檢測齲齒蛋白的質譜模型及構建方法
【專利摘要】本發明提供了一種用于檢測齲齒特征蛋白的質譜模型，該質譜模型包括質荷比為3324.8m/z、3186.2m/z和3195.8m/z的峰，模型中表征為質荷比3324.8m/z、3186.2m/z和3195.8m/z的蛋白是齲齒唾液特征蛋白，當3324.8m/z、3186.2m/z、3195.8m/z的峰下調表達時預示為齲齒易感人群。本發明的質譜模型，可用于齲齒易感性篩查，方法簡單易于操作，準確性高，為齲齒易感性篩查提供了新的思路。
【專利說明】檢測齲齒蛋白的質譜模型及構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及齲齒檢測領域，為一種全新的非入侵性檢測方法，在體外對齲齒進行早期的發現和檢測。
【背景技術】
[0002]蛀牙，有時也有人叫它蟲牙，學名齲齒。其主要形成原因是牙菌斑。牙菌斑是牙齒表面的一層幾乎無色的薄膜，含有造成齲齒的細菌。每次進食后，牙菌斑中的這些細菌會和食物中的糖分或淀粉發生化學作用，產生腐蝕牙齒的酸性物質。久而久之，牙齒的琺瑯質便會破壞，形成比較脆弱的小蛀斑，若繼續惡化則會形成牙洞，即蛀牙。所以，蛀牙是從小蛀斑發展而來的，不是真的有蛀蟲或什么其他蟲子，而是牙齒被逐漸腐蝕的結果。蛀牙在嚴重情況下，會導致牙齒的壞死和脫落。
[0003]蛀牙是非常嚴重的問題。如果置之不理，蛀牙能破壞牙齒并破壞牙齒的中央神經，從而導致膿腫，也就是牙根頂端的局部感染。一旦膿腫形成，只能通過牙根管療法、外科手術或拔除牙齒進行治療。“牙疼不是病，疼起來真要命”一直是廣為流傳的一句俗語，但其實并不科學，因為牙疼是一種口腔疾病的癥狀，尤其是在得了蛀牙的情況下，那真是吃不下，睡不著，自己難受，家人也很心疼。千萬不能有等一等，算了吧的觀念?！把捞鄄皇遣　钡挠^點不僅是錯誤的，而且會耽誤治療，造成蛀牙惡化，牙齒壞死，而且還有可能導致更多蛀牙的產生。真要是到了疼得實在受不了的階段，有時就連牙醫也幫不上忙，那真是小洞不補，大洞吃苦。
[0004]目前蛀牙或齲齒的檢測仍然停留在臨床表征檢測水平，缺乏早期預警的技術手段。近年來也出現了一些新型檢測技術，如:中國專利申請2007800288750、“唾液分析”公開了一種利用核磁共振譜技術鑒定口腔生物代謝物的方法，包括:收集個體唾液樣本，從中獲得個體數字化核磁共振光譜，將個體光譜與電腦中的參考模型進行比對，以間接測定口腔健康，其中光譜測定峰為甲醇、`膽堿、亮氨酸等有機或無機物。由于該方法針對口腔健康相關的代謝物(如甲醇、膽堿、亮氨酸等有機或無機物)，盡管其在一定程度上能表征該口腔健康的特征圖譜，但由于所述代謝物與口腔健康并不存在唯一對應性，且所述口腔健康范圍缺乏確定的標準，因此其得到的圖譜實質上是上述各種分子的圖譜集合，因此既需要處理和比對的圖譜信息量過大，并且因待檢分子過于龐大而導致其圖譜特征性(即口腔健康特征性)偏低，只適用于基礎研究而無法推廣到實際應用中。
[0005]基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALD1-T0F-MS)是近年來發展起來的一種新型的軟電離生物質譜，其原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質荷比(M/Z)與離子的飛行時間成正比，檢測離子。盡管MALD1-T0F的準確度高達0.1%~0.01%,遠遠高于目前常規應用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術，但在疾病標志物尤其是齲齒的應用中仍然存在一些缺陷。作為最接近的現有技術，王國云等人報道蛋白質組學在口腔醫學中的研究進展(中華口腔醫學雜志，2006年05期)，其中比較了口腔正常牙體組織和唾液蛋白質組學，并分析了口腔病原菌的可能的特征蛋白。然而，該報道僅僅公開了可以使用包括基質輔助激光解析電離飛行時間質譜在內的質譜分析法對口腔疾病進行研究，但并未公開任何具體的口腔疾病特征蛋白或標記物，因此國內迄今為止尚無采用MALD1-TOF-MS技術獲得檢測齲齒標志物或齲齒唾液特征蛋白的報道。
