一種快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法及其裝置制造方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法，此方法主要基于離體葉片經不同溫度和及光強的處理，隨后經過一定時間的暗恢復，期間動態監測葉片Fv/Fm熒光參數值，通過繪制處理條件下的Fv/Fm熒光動力學曲線及分析樣本處理后Fv/Fm的下降比值與恢復后Fv/Fm的上升比值確定植株植株不可逆光損傷的溫度范圍。本發明不破壞植物生長，便于在不同溫度和光照條件下平行的檢測植株葉片光損傷及恢復的狀況，進而確定植株光強和溫度適應范圍并判斷不同植株抗性差異。本發明還公開了一種實現快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法的裝置，通過改變光源與樣品間距離實現光照強度的控制，可以實現對光照強度的連續的控制且在光強改變的同時保證光質恒定不變。
【專利說明】一種快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法及其裝置

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法及其裝置，具體涉及一 種基于葉綠素熒光（Fv/Fm)參數測定的判定植株的極端光強和溫度的方法，屬于植物環境 脅迫【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 植物的生長發育依賴于外界的光照、溫度、水分和土壤等條件。然而相較于水分和 土壤的因素，植物的葉片對光照和溫度的反應是最直接且敏感的。光照是植物光反應過程 中的能量的來源，開啟植物的光合作用的過程。溫度決定光和反應過程中相關酶的活性，是 暗反應過程中的主要限制因子。適宜的溫度和光強有利于維持光合作用中光反應與暗反應 動態平衡，確保植株正常生理活動。光照強度存在明顯是時間和空間的異質性，表現為正午 時光照強度達到最高值而在早晨和傍晚光照強度較低，同時林分不同冠層的光照強度存在 明顯的差異，頂層的光照強度最強而林下光照強度最弱。溫度的分布同樣存在明顯的時空 變化，夏季中午的氣溫達到最大值，同時緯度和海拔與溫度存在顯著的相關性，高緯度高海 拔地區溫度明顯低于其他地區。不同地區的植株因長期適應于一定光照和溫度的生境，植 株呈現不同程度光強和溫度的適應性。因此，在植株的栽培管理的過程中，了解植株的溫度 及光強的適應范圍，有利于了解植株的推廣和栽培的范圍及相關栽培措施的制定。
[0003] 近年來隨著溫室效應的加劇，已造成全球溫度的升高和異常溫度的頻發。春季和 夏季異常的高溫以及冬季和春季的異常低溫，勢必造成植株的光抑制；嚴重脅迫下便會引 起植株的光損傷并出現葉片失綠枯黃的現象。因此去頂植株的光強和溫度的適應范圍，有 利于在極端環境條件出現時，制定和采取相關的措施，維持植株的正常生長。
[0004] 前人在研究植物溫度和光強的適應性時，多采用將植株置于自然條件或人工的條 件下，進行溫度和光照的處理，處理的過程中測定相關的指標及參數，其中包括：顯微及超 微結構，電導率，半致死溫度等參數。在自然的條件下，不能進行溫度和光強參數的控制，所 以僅能對不同植株在脅迫條件下適應性的差異的比較。在人工氣候室中，通過對于溫度和 光強參數的設定，實現植物在不同脅迫條件下適應性差異的比較。然而人工控制光照和溫 度，通常需要在人工氣候室內進行。但是人工氣候室搭建的造價較高，因此很難實現在不同 溫度和光照的條件下進行多組的平行實驗。在人工的條件下，溫度的精準控制往往是較易 的，但是很難實現對光強的精準控制。主要由以下幾點原因 ：1)人工氣候室內的光源一般 為點光源，因此距離光源不同位置的光照強度存在顯著的變化；2)由于植株樹度隨冠結構 及葉片朝向的差異，很難保證每片葉子所接受的光強一致。因此，在同一處理條件下，脅迫 處理的相關指標在各個樣本內存在較大的差異。顯然上述的研究方法需要對大量的盆栽樣 本進行平行的脅迫處理，實驗的周期較長；同時脅迫的條件下植株的生長遭受嚴重影響，實 驗過程中采用的設備造價高，難以大規模的推廣。尤其在初步確定某些珍貴稀有的品種的 推廣范圍的過程中，采用一種基于大范圍準確控制離體葉片環境參數，模擬一天過程中葉 片光脅迫及暗恢復過程，通過不同時間熒光參數測定，進而推斷植株光強和溫度的適應范 圍。
