一種三層結構的肌酸酐含量檢測試劑的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種三層結構的肌酸酐含量檢測試劑的制備方法，包括肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶，熒光染料5（6）-羧基-2,7-二氯二氫熒光素二特戊酸酯，包括染料底層、蛋白酶固定層、頂層保護層。本發明所使用的方法具有高度的選擇性，作為蛋白質酶，其對反應物具有高度的特異性，肌酸酐酶只能催化肌酸酐的水解反應，對其他的反應底物都沒有催化活性，由于檢測過程中涉及到三種高度特異性的酶，本方法的選擇性更是呈指數增加，試劑盒最后給出的響應是熒光響應，相與某些檢測顏色變化的方法相比，熒光響應的固有特性賦予本發明更高的靈敏度以及抗干擾的能力。
【專利說明】—種三層結構的肌酸酐含量檢測試劑的制備方法
[0001]本申請是一種肌酸酐含量檢測試劑和試劑盒，及試劑盒的制作和使用方法的分案申請，原申請申請日2011年9月20日，原申請號:2011102799693，發明創造名稱:一種肌酸酐含量檢測試劑和試劑盒，及試劑盒的制作和使用方法。
【技術領域】
[0002]本發明屬于肌酸酐檢測領域，尤其是一種肌酸酐含量檢測試劑和試劑盒，及試劑盒的制作和使用方法。
【背景技術】
[0003]肌酸酐是磷酸肌酸代謝的產物，其化學結構是肌酸通過脫水縮合形成的內酰胺。肌酸酐一般存在于血液中，通過血液循環到達腎臟并被過濾掉。對于腎功能正常的人群來說，血液中的肌酸酐濃度因人因地而異。一般而言，在無大體力負擔的情況下，女性的血液中的肌酸酐濃度在45-60 μ M ;男性的血液肌酸酐濃度在60-110 μ M的范圍內浮動。當腎功能出現問題時，腎臟過濾清除肌酸酐的能力就會降低，導致血液中肌酸酐的濃度異常升高而尿液中肌酸酐濃度降低，因此通過測量血液和尿液中肌酸酐的濃度，就可以測量肌酸酐清除率甚至腎小球率過濾，這兩個參數對于衡量腎功能具有重要的意義，因此，可以快捷的測量血液和尿液中的肌酸酐濃度，對于臨床和科研，都具有十分重大的應用前景。
[0004]肌酸酐的測量比較困難。目前常用的方法是質譜法(同位素稀釋質譜法)、高效液相色譜法、液相色譜-質譜連用法以及抗體檢測(ELISA)，這些方法一般都需要昂貴的儀器，如質譜儀、液相色譜儀或酶標儀等，以及受過系統訓練的分析化學操作人員的操作，極大地提高肌酸酐測量的經濟成本和時間成本，以及肌酸酐測量在邊遠地區的應用。
[0005]質譜法通過在樣品中人為加入含有某種同位素(如0-18)的肌酸酐并對此樣品進行質譜分析。比對質譜結果中0-18的豐度和0-18在自然界中的豐度即可計算出肌酸酐的濃度。人為加入的肌酸酐可以嚴格控制，作為一種內標準(internal calibration),這種方法可以有效的降低誤差。根據最新研究，用質譜法得到的肌酸酐濃度偏低，這將在臨床上引起一系列問題，美國FDA也開始考慮新的肌酸酐檢測手段。
[0006]液相色譜法是在質譜的基礎上使用高效液相色譜對樣品進行純化并用質譜進行檢測。質譜法和液相色譜法無法自動化、操作復雜，并且需要分析團隊對儀器進行操作和維護，而ELISA法需要使用價格昂貴的酶標儀，雖然其靈敏度極高，但是選擇性較差，經常會高估肌酸酐的濃度，導致臨床用藥的過量或不足。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種選擇性高、靈敏度高和使用方便的肌酸酐含量檢測試劑和試劑盒，及試劑盒的制作和使用方法。
[0008]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
[0009]一種肌酸酐含量檢測試劑，包括肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶，熒光染料5 (6)-羧基-2，7- 二氯二氫熒光素二特戊酸酯，肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成為肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸隨之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的過氧化氫，在辣根氧化物酶的催化下，過氧化氫催化氧化了 5
