一種提取和測(cè)定花生脂肪酸的簡(jiǎn)便方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種提取和測(cè)定花生脂肪酸的簡(jiǎn)便方法，包括以下步驟：新鮮的樣品經(jīng)冷凍干燥獲得干組織；稱取干樣品，放入研缽中，液氮研磨粉碎；或者將干樣品放入鉗口頂空瓶中，采用玻璃棒碾碎；加入試劑I和II，超聲混勻，然后加入試劑III，或再加入內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)行水浴反應(yīng)；反應(yīng)完成冷卻后，加入有機(jī)試劑和鹽溶液，混勻，將溶液吸出轉(zhuǎn)入離心管中，靜置；離心分離，吸取上清液，用于上機(jī)測(cè)定；采用歸一化法或內(nèi)標(biāo)法計(jì)算脂肪酸組分的含量。本發(fā)明簡(jiǎn)化了樣品前處理過(guò)程，操作簡(jiǎn)便、快捷，極大的縮短了試驗(yàn)時(shí)間，成本低，需要的樣品量少，具有很好的通用性，是一種實(shí)驗(yàn)室中簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的花生脂肪酸提取和測(cè)定方法。
【專利說(shuō)明】-種提取和測(cè)定花生脂肋酸的簡(jiǎn)便方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及提取和測(cè)定花生脂肪酸的簡(jiǎn)便方法，屬于脂肪酸提取【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 花生是我國(guó)重要的油料作物、經(jīng)濟(jì)作物和出口創(chuàng)匯作物。花生巧粒油脂的品質(zhì)是 由脂肪酸的組成決定的。花生脂肪酸主要由蹤擱酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生酸、花生帰 酸、山俞酸和二十四碳焼酸等八種成分組成，其中油酸和亞油酸為主，約占80%，為人體健康 所必需，如油酸在人體脂類(lèi)代謝中具有降低有害膽固醇，但保持有益膽固醇水平的功能，從 而減緩動(dòng)脈粥樣硬化，有效預(yù)防冠也病等也腦血管疾病的發(fā)生。另外，油酸含量高，抗氧化 能力強(qiáng)，產(chǎn)品不易氧化酸敗，貨架壽命較長(zhǎng)，耐儲(chǔ)能力也強(qiáng)。因此，對(duì)花生品種進(jìn)行脂肪酸組 成及含量的分析是非常必要的。
[0003] 傳統(tǒng)的脂肪酸分析方法主要分為H個(gè)部分：脂肪提取，脂肪酸的衍生化處理W及 脂肪酸的氣相色譜上機(jī)分離鑒定。首先用索氏提取法或浸提法從樣品中提取粗脂肪，提取 出的粗脂肪還要經(jīng)過(guò)多個(gè)步驟的甲醋化處理，抽提分層后才能進(jìn)行氣相色譜分析，整個(gè)過(guò) 程需要進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)。傳統(tǒng)方法工序繁瑣、用時(shí)長(zhǎng)，并且樣品用量大。
[0004] 脂肪酸甲醋化是氣相色譜法測(cè)定脂肪酸必不可少的步驟之一，其方法較多，如酸 催化醋化、堿催化醋化、有機(jī)堿催化醋化等。酸催化醋化催化效果較好并具有普遍的適用 性，該方法適合所有的醋交換反應(yīng)和游離脂肪酸的甲醋化。比較常使用的酸主要有BFs，肥1 和恥04的甲醇溶液，其中的BFs的甲醇溶液（12%-14%)應(yīng)用最廣泛是非常有效的試齊U。但是 H氣化測(cè)有毒，對(duì)人體毒害較大。酸催化醋化可W應(yīng)用于無(wú)水和含水樣品的甲醋化。但是， 所有酸催化醋化反應(yīng)都需要進(jìn)行加熱（50-10(TC )，且甲醋化時(shí)間較長(zhǎng)，一般需40-60min。
[0005] 在樣品中沒(méi)有相當(dāng)量的游離脂肪酸存在的情況下，可W用堿催化醋化。油脂酸值 在堿催化反應(yīng)過(guò)程中一定要盡可能的低(酸值<1)，否則游離脂肪酸易和催化劑中堿反應(yīng) 導(dǎo)致生成較多脂肪酸軸和水而降低醋化率；反應(yīng)原料(包括催化劑）都必須保證無(wú)水，水會(huì) 消耗催化劑而降低催化效率，還會(huì)使甘油H醋水解。經(jīng)常使用的催化溶液有化0H、K0H和 化0邸3的甲醇溶液。