[0005] 植物在脅迫的條件下，光系統II(PSII)是整個光合作用過程中最為敏感的部 分。葉綠素熒光參數是一組用于描述植物光合作用機理和光合生理狀況的變量或常數 值，被視為是研究植物光合作用與環境關系的內在探針，是反應中心PSII的生物學功能 的重要參數，其中包括：1)初始突光（minimal fluorescence, Ftl),是光系統II (PSII)反 應中心初一完全開放時的熒光產量，與葉片葉綠素濃度有關；2)最大熒光產量（maximal fluorescence，F m)，是PSII反應中心處于完全關閉時的熒光產量。可反映通過PSII的電子 傳遞情況；3)可變突光（variable fluorescence, Fv = Fm-Ftl)反映了 Qa的還原情況。4)PSII 最大光化學量子產量（optimal/maximal photochemical efficiency of PSII in dark ;Fv/ Fm)，反映 PSII反應中心內光能轉換效率（intrinsic PSII efficiency)。在適宜的條件下， 葉片的Fv/Fm參數僅與植株的種類及葉齡有關，同時離體葉片處于適宜條件下，葉片F v/FmS 數值在短時間內并不會出現明顯的變化；然而葉片置于脅迫的狀態下，PSII反應中心部分 失活，Fv/F mS數值呈現顯著的下降。然而，非生物脅迫對于光合機構的影響不僅包括其對 光合機構的傷害程度，還包括逆境消除后光系統活性的恢復情況，其中以光抑制后PSII反 應中心恢復的研究最為廣泛。脅迫處理后，經過一定時間的恢復，失活的PSII反應中心結 合新生的Dl蛋白，PSII的活性恢復，同時F v/Fm參數恢復至初始值（脅迫前）；當脅迫條件 超出閾值，脅迫產生的活性氧破壞Dl蛋白的轉錄因子，導致Dl蛋白合成受阻，PSII的活性 不能恢復，F v/Fm參數顯著低于初始值（脅迫前）。植株長時間生長于上述的環境中，必然造 成光合機構的破壞，植株生長不良甚至死亡的現象。
[0006] 因此，在人工控制光照和溫度的條件下，同過Fv/Fm參數的測定，發明一種簡便、 快速、有效、經濟的測定方法，在不損害植物生長的條件下研究植株對溫度和光強的適應范 圍，對植株分布和推廣范圍的確定及相關栽培措施的制定具有重大的理論意義和現實意 義；同時通過比較不同植株在同一脅迫處理的條件下，PSII的失活及恢復的程度來比較不 同植株之間抗性的差異，為優良品種選育奠定基礎。


【發明內容】

[0007] 為解決現有技術的不足，本發明的目的在于，提供一種不破壞植物生長、便于在不 同溫度和光照條件下平行的檢測植株葉片光損傷及恢復的狀況，進而確定植株光強和溫度 適應范圍并判斷不同植株抗性差異的方法。
[0008] 本發明的技術方案為：一種快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法，其特征是， 包括如下的步驟：
[0009] (1)待測樣品的采集：選擇正常生長植株上的幼齡葉片，用打孔器截取大小一致 的葉圓片；
[0010] (2)植株葉片的處理：將待測的葉圓片置于精確控制光照強度的水浴鍋的網格載 物板上，經過不同光照和溫度的脅迫處理后，在常溫和黑暗的條件下進行暗恢復；
[0011] (3)熒光參數的測定：在脅迫處理和暗恢復的不同的時間點，取出葉圓片，采用 FMS-2便攜脈沖調試式熒光儀測定葉圓片暗適應后的熒光參數初始熒光Ftl和最大熒光產量 Fm，并繪制熒光動力學曲線；
[0012] (4)光照及溫度適應范圍的確定：利用公SFV/Fm = (Fm-Ftl)/Fm，在不同溫度和光照 條件下，比較處理前至處理后Fv/Fm的下降比值與處理后至恢復后Fv/Fm的上升比值，如果 這兩個值之間存在顯著的差異，則在上述的條件下植株遭受的光損傷不能在暗適應的條件 下恢復，則確定此溫度和光強值超出植株的適應范圍。
[0013] 進一步地，上述步驟（1)中，截取待測植株的葉圓片后，將葉原片放入避光盒4°C 保存，待測。
[0014] 進一步地，上述步驟（2)中，脅迫處理和暗恢復的過程中，樣品置于濕紗布上。
[0015] 進一步地，上述步驟（2)中，溫度和光照脅迫時間是根據一天中強光和極端溫度 脅迫的時間來設定的，暗恢復的時間是根據夜晚的時長設定的。