(6)-羧基-2，7- 二氯二氫熒光素二特戊酸酯并生成具有熒光響應的產物，通過監測熒光增強的速率以及標準曲線，獲得肌酸酐濃度，其中所述肌酸酐酶:肌酸酶:肌氨酸氧化酶:辣根過氧化物酶:熒光染料的重量比為:1:50:60:5。
[0010]而且，包括如下三層結構:
[0011]⑴染料底層:將熒光染料修飾過的纖維素和D4水凝膠混合并攪拌，在一張干凈的塑料薄膜上用刮刀涂膜機涂上一層D4水凝膠的薄膜并使之自然風干；
[0012]⑵蛋白酶固定層:在PVA-Sbq (聚丙烯醇-苯基吡啶乙烯絡合物)的水溶液中加入10%的牛血清蛋白以及反應所需的肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶，攪拌25-40分鐘以上，用刮刀涂膜機涂上一層酶的PVA-Sbq溶液，將紫外燈置于膜層的上方30分鐘，使苯基吡啶乙烯交聯并使膜層變干；
[0013]⑶頂層保護層:最后在上面用刮刀涂膜機涂上一層含有10%炭黑的D6水凝膠，并使膜層自然風干。
[0014]而且，三層結構的具體制備步驟如下:
[0015]⑴將176mg纖維素固定的5 (6)-羧基_2，7_ 二氯二氫突光素二特戍酸酯和2.6g的4%D4水凝膠溶液混合并攪拌均勻，使纖維素粉末在溶液中均勻分散；
[0016]⑵將步驟⑴中所制備的溶液均勻在塑料薄膜上使之形成一層厚度為IOOuM的薄月旲并晚干；
[0017]⑶將30mg肌酸酶、35mg辣根過氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g濃度為10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上攪拌均勻；
[0018]⑷在步驟⑵中制備的薄膜上涂上步驟⑶中所制備的PVA-Sbq/酶溶液，膜層的厚度為100 μ m,將薄膜置于紫外燈下30分鐘；
[0019](5)在步驟⑷中所制備的薄膜上涂上一層含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然風干。
[0020]一種肌酸酐含量檢測試劑盒，包括上述的檢測試劑。
[0021]一種肌酸酐含量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于:步驟如下:
[0022]⑴將176mg纖維素固定的5 (6)-羧基_2，7_ 二氯二氫突光素二特戍酸酯和2.6g的4%D4水凝膠溶液混合并攪拌均勻，使纖維素粉末在溶液中均勻分散；
[0023]⑵將步驟⑴中所制備的溶液均勻在塑料薄膜上使之形成一層厚度為IOOuM的薄月旲并晚干；
[0024]⑶將30mg肌酸酶、35mg辣根過氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g濃度為10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上攪拌均勻；
[0025]⑷在步驟⑵中制備的薄膜上涂上步驟⑶中所制備的PVA-Sbq/酶溶液，膜層的厚度為100 μ m,將薄膜置于紫外燈下30分鐘；
[0026](5)在步驟⑷中所制備的薄膜上涂上一層含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然風干。
[0027]一種試劑盒的使用方法，其特征在于:在含有IOOmM HEPES, 150mM氯化鈉，5mM氯化鉀，1.3mM氯化鈣的緩沖液中，pH7.3，加入不同濃度肌酸酐，用毛細管兩驅150 μ L的樣品溶液并安插在試劑盒上并用熒光儀開始測量。
[0028]本發明的優點和有益效果為:
[0029]1、本發明所使用的方法具有高度的選擇性，作為蛋白質酶，其對反應物具有高度的特異性，肌酸酐酶只能催化肌酸酐的水解反應，對其他的反應底物都沒有催化活性，由于檢測過程中涉及到三種高度特異性的酶，本方法的選擇性更是呈指數增加，試劑盒最后給出的響應是熒光響應，相與某些檢測顏色變化的方法相比，熒光響應的固有特性賦予本發明更高的靈敏度以及抗干擾的能力。