[0006] -些強(qiáng)的有機(jī)堿巧n各種輕基季饋、H甲基銃輕基化物和四甲基脈）也可使類(lèi)脂醋 交換和游離脂肪酸成鹽。有機(jī)堿的脂肪酸鹽在GC的進(jìn)樣口處更易分解成脂肪酸甲醋，使得 醋化的和游離脂肪酸的分析一步完成。此外，重氮甲焼是一種高效、快速的醋交換催化劑， 也可用于游離脂肪酸和磯酸醋的醋化，但因操作條件苛刻、使用壽命短而不被廣泛采用。
[0007] 最早的脂肪酸的甲醋化方法是先用堿性溶液皂化分離，然后再加BF3-CH3OH或者 酸化的醇等進(jìn)行醋化。由于皂化反應(yīng)速度慢，整個(gè)皂化-醋化消耗的時(shí)間長(zhǎng)，所W后來(lái)發(fā)展 了直接醋交換法。直接醋交換反應(yīng)速度比皂化反應(yīng)快，水解和醋化反應(yīng)一步進(jìn)行，只需要一 種試劑，反應(yīng)速度不僅快而且操作也簡(jiǎn)單。但是要獲得精確的定量結(jié)果，必須要優(yōu)化醋交換 條件。
[000引本發(fā)明通過(guò)對(duì)花生脂肪酸的提取和甲醋化過(guò)程進(jìn)行條件優(yōu)化，大大簡(jiǎn)化了樣品前 處理過(guò)程。具有操作簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)點(diǎn)，極大的縮短了試驗(yàn)時(shí)間，節(jié)約了大量的人力、物力， 使繁瑣的工作變得簡(jiǎn)單；需要的樣品量很少，可達(dá)到微量檢測(cè)；改進(jìn)后的方法還可用于大 樣本的脂肪酸檢測(cè)；具有很好的通用性，也可應(yīng)用于酵母、藻類(lèi)、其它植物等材料的脂肪酸 檢測(cè)，同樣取得了滿意的結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供適合實(shí)驗(yàn)室操作的簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的花生脂肪酸提取和測(cè)定的方 法。
[0010] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用W下步驟： 新鮮的樣品經(jīng)冷凍干燥獲得干組織；稱取干樣品，放入研鉢中，液氮研磨粉碎；或者將 干樣品放入謝口頂空瓶中，采用玻璃棒碼碎；加入試劑I和II，超聲混勻，然后加入試劑 III，或再加入內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)行水浴反應(yīng)；反應(yīng)完成冷卻后，加入有機(jī)試劑和鹽溶液，混勻，將溶 液吸出轉(zhuǎn)入離也管中，靜置；離也分離，吸取上清液，用于上機(jī)測(cè)定；采用歸一化法或內(nèi)標(biāo) 法計(jì)算脂肪酸組分的含量。
[0011] 具體來(lái)說(shuō)，所述的方法如下： (1)新鮮的樣品經(jīng)冷凍干燥獲得干組織。
[0012] (2)稱取干樣品，放入研鉢中，液氮研磨粉碎；或者將干樣品放入謝口頂空瓶中，采 用玻璃棒碼碎。
[0013] (3)向謝口頂空瓶中加入試劑I和II浸泡樣品，超聲混勻。然后加入試劑III，或 再加入內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)行水浴反應(yīng)。
[0014] (4)反應(yīng)完成冷卻后，加入有機(jī)試劑和鹽溶液，混勻，將溶液吸出轉(zhuǎn)入離也管中，靜 置。
[0015] (5)離也，吸取上清液，用濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶中，用于GC-MS上機(jī)測(cè)定。
[0016] (6)采用歸一化法或內(nèi)標(biāo)法計(jì)算脂肪酸組分的含量。
[0017] 優(yōu)選地，步驟（1)所述的樣品是新鮮的花生根、莖、葉、花或者種子。取新鮮的花生 根、莖、葉或花，用滅菌的蒸觸水清洗3次，經(jīng)冷凍干燥后獲得干組織。取新鮮的花生種子， 清洗后采用液氮反復(fù)研磨，然后再把研碎的種子冷凍干燥。
[0018] 優(yōu)選地，步驟（2)中采用萬(wàn)用天平稱取的干樣品量為O.Olg (m)。所用的謝口頂空 瓶大小為5 ml。
