本發明屬于環境監測、食品安全、醫療衛生、生命科學等領域，具體涉及一種生物體內或細胞內hg²⁺的熒光成像方法。

背景技術：

hg²⁺廢水污染物是構成水環境污染的重要組成部分。排入水中的無極汞污染物不能被生物降解，而是參與食物鏈循環，可被微生物轉化為毒性更強的有機汞，并在生物體內大量富集后經過食物鏈(尤其是魚類)進入人體，嚴重威脅著人類的健康，可造成中樞神經系統、內分泌系統及腦部的損害，此外，它可能還會破壞人體免疫系統，甚至導致死亡。因此，迫切需要建立一種快速、靈敏、特異、準確的hg²⁺檢測方法。

目前，hg²⁺的檢測方法主要包括：分光光度法、原子吸收/發射光譜法、電感耦合等離子體發射光譜法(icpms)、色譜法、光學及電化學法等，然而，相比于昂貴的儀器和試劑、繁雜的樣品預處理、耗時的檢測流程等，熒光探針法更適合于hg²⁺的檢測，不但能夠較好地滿足方便、經濟、快捷地檢測要求，而且，還能夠對生物體內或細胞內的hg²⁺實現原位、動態的實時檢測，即實現對生物體內或細胞內hg²⁺的時空分辨。目前，國內外對于生物體內或細胞內hg²⁺的熒光檢測與成像的研究并不多，現有技術主要采用傳統有限的熒光染料進行成像研究，不但受到檢測條件如介質、ph值的限制、共存物質的干擾作用等，更重要的是，檢測與成像的靈敏度和選擇性均有待于提高。

近年來，現代分子生物學技術及納米新材料的發展為hg²⁺的高靈敏、特異性生物傳感檢測技術提供了新的思路和有利條件，涌現出許多新技術、新方法。作為金納米粒子家族中的新生代，金納米籠一經問世就引發了廣泛的關注和研究。該納米材料具有中空多孔的結構。與傳統的納米顆粒相比，金納米籠的局域表面等離子共振峰位于近紅外區700～900nm，該波段對于生物醫學意義重大，尤其是對于細胞及活體研究。研究表明，包括hg²⁺在內的多種金屬離子能夠特異性地和核苷酸“橋連”，使之形成穩定的金屬離子-堿基對。其中，hg²⁺能夠和錯配的dna堿基對t-t相互作用，形成穩定的t-hg²⁺-t堿基對，這種特性已在生物傳感的設計與應用方面顯示出巨大的潛力，為生物體內或細胞內hg²⁺的熒光檢測及共聚焦熒光顯微成像提供了新型、特異、高效的檢測平臺。采用表面正電荷修飾的金納米籠作為納米容器，利用富t單鏈dna與金納米籠表面的靜電作用構建生物傳感器并將其用于生物體內或細胞內hg²⁺的熒光成像還未見文獻報道。

技術實現要素：

為了克服現有技術存在的不足，針對基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器用于生物體內或細胞內hg²⁺的熒光成像技術未見報道，因此，本發明的目的：提供一種采用表面正電荷修飾的金納米籠為載體、以羅丹明b為客體分子、以hg²⁺識別探針為分子門構建而成的生物傳感器進行生物體內或細胞內hg²⁺的熒光成像的方法，該方法所采用的生物傳感器具有設計巧妙、結構簡單、性能穩定、細胞毒性小、細胞膜滲透能力強、胞內釋放可控性強、對hg²⁺選擇性好、在細胞內分散性好等諸多優點，將其作為生物體內或細胞內hg²⁺成像的生物傳感器，可實現細胞內hg²⁺的檢測及成像。將本發明提出的熒光成像方法用于細胞內hg²⁺的熒光顯微成像，能夠方便、快捷地實現細胞內hg²⁺的高靈敏、高準確度的熒光成像，具有選擇性好、響應時間短、易于直接觀測、便于實時監測等優點，可在生物體內或細胞內hg²⁺的檢測、成像方面發揮重要作用，為生物體內或細胞內hg²⁺的熒光成像的基礎研究和應用提供新的方法和技術。

本發明是通過以下技術方案實現發明目的的。本發明所采用的生物傳感器是以金納米籠作為納米載體，利用其空心多孔的結構特性，在其內部裝載客體分子如熒光分子羅丹明b，為了防止熒光分子的外泄，通過靜電作用在其表面組裝具有可生物相應的分子門；其中，所述的可生物相應的分子門是將hg²⁺識別探針，即富t單鏈dna通過靜電作用組裝到金納米籠表面構建而成，具體可以通過在金納米籠表面修飾一層聚陽離子的方法而將富t單鏈dna組裝到金納米籠表面，優選地采用聚二烯丙基二甲基氯化銨作為正電荷修飾劑。

優選地，所述的金納米籠內部裝載的熒光分子可以是羅丹明b。

一種采用表面正電荷修飾的金納米籠為載體、以羅丹明b為客體分子、以富t單鏈dna為分子門構建而成的生物傳感器進行生物體內或細胞內hg²⁺的熒光成像的方法，包括如下步驟：

(1)取適量hela細胞，以2000～3000轉/min下離心5～10min，移除上清液；

(2)加入制備好的基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器，37℃恒溫孵育10～30min后進行激光共聚焦掃描成像實驗；

所述的基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器的制備方法，包括如下步驟：

(1)將聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液加入到金納米籠的懸浮液中，室溫振蕩過夜；

(2)離心分離上述溶液后，將羅丹明b溶液加入到體系中，室溫振蕩過夜；

(3)將富t單鏈dna溶液加入到上述溶液中，室溫振蕩過夜，離心分離，即制得基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器；