[0030]2、本申請提供了一種新型的用于檢測血液和尿液中肌酸酐含量的試劑盒，本試劑盒將對肌酸酐具有特異性的酶以及對過氧化物敏感的熒光染料固定在試劑盒上，并將酶催化的反應轉化為熒光信號并得以檢測，本試劑盒可以檢測出ΙΟμΜ以上的肌酸酐，符合臨床上的使用要求。
[0031]3、本發明所使用的酶共有四種:肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶，樣品中的肌酸酐通過前三種酶被降解為甘氨酸，同時生成少量的過氧化氫，在辣根過氧化物酶的催化下，過氧化氫可以氧化一種原本沒有熒光的分子，反應產物是熒光素的衍生物，具有較強的熒光響應，通過檢測熒光的增強速率，可以檢測到過氧化氫的生成速率，并間接計算出肌酸酐的濃度。
[0032]4、本發明對現有的肌酸酐檢測技術以及本申請所闡述的試劑盒進行了比較，作為腎功能的重要參數，肌酸酐清除率和腎小球率過濾的肌酸需要多次進行血液和尿液的肌酸酐測量，因此，本申請所提及的 肌酸酐試劑盒所具有的使用簡單、價格低廉且具有高度選擇性的特點將具有十分重大的意義。
[0033]表1現有肌酸酐檢測方法的比較
【權利要求】
1.一種三層結構的肌酸酐含量檢測試劑的制備方法，其特征在于: 檢測試劑包括:肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶，熒光染料5(6)-羧基-2，7- 二氯二氫熒光素二特戊酸酯，肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成為肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸隨之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的過氧化氫，在辣根氧化物酶的催化下，過氧化氫催化氧化了 5 (6)-羧基-2，7- 二氯二氫熒光素二特戊酸酯并生成具有熒光響應的產物，通過監測熒光增強的速率以及標準曲線，獲得肌酸酐濃度，其中所述肌酸酐酶:肌酸酶:肌氨酸氧化酶:辣根過氧化物酶:熒光染料的重量比為:1:50:60:5 ； 三層結構為: ⑴染料底層:將熒光染料修飾過的纖維素和D4水凝膠混合并攪拌，在一張干凈的塑料薄膜上用刮刀涂膜機涂上一層D4水凝膠的薄膜并使之自然風干； ⑵蛋白酶固定層:在PVA-Sbq (聚丙烯醇-苯基吡啶乙烯絡合物)的水溶液中加入10%的牛血清蛋白以及反應所需的肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶，攪拌25-40分鐘以上，用刮刀涂膜機涂上一層酶的PVA-Sbq溶液，將紫外燈置于膜層的上方30分鐘，使苯基吡啶乙烯交聯并使膜層變干； ⑶頂層保護層:最后在上面用刮刀涂膜機涂上一層含有10%炭黑的D6水凝膠，并使膜層自然風干； 三層結構的具體制備步驟如下: ⑴將176mg纖維素固定的5 (6)-羧基-2，7- 二氯二氫突光素二特戍酸酯和2.6g的4%D4水凝膠溶液混合并攪拌均勻，使纖維素粉末在溶液中均勻分散； ⑵將步驟⑴中所制備的溶液均勻在塑料薄膜上使之形成一層厚度為IOOuM的薄膜并晾干； ⑶將30mg肌酸酶、35mg辣根過氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g濃度為10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上攪拌均勻；⑷在步驟⑵中制備的薄膜上涂上步驟⑶中所制備的PVA-Sbq/酶溶液，膜層的厚度為100 μ m,將薄膜置于紫外燈下30分鐘； (5)在步驟⑷中所制備的薄膜上涂上一層含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然風干。
2.一種肌酸酐含量檢測試劑盒，其特征在于:包括權利要求1所述制備的三層結構的肌酸酐含量檢測試劑。
【文檔編號】G01N33/70GK103472239SQ201310363461
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2011年9月20日 優先權日:2011年9月20日
【發明者】徐維琛, 朱進清, 高玉蘭, 程志敬 申請人:天津希恩思生化科技有限公司