[0019] 優(yōu)選地，步驟（3)所述的試劑I為甲醇，加入體積為850W ;試劑II為鹽酸，加入 體積為100W。超聲波輔助提取的條件為超聲波功率300W，超聲波頻率28曲Z，超聲時(shí)間 為lOmin。試劑III為2, 2-二甲氧丙焼，加入體積為50M1。內(nèi)標(biāo)物為十九碳酸(購(gòu)自阿拉 下)，濃度為Img/ml。用壓蓋器將頂空瓶用帶聚四氣己帰墊的鉛蓋封好，水浴反應(yīng)的溫度為 85°C，反應(yīng)時(shí)間為比。甲醋化過(guò)程中每隔lOmin振蕩一次。
[0020] 優(yōu)選地，步驟（4)所述的有機(jī)試劑為正己焼，加入體積為0. 5ml ;鹽溶液為氯化軸 溶液，濃度為1%，加入體積為1ml。靜置的時(shí)間為10 min。
[0021] 優(yōu)選地，步驟（5)所述的離也條件為25°C，400化/min轉(zhuǎn)速離也5min。如果得到的 樣品濃度過(guò)低，采用氮吹儀吹干上清液，然后用200ul左右正己焼溶解定容，潤(rùn)旋2?3 S，用 0. 22 um濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶中，用于GC-MS上機(jī)測(cè)定。
[0022] 優(yōu)選地，步驟（6)中，采用歸一化法計(jì)算脂肪酸組分的相對(duì)含量，即對(duì)各組分色譜 峰面積積分，W各組分的峰面積總和為100%，脂肪酸組分的百分含量W占峰面積總和的百 分比表示。
[0023] 優(yōu)選地，步驟（6)中，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算脂肪酸組分的絕對(duì)含量。準(zhǔn)確稱取樣品試 樣，加入十九碳酸作為內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及相應(yīng)的色譜峰面積之比，按下 式可求組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；Wi=AiXM, / (A,XMXRRF)。i為待測(cè)定樣品中組分，Wi為組分i 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為內(nèi)標(biāo)使用量，M為樣品質(zhì)量，A i和A ,分別為組分i和內(nèi)標(biāo)物的峰面積，RRF 為相對(duì)影響因子。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1 在花生品種花育19種子發(fā)育的不同時(shí)期取樣，從果針下地后（DAP) 25天開(kāi)始，每隔7 天取一次樣，共取6次樣品。剝掉果殼，保留種子，采用液氮反復(fù)研磨，然后再把研碎的種子 冷凍干燥獲得干組織。采用萬(wàn)用天平準(zhǔn)確稱取花生干組織0. Olg(m)，放入已經(jīng)被酒精清洗 并烘干的5ml謝口頂空瓶中，加入850W的甲醇和100W的鹽酸，超聲（300w，28曲z)10min 混勻。然后向瓶中加入50W 2, 2-二甲氧丙焼。用壓蓋器將頂空瓶用帶聚四氣己帰墊的鉛 蓋封好，85C水浴反應(yīng)比。甲醋化過(guò)程中每隔lOmin振蕩一次。反應(yīng)結(jié)束后，取出冷卻至室 溫。用啟蓋器啟蓋后，向瓶中加入1ml 1%的化C1溶液和0. 5ml正己焼，混勻，將上層溶液 吸出轉(zhuǎn)入10ml烘干的離也管中，靜置10分鐘。25C，40(K)r/min轉(zhuǎn)速離也5分鐘，吸取上清 液，用0.22 um濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶中。如果得到的樣品濃度過(guò)低，采用氮吹儀吹干上清 液，然后用200ul左右正己焼溶解定容，潤(rùn)旋2?3 S，用0.22 um濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶中， 用于GC-MS上機(jī)測(cè)定。采用歸一化法計(jì)算脂肪酸組分的相對(duì)含量，即對(duì)各組分色譜峰面積 積分，W各組分的峰面積總和為100%，脂肪酸組分的百分含量W占峰面積總和的百分比表 示。發(fā)現(xiàn)(表1 )，在花生種子發(fā)育過(guò)程中，果針下地39天之前，花育19蹤擱酸和硬脂酸含量 變化不大，39天之后，硬脂酸含量逐漸升高，蹤擱酸含量逐漸降低。油酸含量的變化規(guī)律與 亞油酸相反，說(shuō)明油酸含量的增加可能由于生成亞油酸脂肪酸的減少。 表1花育1 9種子不同發(fā)育時(shí)期的脂肪酸組成

【權(quán)利要求】