所述的金納米籠按文獻方法獲得(g.d.moon,s.w.choi,x.cai,w.y.li,e.c.cho,u.jeong,l.v.wangandy.n.xia.j.am.chem.soc.2011,133,4762–4765)。

本發明的有益效果：本發明提出的一種采用表面正電荷修飾的金納米籠為載體、以羅丹明b為客體分子、以富t單鏈dna為分子門構建而成的生物傳感器進行生物體內或細胞內hg²⁺的熒光成像的方法，不但能夠方便、快捷地實現細胞內hg²⁺的高靈敏、高準確度的熒光成像，同時還具有選擇性好、響應時間短、易于直接觀測、便于實時監測等優點，可在生物體內或細胞內hg²⁺成像檢測及應用方面發揮重要作用，同時也為細胞熒光成像的基礎研究和應用提供新的方法和技術。本發明所采用的基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器具有設計巧妙、結構簡單的優點，對hg²⁺選擇性好、細胞毒性小、細胞膜滲透能力強、胞內釋放可控性強、在細胞內的分散性好，作為活細胞內hg²⁺的熒光成像的生物傳感器，可實現細胞內hg²⁺的特異性成像檢測。該成像方法在環境檢測、食品衛生、生命科學等領域具有較大的應用潛力和廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1采用基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器得到的細胞內hg²⁺的共聚焦熒光顯微成像照片。

具體實施方式

以下是本發明涉及的具體實施例，對本發明的技術方案做進一步描述，但是本發明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發明的保護范圍之內。

下面通過實施例具體地說明本發明，但本發明不受下述實施例的限定。

實驗儀器：thz-82a氣浴恒溫振蕩器(金壇市醫療器械廠)；kdc-160hr高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；leicatcssp5ii激光共聚焦掃描儀(德國萊卡公司)。

實驗試劑：羅丹明b(上海阿拉丁試劑有限公司)；聚二烯丙基二甲基氯化銨(美國sigma-aldrich公司)；富t單鏈dna堿基序列：3’-tttgtttgttggccccccttctttctta-5’(上海生工生物工程股份有限公司)，pbs溶液為0.01m(ph7.4,na2hpo4-nah2po4)。

實施例1：

一種采用表面正電荷修飾的金納米籠為載體、以羅丹明b為客體分子、以富t單鏈dna為分子門構建而成的生物傳感器進行生物體內或細胞內hg²⁺的熒光成像方法，包括如下步驟：

(1)取適量hela細胞懸浮液，以2500轉/min下離心10min，移除上清液；

(2)在細胞中加入hg²⁺溶液，孵育溫度37℃，30min后離心，移除上清液；

(3)加入制備好的生物傳感器的pbs溶液，37℃恒溫孵育30min后進行激光共聚焦掃描成像實驗；

(4)將孵育好的細胞置于共聚焦顯微鏡的載物臺上，激發波長：559nm；接收波長：580-630nm。

得到的hela細胞的熒光成像照片如圖1所示。

實施例2:

實施例1中所述的基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器的制備方法，包括如下步驟：

(1)將200μl濃度11.664mg/ml的聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液加入到400μl金納米籠的懸浮液中，室溫振蕩過夜；

(2)離心分離上述溶液后，將100μl濃度1.0×10^-5mol/l的羅丹明b溶液加入到體系中，室溫振蕩過夜；

(3)將10μl濃度1.0×10^-5m的富t單鏈dna溶液加入到上述溶液中，室溫振蕩過夜，離心分離，即制得基于富t單鏈dna-金納米籠的生物傳感器；

所述的金納米籠按文獻方法獲得(g.d.moon,s.w.choi,x.cai,w.y.li,e.c.cho,u.jeong,l.v.wangandy.n.xia.j.am.chem.soc.2011,133,4762–4765)。

本發明將納米技術、分子生物技術與細胞成像技術相結合，通過特異性的分子識別反應，可實現對細胞內hg²⁺的高靈敏、高選擇性的熒光成像。本發明提出的熒光成像的方法采用表面正電荷修飾的金納米籠為載體、以羅丹明b為客體分子、以富t單鏈dna為分子門構建而成的生物傳感器進行生物體內或細胞內hg²⁺的熒光成像。將該生物傳感器與細胞進行孵育后，通過細胞的內吞作用，即可使生物傳感器進入細胞，細胞內如果有hg²⁺存在，則會發生hg²⁺與富t單鏈dna之間的特異性分子識別反應，即在t-hg²⁺-t的配位作用下，富t單鏈dna轉變成類似發卡型的雙螺旋結構，導致富t單鏈dna從金納米籠表面脫離，使封堵籠孔的分子門被打開，孔內的熒光分子羅丹明b被釋放出來，實現熒光分子在細胞內的可控釋放。因此，利用該生物傳感器，能夠實現對細胞內hg²⁺的高靈敏、高選擇性的熒光成像檢測。

本發明的細胞內hg²⁺的熒光成像方法具有選擇性好、可控性強、響應時間短、易于直接觀測、便于實時監測等優點，本發明所采用的生物傳感器與傳統的熒光染料成像技術相比，具有對hg²⁺選擇性好、細胞毒性小、細胞膜滲透能力強、胞內釋放可控性強、在細胞內的分散性好等諸多優點。該成像方法在環境監測、食品衛生、生命科學等領域具有較大的應用潛力和廣闊的應用前景。

序列表

sequencelisting

<110>青島科技大學

<120>一種細胞內hg2+的熒光成像方法

<160>1

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

attctttcttccccccggttgtttgttt28