[0006]因此目前需要新的齲齒的鑒定和分析方法(如質譜法)來實現快速、準確、廉價、便捷的分類結果。

【發明內容】

[0007]本發明目的是為了建立一種對齲齒易感性標志物或齲齒唾液特征蛋白的檢測技術，提出一種用于檢測齲齒唾液特征蛋白的質譜模型及其制備方法。
[0008]本發明的第一個目的是提供一種用于檢測齲齒特征蛋白的唾液特征蛋白組合，由表征質荷比為3324.8m/z、3186.2m/z、3195.8m/z的齲齒特征蛋白組成，其中氨基酸序列分別如 SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2、SEQ ID N0.3 所示:
[0009]SEQ ID N0.1:Lys-Met-Thr-Glu-Ala-Gln-Glu-Asp-Gly-Gln-Ser-Thr-Ser-Glu-Leu-1Ie-Gly-Gln-Phe-Gly-Val-Gly-Phe-Tyr-Ser-Ala-Phe-Leu-Val-Ala-Asp-Lys-Val ；
[0010]SEQ ID N0.2:Lys-Ser-Ser-Ser-Tyr-Ser-Lys-Gln-Phe-Thr-Ser-Ser-Thr-Ser-Tyr-Asn-Arg-Gly-Asp-Ser-Thr-Phe-Glu-Ser-Lys-Ser-Tyr-Lys-Met-Ala ；
[0011]SEQ ID N0.3 !Gln-Asp-Glu-Pro-Pro-Gln-Ser-Pro-Trp-Asp-Arg-Val-Lys-Asp-Leu-Ala-Thr-Val-Tyr-Val-Asp-Val-Leu-Lys-Asp-Ser-Gly-Arg-Asp-Tyr ；
[0012]在一個實施方案中，當3324.8m/z、3186.2m/z、3195.8m/z的峰都下調表達時表示該特征蛋白在齲齒易感人群中均`低表達。
[0013]本發明的第二個發明目的是提供一種用于檢測齲齒易感性特征蛋白的質譜模型，該質譜模型包括上述質荷比為3324.8m/z、3186.2m/z和3195.8m/z的齲齒唾液特征蛋白，其氨基酸序列分別如SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2、SEQ ID N0.3所示，其中3324.8m/z、3186.2m/z、3195.8m/z特征蛋白的表達都下調，預示為齲齒易感性患者。
[0014]本發明的第三個發明目的是提供一種用于檢測齲齒易感人群的試劑盒，其包含上述的唾液特征蛋白組合，或包含上述的質譜模型。
[0015]在一個實施方案中，該試劑盒由WCX磁珠、磁珠緩沖液、洗滌液和多肽洗脫液組成，其中所述磁珠、磁珠緩沖液、洗滌液和多肽洗脫液可以使用市售試劑盒或相關試劑，如美國Bruker公司研制的WCX磁珠試劑盒，或毅新興業公司研制的SPE-C磁珠試劑盒(專利號 ZL2008101879684)。
[0016]在另一實施方案中，該試劑盒還包括含有上述齲齒唾液特征蛋白的標準質譜樣品管，該樣品管既可以是含有單一特征蛋白的三種樣品管，也可以是含有三種特征蛋白的一種樣品管，所述標準樣品管中的樣品用于與待測樣品進行質譜時進行平行質譜測試，以判斷待測樣品中是否含有所述齲齒唾液特征蛋白。