1. 一種提取和測(cè)定花生脂肪酸的簡(jiǎn)便方法，包括以下步驟： (1)新鮮的樣品經(jīng)冷凍干燥獲得干組織； (2 )稱取干樣品，放入研缽中，液氮研磨粉碎；或者將干樣品放入鉗口頂空瓶中，采用玻 璃棒碾碎； (3) 向鉗口頂空瓶中加入試劑I和II浸泡樣品，超聲混勻； 然后加入試劑III，或再加入內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)行水浴反應(yīng)； (4) 反應(yīng)完成冷卻后，加入有機(jī)試劑和鹽溶液，混勻，將溶液吸出轉(zhuǎn)入離心管中，靜置； (5) 離心，吸取上清液，用濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶中，用于GC-MS上機(jī)測(cè)定； (6) 采用歸一化法或內(nèi)標(biāo)法計(jì)算脂肪酸組分的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取和測(cè)定花生脂肪酸的簡(jiǎn)便方法，其特征在于，步驟 (1) 所述的樣品是新鮮的花生根、莖、葉、花或者種子； 取新鮮的花生根、莖、葉或花，用滅菌的蒸餾水清洗3次，經(jīng)冷凍干燥后獲得干組織； 取新鮮的花生種子，清洗后采用液氮反復(fù)研磨，然后再把研碎的種子冷凍干燥。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取和測(cè)定花生脂肪酸的簡(jiǎn)便方法，其特征在于，步驟 (2) 中采用萬(wàn)用天平稱取的干樣品量為0. Olg (m); 所用的鉗口頂空瓶大小為5 ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取和測(cè)定花生脂肪酸的簡(jiǎn)便方法，其特征在于，步驟 (3) 所述的試劑I為甲醇，加入體積為850W ;試劑II為鹽酸，加入體積為100W ; 超聲波輔助提取的條件為超聲波功率300w，超聲波頻率28kHz，超聲時(shí)間為lOmin ; 試劑III為2, 2-二甲氧丙烷，加入體積為50W ; 內(nèi)標(biāo)物為十九碳酸(購(gòu)自阿拉丁)，濃度為lmg/ml ; 用壓蓋器將頂空瓶用帶聚四氟乙烯墊的鋁蓋封好，水浴反應(yīng)的溫度為85°C，反應(yīng)時(shí)間 為lh ;甲酯化過(guò)程中每隔lOmin振蕩一次。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種提取和測(cè)定花生脂肪酸的簡(jiǎn)便方法，其特征在于，所述 的內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液配制方法為：稱取10 mg內(nèi)標(biāo)物十九碳酸，精密稱定，置于10 ml容量瓶 中，加入異戊醇至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至密封的螺口試管中，冷藏保存。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取和測(cè)定花生脂肪酸的簡(jiǎn)便方法，其特征在于，步驟 (4) 所述的有機(jī)試劑為正己烷，加入體積為0. 5ml ;鹽溶液為氯化鈉溶液，濃度為1%，加入體 積為lml ; 靜置的時(shí)間為10 min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取和測(cè)定花生脂肪酸的簡(jiǎn)便方法，其特征在于：步驟 (5) 所述的離心條件為25°C，4000r/min轉(zhuǎn)速離心5min ; 如果得到的樣品濃度過(guò)低，采用氮吹儀吹干上清液，然后用200ul左右正己烷溶解定 容，渦旋2~3 s，用0. 22 um濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶中，用于GC-MS上機(jī)測(cè)定。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104502475SQ201410761010
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】遲曉元, 孫全喜, 潘麗娟, 陳娜, 陳明娜, 王通, 王冕, 禹山林, 楊珍 申請(qǐng)人:山東省花生研究所