[0016] 本發明還提供了一種實現快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法的裝置，包括 水浴鍋體，其特征是，所述水浴鍋體的上方設有調節和固定光源的立柱，所述立柱上設有沿 立柱上、下移動的燈箱，所述燈箱的下方設有可更換的光源，所述光源與設置在燈箱內部的 光源電路相連接。
[0017] 進一步地，所述水浴鍋體的槽體內設有可拆卸的網格載物板，在所述網格載物板 的水平面上設有光強傳感器，所述光強傳感器與光強顯示裝置相連接。
[0018] 進一步地，在所述網格載物板的水平面上還設有溫度傳感器，所述溫度傳感器與 溫度調控顯示裝置相連接。
[0019] 進一步地，所述立柱的水平截面與所述燈箱的水平截面相嵌合，所述立柱與所述 燈箱的結合面設有多個小孔，所述小孔內設有與小孔相配合的緊固件，所述緊固件為T型 支架、螺釘或螺栓。
[0020] 進一步地，所述水浴鍋體的外部設有實時顯示樣品處理溫度及光強的數值的溫度 顯示屏和光強顯示屏。
[0021] 進一步地，所述光源為LED燈、鈉燈或鹵素燈。
[0022] 本發明所達到的有益效果：
[0023] 1.本發明選取離體植物的葉片進行不同光強和溫度的處理及暗適應的過程，來模 擬植株在一天的時間內光損傷和光恢復的情況；通過測定處理前、處理后和暗適應后測定 葉片的熒光參數并計算Fv/Fm值，比較處理后和處理前熒光Fv/Fm下降的百分率與暗恢復 后和處理后熒光參數Fv/Fm恢復的百分率的差異，來判斷葉片在相應的脅迫條件下，PSII 的損傷是否可以在一定的暗適應后完成恢復，從而提供一種不破壞植物生長的、大范圍快 速判定植株光強和溫度適應范圍的方法。通過此種方法確定植株遭受光損傷的光強和溫度 的范圍，有利于植株抗性的比較，栽植區域的確定及異常條件下栽培措施的制定。
[0024] 2.實現本發明判定方法的裝置中，燈箱可以沿著立柱上、下移動，根據數顯的光 強，通過調節光源與網格載物板的距離，精確的控制位于網格載物板上樣品的光強。通過改 變光源與樣品間距離實現光照強度的控制，可以實現對光照強度的連續的控制且在光強改 變的同時保證光質（光的波長）恒定不變。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1是本發明的結構示意圖；
[0026] 圖2是燈箱自下而上的仰視圖；
[0027] 圖3是本發明位于寬邊1/2處的截面圖；
[0028] 圖4為4月份不同溫度及光照條件下黃葉及綠葉銀杏的葉綠素熒光（Fv/F m)動力 學曲線；
[0029] 圖5為7月份不同溫度及光照條件下黃葉及綠葉銀杏的葉綠素熒光（Fv/F m)
[0030] 動力學曲線。
[0031] 圖中各附圖標記的含義為：
[0032] 1.水浴鍋體 2.立柱
[0033] 3.燈箱 4.網格載物板
[0034] 5.光強傳感器 6.溫度液晶顯不屏
[0035] 7.光強液晶顯示屏 8.小孔
[0036] 9.光源電路 10.光源
[0037] 11.水浴介質 12.溫度調控顯示裝置
[0038] 13.光強顯示裝置 14.溫度傳感器

【具體實施方式】
[0039] 下面結合附圖對本發明作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發明 的技術方案，而不能以此來限制本發明的保護范圍。
[0040] 一種快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法，包括如下的步驟：
[0041] (1)待測樣品的采集：
[0042] 分別于4月份和7月份兩個時期，采集黃葉及綠葉銀杏健康植株上幼齡葉片，采用 打孔器在每個葉片上截取直徑為Icm的葉圓片，置于避光盒中4°C保存。
[0043] (2)待測樣品處理條件和時間的選擇：
[0044] 根據4月份和7月份兩個時期銀杏栽植地（南京）的月均溫和極端溫度的值，設 置分別以下的四個溫度梯度：26°C，28°C，30°C和32°C (4月份）；36°C，38°C，40°C和42°C (7 月份）。
[0045] 根據林分各層光照強度的差異，設置以下三個光照強度，分別為ISOOymol m 2S \ 1200 μ mol m 2S 1 和 600 μ mol m 2S 1O