[0017]在另一個實施方案中，該試劑盒可含有上述齲齒唾液特征蛋白的標準數據庫(gp齲齒特征蛋白數據庫)的軟件或芯片，可用于待測樣品進行質譜時提供標準數據或曲線的比對，以判斷待測樣品中是否含有所述齲齒唾液特征蛋白。
[0018]本發明的第四個發明目的是提供所述唾液特征蛋白組合，或所述的質譜模型，在制備診斷齲齒易感人群試劑中的用途。
[0019]本發明的第五個發明目的是提供制備所述的質譜模型的構建方法，包括:
[0020]I)收集多例臨床確診的齲齒患者唾液和正常對照人員的唾液作為兩組唾液標本，進行低溫冷凍備用；
[0021]2)對唾液蛋白進行質譜前預處理；
[0022]3)對預處理過的兩組唾液蛋白進行質譜檢測讀取，獲得兩組唾液多肽的指紋圖譜；
[0023]4)對所有的齲齒患者和正常人唾液多肽的指紋圖譜進行標準化處理，并收集數據；
[0024]5)對所得數據進行質控處理，篩選出具有下列質荷比峰的三個齲齒特征蛋白:3324.8m/z、3186.2m/z和3195.8m/z，對所述特征蛋白進行多肽序列測定，并根據這三個質荷比峰建立檢測齲齒易感性篩查的質譜模型。
[0025]在一個實施方案中，其中步驟2)預處理的方法包括使用磁珠純化和穩定樣品中的血清蛋白或多肽。
[0026]在一個實施方案中，其中所述步驟3)采用WCX磁珠系統或試劑盒對兩組血清蛋白進行吸附，并對結合在弱陽離子上的兩組血清多肽進行讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖
-1'TfeP曰。
[0027]在一個實施方案中，其中所述步驟5)所述的質控處理，保留出峰數量大于50的質譜圖譜數據，并采用Sigma血清的組內變異系數來保證實驗的一致性，從而根據變異系數滿足一致性的允許范圍來進行篩選，所述變異系數為14.9%。
[0028]本發明結合生物信息學方法篩選出相應的齲齒標志物并建立檢測模型進行分析檢測，所述的生物信息學方法包括對指紋圖譜進行標準化處理、對所得數據進實驗質控處理、篩選期望的唾液特征蛋白并建立質譜模型，以及可選擇地包括使用遺傳算法結合最近鄰算法建立并驗證質譜模型等。其中，所述的實驗質控處理，保留出峰數量大于50的質譜圖譜數據，并采用Sigma標準品的組內變異系數來保證實驗的一致性，從而根據變異系數滿足一致性的允許范圍來進行篩選。本發明中，變異系數優選為14.9%。
[0029]技術效果
[0030]I)本發明采用齲齒患者與正常人具有差異的多個特征蛋白組合進行對齲齒唾液的檢測，并采用了傳統統計學與現代生物信息學方法相結合的方法進行數據處理，從而得到齲齒患者和健康人唾液蛋白質指紋圖譜檢測模型，并且所發現的一系列蛋白質質荷比峰為尋找新的更理想的標志物提供了基礎和資源。
[0031]2)與以往的唾液學檢測方法比較具有較高的敏感性和特異性，并能用于篩選抗齲齒的藥物中。
[0032]3)本發明模型的構建方法設計合理可行，為提供齲齒的臨床治愈率提供了新的篩查方法，同時也為探索齲齒發生發展的機制提供了新的思路。
[0033]4)利用本發明分析了唾液標準樣品和臨床待測樣本，驗證結果顯示:9例標準樣本檢出率達100.00%, 30例待測樣本檢出率達93.3%，因此本發明可對齲齒做出易感性的判斷。
[0034]綜合所述，本發明檢測齲齒特征蛋白的質譜標記，可用于建立唾液特征蛋白質譜模型以及應用于在齲齒早期檢測和篩查，本發明的質譜模型，可用于齲齒的早期檢測和篩查。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1-A為部分健康人唾液的多肽圖譜
[0036]圖1-B 為 3000-4000M/Z 局部放大圖。
[0037]圖2-A為部分齲齒患者唾液的多肽圖譜。
[0038]圖2-B 為 3000-4000M/Z 局部放大圖。
