孔，經過10分鐘孵育，終止反應后測定OD45tl值?？寡宓腛D450值與相同稀釋度的陰性血清OD450值之比大于2的最大稀釋度定為呋喃西林代謝物抗血清的效價。經測定呋喃西林代謝物抗血清的效價為1000。實例4棋盤滴定法確定抗體包被濃度和酶標抗原工作濃度通過棋盤滴定法對IC5tl值、最大吸光度值和樣品添加回收率的比較，確定抗體的包被濃度和酶標抗原的工作濃度。
權利要求
1.一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括:呋喃西林代謝物特異性抗體、酶標板、呋喃西林代謝物辣根過氧化物酶標記物、呋喃西林代謝物標準品、酶標物稀釋液、顯色劑、清洗液、終止液和樣品稀釋液。
2.根據權利要求1所述一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的試劑盒，其特征在于，所述呋喃西林代謝物特異性抗體包被在酶標板上。
3.根據權利要求1所述一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的試劑盒，其特征在于，所述呋喃西林代謝物特異性抗體為動物抗呋喃西林代謝物的多克隆抗體，用呋喃西林代謝物與載體蛋白偶聯物作為免疫原通過免疫動物制得。
4.根據權利要求3所述一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的試劑盒，其特征在于，所述動物為兔、鼠或羊。
5.一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的方法，其特征在于，按照如下步驟進行: (1)樣品前處理:對于肌肉、肝臟、魚、蝦的組織，供試樣用均質器均質樣本，取1.0±0.05g的均質物進行以下操作；對于蜂蜜樣品直接稱取1.0±0.05g的供試樣進行以下操作； (2)加入4mL蒸餾水，0.5mLlM鹽酸和150 μ L50mM的4-硝基苯甲醛溶液，渦旋混勻30s，60°C水浴3h,每隔1h潤旋振蕩一次； (3)加入5mL0.1M磷酸氫二鉀和0.4mLlM氫氧化鈉溶液，混勻加入6mL乙酸乙酯，振蕩l-40min,室溫條件下，4000g離心lOmin，收集3mL上層液體至IOmL玻璃試管，50 60°C水浴氮氣吹干； (4)加入1mL正己烷，渦旋混勻30s，然后加入ImL樣品稀釋液復溶，振蕩混勻30s，室溫條件下3000g離心5min棄去上層有機相，取下層水相50 μ L用于分析；對于飼料樣品，稱取1.0±0.05g粉碎的樣本加入1OmL乙腈，65°C超聲波提取15min,室溫下4000rpm離心1Omin,取上清液2mL，于50 60°C水浴環境中氮氣吹干，加入ImL樣品稀釋工作液溶解干燥物，充分混勻后用樣品稀釋液再做10倍稀釋，取50 μ L用于分析； (5)預先進行編號，標記Btl、呋喃西林代謝物標準品和樣品的位置，進行雙孔檢測；從包被有呋喃西林代謝物特異性抗體的酶標板上取下所需數量的微孔，將多余的重新密封并放回2 8°C保存；將酶標物稀釋液、樣品稀釋液、清洗液配制成工作液；在Btl孔中加入50 μ L0.0ng/mL呋喃西林代謝物標準品溶液；在各標準孔中加入50 μ L的呋喃西林代謝物標準品溶液，在各樣品孔中加入50 μ L樣品溶液；立即在所有孔中加入100 μ L的咲喃西林代謝物辣根過氧化物酶標記物，晃動反應板1-1Os ;室溫下溫浴30min ;倒掉微孔中的液體，在所有微孔中加滿清洗液；在吸水紙上拍打；用微量移液器在每個微孔中加入100 μ L顯色齊U，晃動酶標板使之徹底混勻，室溫下顯色1Omin ;每孔中加入100 μ L終止液,混勻在450nm下檢測吸光度，分析檢測結果。
全文摘要
本發明公開了屬于酶聯免疫檢測技術領域的一種利用一步法酶聯免疫技術快速檢測呋喃西林的試劑盒。該試劑盒包括呋喃西林代謝物特異性抗體、酶標板、呋喃西林代謝物辣根過氧化物酶標記物、呋喃西林代謝物標準品、酶標物稀釋液、顯色劑、清洗液、終止液和樣品稀釋液。本發明還公開了利用該試劑盒進行樣品檢測的方法。本試劑盒主要采用直接競爭酶聯免疫法定性或定量檢測樣品中呋喃西林代謝物的含量，大大縮短了生產周期。本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、高精確度、高準確度、對儀器設備要求低、試劑保存期長、自動化程度高、無放射性同位素污染等優點，可在動物源性食品及飼料產品檢測中發揮重要作用。
文檔編號G01N33/544GK103197058SQ201310065400
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月1日 優先權日2013年3月1日
發明者李亮, 徐華莉, 王旻子, 張明洲, 魏建良, 程曄 申請人:杭州迪恩科技有限公司