[0046] 考慮到光照與溫度的交互作用，在4月份和7月份分別設置12個處理。
[0047] 根據一天之內高溫和強光脅迫的時間，選擇處理為4h。
[0048] 基于相同時期夜晚的平均溫度值，設置4月份和7月份暗恢復的溫度分別為20°C 和30°C ;同時結合晝夜的時長，選擇暗適應的時間為12h。
[0049] (3)待測樣品的處理及熒光參數的測定
[0050] 在4月份和7月份兩個時期，于實驗開始前分別選取黃葉和綠葉銀杏的葉片10 片，測定葉片暗適應后的Fv/Fm值。
[0051] 實現待測樣品不同處理條件的裝置如圖1至圖3所示，精確控制光照強度的水浴 鍋，包括水浴鍋體1，所述水浴鍋體1的上方設有調節和固定光源10的立柱2,所述立柱2 上設有沿立柱2上、下移動的燈箱3,水浴鍋體1的四角連接立柱2的下端，立柱2用于調節 及固定燈箱3的位置。所述燈箱3的下方設有可更換的光源10,所述光源10為LED燈、鈉 燈或鹵素燈，可以根據具體實驗的要求進行更換。所述光源10與設置在燈箱3內部的光源 電路9相連接。
[0052] 所述立柱2的水平截面與所述燈箱3的水平截面相嵌合，所述立柱2與所述燈箱 3的結合面設有多個小孔8,所述小孔8為方形、圓形或橢圓形，通過在小孔8內插入與小孔 8相配合的緊固件，實現對燈箱的固定，所述緊固件為T型支架、螺釘或螺栓。
[0053] 所述水浴鍋體1的槽體內設有可拆卸的網格載物板4,網格空隙的大小可以調節， 從而滿足不同樣本的需求；在所述網格載物板4的水平面上設有光強傳感器5,所述光強傳 感器5與光強顯示裝置13相連接，顯示網格載物板4處的實時光強。
[0054] 在所述網格載物板4的水平面上還設有溫度傳感器14,所述溫度傳感器14與溫度 調控顯示裝置12相連接，控制槽體內的水浴介質11的溫度。
[0055] 所述水浴鍋體1的外部設有溫度顯示屏6和光強顯示屏7,實時顯示樣品處理溫度 及光強的數值。
[0056] 在裝置運行過程中，水浴鍋的槽體內填裝水浴介質11，填裝的的位置與網格載物 板4的上緣平齊，這樣可以防止置于網格載物板4上的樣品（特別是生物樣品）脫水失活。
[0057] 待測樣品不同的處理條件分別通過如下的方式實現：
[0058] 1)通過水浴鍋體1的溫度調控顯示裝置12控制水浴溫度；
[0059] 2)通過調節支架2上燈箱3至網格載物板4的距離結合光強顯示裝置13確定光 強參數；
[0060] 3)立柱2與燈箱3的結合面設有小孔8,可通過插入T字形支架來實現燈箱3的 固定。
[0061] 之后分別取黃葉及綠葉銀杏葉圓片各40片在設定有不同溫度和光強水浴鍋（12 個處理）的網格載物板4上，放置4h。
[0062] 在處理的過程中，分別于lh，2h，3h和4h取出10片葉圓片，測定葉片暗適應20分 鐘后的^/^值，前3次測定后，將測定過的葉圓片丟棄，最后一次測定后將葉圓片置于濕紗 布中，分別于20°C (4月份）和30°C (7月份）黑暗的條件下進行暗適應。
[0063] 在暗適應的過程中，分別于2h，4h，6h和12h，測定葉片的Fv/F m值。
[0064] 以測定時間為X軸，Fv/Fm值為Y軸分別繪制4月份和7月份黃葉及綠葉銀杏的F v/ Fm熒光參數的動力學曲線，結果詳見圖4和圖5。
[0065] 由圖4和圖5所示：在同一溫度條件下，隨著處理溫度的升高，黃葉及綠葉^/^值 的下降幅度逐漸增加；在同一溫度的條件下，隨著光強的升高，Fv/Fm值的下降幅度也逐漸 的增加。在較低的光強和溫度脅迫4h后，植株Fv/Fm值可以通過12h暗適應恢復至初始值。 在較高的光強和溫度脅迫4h后，F v/Fm值不可以通過12h暗適應恢復至初始值。相較于綠 葉銀杏，黃葉銀杏在較低的光照和溫度的脅迫下，即遭受不可恢復的光抑制。
[0066] (4)光照及溫度適應范圍的確定
[0067] 選取實驗過程中三個重要時間點的Fv/Fm值：處理前F v/Fm((lh)，處理4h后Fv/Fm(4h) 和恢復12h后Fv/Fm(16h)。計算處理4h后Fv/Fm的下降比例（P d)與恢復12h后Fv/Fm的上升 比例（Pk)，
[0068] Pd = (Fv/Fm (Oh) _Fv/Fm(4h))/Fv/Fm (Oh)
[0069] Pr= (Fv/Fm(16h)-Fv/Fm(4h))/F v/Fm(0h)
[0070] 具體的計算結果參見表1。