[0039]圖3為3324.8m/z兩組間差異峰展示，其中箭頭所示灰色線條為健康人峰值，右側黑色線條為齲齒人峰值。
[0040]圖4為3186.2m/z兩組間差異峰展示，其中箭頭所示灰色線條為健康人峰值，該峰值的下方黑色線條為齲齒人峰值。
[0041]圖5為3195.8m/z兩組間差異峰展示，其中箭頭所示所示灰色線條為健康人峰值，該峰值的下方黑色線條為齲齒人峰值。
【具體實施方式】
[0042]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
`[0043]實施例1齲齒易感性質譜模型的建立
[0044]1.樣本和儀器:
[0045]選自29例唾液樣本，其中14例來自齲齒患者，另外15例來自健康人群，齲齒患者均經病理報告確定。所有的唾液樣本均在清晨未進食前空腹下抽取，分離唾液后儲存在-80低溫冰箱中。
[0046]基質輔助激光解析飛行時間質譜CLIN-TOF及實驗用的WCX磁珠試劑盒由中國Bioyong公司研制。使用Bioyong公司的數據分析軟件Bioexplorer做數據的預處理,處理后的數據采用統計分析軟件R2.6.2的遺傳算法包genalg進行處理。
[0047]2.技術路線:
[0048]唾液的采集:收集唾液在BD管中。緩慢地上下振蕩管五次，使唾液混勻。室溫下，用臨床離心機以1.400-2.0OOg離心SST管十分鐘。吸取唾液(上清液)到對應的已標記管中。標記干凈的0.5ml離心管，同一唾液樣品50 μ I —管，分裝多管。立即凍存唾液樣品于_80°C。由于反復凍融唾液樣品易造成多肽沉淀，從而使得肽譜丟失部分多肽，應避免反復凍融。凍存唾液分為永久保存和待分裝的。唾液分裝后可在_80°C保存多年。
[0049]唾液樣品的磁珠處理:在進行實驗前，從低溫冰箱提取分裝的唾液樣品各I管，放于濕冰上?；瘍?0 - 90分鐘。取出10 μ I磁珠結合緩沖液(BS)，10 μ I混勻的磁珠懸浮液，5μ I唾液樣品至樣品管，混勻。室溫靜置5min后，將樣品管放入磁珠分離器。使磁珠貼壁I分鐘，磁珠與懸浮的液體分離，吸去懸浮的液體，再向樣品管中加入100 μ I磁珠清洗緩沖液(WS)，在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復移動樣品管10次。最后一次使樣品管在磁珠分離器上靜置，磁珠與懸浮的液體分離，吸去懸浮的液體。重復從加100 μ I磁珠清洗緩沖液，到最后吸去懸浮液體的操作步驟共3次。從磁珠分離器上取下樣品管，并向樣品管中加入5 μ I磁珠洗脫緩沖液(ES)，溶解貼壁的磁珠，樣品管放入磁珠分離器，磁珠貼壁2min，磁珠與懸浮的液體充分分離后，將上清液移入干凈的剛加入5μ I磁珠穩定緩沖液(SS)0.5ml
樣品管。
[0050]3.生物信息學方法
[0051](一)質譜數據采集
[0052]應用CLIN-TOF質譜儀。激光能量50%時，IOshots去雜，36%時50shots采集一個樣品結晶點的某一個點，平均每個樣品結晶點收集8次共400shots。激光頻率:50Hz。數據收集范圍:l_10KDa。在每8個樣品結晶點收集數據前用標準品進行外標校正，平均分子量偏差小于lOOppm。參見圖1-A、2-A、圖1-B和2-B，其中圖1-A和2-A分別為健康人和患者唾液多肽指紋譜圖，其中圖1-B和2-B均為M/Z=3000-4000的局部放大圖。
[0053]實驗質控:(I)對于每一張采集到的原始圖譜，我們設定S/N>=5的峰數量做為評判圖譜質量的一個標準；對于峰數量大于50的圖譜才保存，舍棄峰數量小于50的圖譜。(2)針對整個實驗操作，采用Sigma標準品的組內變異系數保證實驗的一致性，本實例方法的變異系數為14.9%，滿足一致性允許范圍為變異系數小于20%，說明實驗一致性良好，參見表1。表1為Sigma唾液中9個蛋白峰的變異系數值。