[0071] 表1黃葉及綠葉銀杏葉片不同處理4h后Fv/Fm的下降比例（P d)
[0072] 與恢復12h后Fv/Fm的上升比例（Pk)
[00731
[0074

【權利要求】
1. 一種快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法，其特征是，包括如下的步驟： (1) 待測樣品的采集：選擇正常生長植株上的幼齡葉片，用打孔器截取大小一致的葉圓 片； (2) 植株葉片的處理：將待測的葉圓片置于精確控制光照強度的水浴鍋的網格載物板 上，經過不同光照和溫度的脅迫處理后，在常溫和黑暗的條件下進行暗恢復； (3) 熒光參數的測定：在脅迫處理和暗恢復的不同的時間點，取出葉圓片，采用FMS-2 便攜脈沖調試式熒光儀測定葉圓片暗適應后的熒光參數初始熒光匕和最大熒光產量F m，并 繪制熒光動力學曲線； (4) 光照及溫度適應范圍的確定：利用公式Fv/Fm=也-匕)/Fm，在不同溫度和光照條件 下，比較處理前至處理后F v/Fm的下降比值與處理后至恢復后Fv/Fm的上升比值，如果這兩 個值之間存在顯著的差異，則在上述的條件下植株遭受的光損傷不能在暗適應的條件下恢 復，則確定此溫度和光強值超出植株的適應范圍。
2. 根據權利要求1所述的一種快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法，其特征是， 上述步驟（1)中，截取待測植株的葉圓片后，將葉原片放入避光盒4°C保存，待測。
3. 根據權利要求1所述的一種快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法，其特征是， 上述步驟（2)中，脅迫處理和暗恢復的過程中，樣品置于濕紗布上。
4. 根據權利要求1所述的一種快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法，其特征是， 上述步驟（2)中，溫度和光照脅迫時間是根據一天中強光和極端溫度脅迫的時間來設定的， 暗恢復的時間是根據夜晚的時長設定的。
5. -種實現權利要求1-4中任意一項所述快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法 的裝置，包括水浴鍋體，其特征是，所述水浴鍋體的上方設有調節和固定光源的立柱，所述 立柱上設有沿立柱上、下移動的燈箱，所述燈箱的下方設有可更換的光源，所述光源與設置 在燈箱內部的光源電路相連接。
6. 根據權利要求5所述的一種實現快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法的裝置， 其特征是，所述水浴鍋體的槽體內設有可拆卸的網格載物板，在所述網格載物板的水平面 上設有光強傳感器，所述光強傳感器與光強顯示裝置相連接。
7. 根據權利要求6所述的一種實現快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法的裝置， 其特征是，在所述網格載物板的水平面上還設有溫度傳感器，所述溫度傳感器與溫度調控 顯示裝置相連接。
8. 根據權利要求5所述的一種實現快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法的裝置， 其特征是，所述立柱的水平截面與所述燈箱的水平截面相嵌合，所述立柱與所述燈箱的結 合面設有多個小孔，所述小孔內設有與小孔相配合的緊固件，所述緊固件為T型支架、螺釘 或螺栓。
9. 根據權利要求5所述的一種實現快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法的裝 置，其特征是，所述水浴鍋體的外部設有實時顯示樣品處理溫度及光強的數值的溫度顯示 屏和光強顯示屏。
10. 根據權利要求5所述的一種實現快速判定植株光強和溫度適應范圍的方法的裝 置，其特征是，所述光源為LED燈、鈉燈或鹵素燈。
【文檔編號】G01N21/64GK104237191SQ201410528099
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年10月9日 優先權日:2014年10月9日
【發明者】曹福亮, 王歡利, 郁萬文, 張往祥, 汪貴斌, 劉新亮 申請人:南京林業大學