[0054]表1Sigma標準品的組內變異系數
[0055]
【權利要求】
1.用于檢測齲齒特征蛋白的唾液特征蛋白組合，由表征質荷比為3324.8m/z、3186.2m/z、3195.8m/z的齲齒特征蛋白組成，其中氨基酸序列分別為SEQ ID N0.1、SEQIDN0.2、SEQ ID N0.3，如下所示:
SEQ ID N0.1:Lys-Met-Thr-Glu-Ala-Gln-Glu-Asp-Gly-Gln-Ser-Thr-Ser-Glu-Leu-1Ie-Gly-Gln-Phe-Gly-Val-Gly-Phe-Tyr-Ser-Ala-Phe-Leu-Val-Ala-Asp-Lys-Val ；
SEQ ID N0.2:Lys-Ser-Ser-Ser-Tyr-Ser-Lys-Gln-Phe-Thr-Ser-Ser-Thr-Ser-Tyr-Asn-Arg-Gly-Asp-Ser-Thr-Phe-Glu-Ser-Lys-Ser-Tyr-Lys-Met-Ala ；
SEQ ID N0.3:Gln-Asp-Glu-Pro-Pro-Gln-Ser-Pro-Trp-Asp-Arg-Val-Lys-Asp-Leu-AIa-Thr-Val-Tyr-Val-Asp-Val-Leu-Lys-Asp-Ser-Gly-Arg-Asp-Tyrο
2.權利要求1所述的特征蛋白組合，其中當3324.8m/z、3186.2m/z、3195.8m/z的峰都下調表達時表示該特征蛋白在齲齒易感人群中均低表達。
3.用于檢測齲齒特征蛋白的質譜模型，包括權利要求1和2所述的唾液特征蛋白。
4.一種用于檢測齲齒易感人群的試劑盒，其包含權利要求1和2所述的唾液特征蛋白組合，或包含權利要求3所述的質譜模型。
5.權利要求1和2所述唾液特征蛋白組合，或權利要求3所述的質譜模型，質譜模型在制備診斷齲齒易感人群試劑中的用途。
6.制備權利要求3所述質譜模型的方法，包括如下步驟: 1)收集多例臨床確診的齲齒患者唾液和正常對照人員的唾液作為兩組唾液標本，進行低溫冷凍備用； 2)對唾液蛋白進行質譜前預處理； 3)對預處理過的兩組唾液蛋白進行質譜檢測讀取，獲得兩組唾液多肽的指紋圖譜； 4)對所有的齲齒患者和正常人唾液多肽的指紋圖譜進行標準化處理，并收集數據； 5)對所得數據進行質控處理，篩選出具有下列質荷比峰的三個齲齒特征蛋白:3324.8m/z、3186.2m/z和3195.8m/z，對所述特征蛋白進行多肽序列測定，并根據這三個質荷比峰建立檢測齲齒易感性篩查的質譜模型。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于， 其中步驟2)預處理的方法包括使用磁珠純化和穩定樣品中的血清蛋白或多肽。
8.如權利要求5所述的方法，其中所述步驟3)采用WCX2芯片對兩組血清蛋白進行吸附，并對結合在弱陽離子WCX2芯片上的兩組血清蛋白進行讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜。
9.如權利要求5所述的方法，其中所述步驟5)所述的質控處理，保留出峰數量大于50的質譜圖譜數據，并采用Sigma血清的組內變異系數來保證實驗的一致性，從而根據變異系數滿足一致性的允許范圍來進行篩選，所述變異系數為14.9%。
【文檔編號】G01N30/72GK103483442SQ201310368422
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年8月22日 優先權日:2013年8月22日
【發明者】張學記, 馬慶偉, 李燕, 劉曉霏, 林燕 申請人:向華