本發(fā)明涉及一種呋喃西林生物標(biāo)識(shí)物5-硝基-2-糠醛的檢測方法，特別涉及一種呋喃西林生物標(biāo)識(shí)物5-硝基-2-糠醛的內(nèi)標(biāo)檢測方法。

背景技術(shù)：

硝基呋喃類藥物的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，尤其對(duì)光照等十分敏感，而且在生物體內(nèi)代謝速率非常快，濃度半衰期從幾小時(shí)到十幾小時(shí)不等，動(dòng)物喂藥24小時(shí)之后體內(nèi)基本檢測不到硝基呋喃原形藥的存在。因此，從飼料或用藥動(dòng)物體內(nèi)檢測硝基呋喃原形藥是比較困難且不準(zhǔn)確的，原藥的殘留量不足以反映真實(shí)的用藥情況。然而，硝基呋喃的代謝產(chǎn)物與組織蛋白結(jié)合后在生物體內(nèi)卻可以長期存在，研究表明在停藥56天后檢測，動(dòng)物體內(nèi)仍然可以檢測到穩(wěn)定含量的代謝產(chǎn)殘留物。一直以來，對(duì)硝基呋喃類抗生素的違禁檢測，是通過對(duì)其生物標(biāo)示殘留物(如圖)的測定。以檢測呋喃西林的代謝物氨基脲(SEM)為例，在適當(dāng)?shù)乃嵝运夥諊?，與組織蛋白結(jié)合的SEM會(huì)重新游離出來。從檢測的角度出發(fā)，SEM是一類小分子量化合物，對(duì)液相色譜常用的紫外和熒光檢測器響應(yīng)均不理想，因而加入2-硝基苯甲醛(2-NBA)作為衍生化試劑，衍生產(chǎn)物NBA-SEM經(jīng)過分離純化后，用UPLC/MS/MS分析，檢測限可達(dá)歐盟法規(guī)要求的1μg/Kg。

目前針對(duì)呋喃西林違禁用藥的檢測方法主要有高效液相色譜與質(zhì)譜、紫外、熒光檢測器聯(lián)用法、分光光度法，薄層色譜法以及免疫分析法等，基于氨基脲(SEM)為生物標(biāo)示物的檢測方法無法分辨“陽性”的SEM究竟來自于呋喃西林還是自然產(chǎn)生。這也使得沿用至今的SEM是否能夠繼續(xù)作為呋喃西林檢測的標(biāo)示物在業(yè)內(nèi)引起了巨大爭議。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種呋喃西林生物標(biāo)識(shí)物5-硝基-2-糠醛的內(nèi)標(biāo)檢測方法，以5-硝基-2-糠醛(NF)為檢測對(duì)象，采用2,4-二硝基苯肼為衍生化試劑將目標(biāo)物轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定、檢測器下響應(yīng)靈敏的化合物，突破現(xiàn)有研究無法克服內(nèi)源性等非呋喃西林源生物標(biāo)示物產(chǎn)生的局限性。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種呋喃西林生物標(biāo)識(shí)物5-硝基-2-糠醛的內(nèi)標(biāo)檢測方法，包括如下步驟：

(1)試劑配制

將100毫克DNPH溶解在1毫升濃鹽酸中，然后用甲醇定容至100毫升的容量瓶里，制得濃度為1.0mg/mL的衍生化試劑溶液；

(2)衍生化及凈化

稱取1.0±0.1g的樣品，放入50毫升的樣品管內(nèi)，加入10毫升鹽酸、100μL衍生化試劑溶液、100μL內(nèi)標(biāo)物溶液，充分渦旋后，避光放置于60℃的水浴中衍生反應(yīng)20分鐘，隨后6000轉(zhuǎn)/min離心五分鐘，取上清液經(jīng)Oasis PRiME HLB固相萃取小柱凈化后，得到的液體旋蒸至干后，殘留物用1.0毫升的流動(dòng)相復(fù)溶，超聲溶解后用0.2μm的濾膜過濾，得待檢測液供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析；

(3)UPLC-MS分析

待檢測液經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測分析，內(nèi)標(biāo)法定量。

作為優(yōu)選，步驟(1)中所述濃鹽酸的濃度為12moL/L。

作為優(yōu)選，步驟(2)中所述內(nèi)標(biāo)物溶液為PDAB溶液，內(nèi)標(biāo)物溶液的濃度為1.0μg/mL。

作為優(yōu)選，步驟(2)中所述鹽酸濃度為0.2mol/L。

作為優(yōu)選，步驟(3)中色譜條件為：色譜柱：Waters ACQUITY CSHTM C₁₈柱，規(guī)格：100*2.1mm，1.7μm；進(jìn)樣量：10μL；流速：0.2mL/min；柱溫為45℃；流動(dòng)相設(shè)置為：A相超純水，30％體積；B相為乙腈，70％體積；洗脫程序設(shè)置為等度洗脫：A保持30％不變，B保持70％不變。

作為優(yōu)選，步驟(3)中質(zhì)譜條件為：質(zhì)譜設(shè)置為負(fù)離子模式，純度99.39％的氮?dú)鉃殄F孔氣，流速60L/h，純度99.9999％的氬氣為碰撞氣，流速600L/h；毛細(xì)管電壓：3.5KV，離子源溫度120℃，汽化溫度，380℃；NF-DNPH和PDAB-DNPH的母離子分別設(shè)置為m/z 320.0和m/z 328.1，子離子分別設(shè)置為m/z 273.3、161.2和m/z 294.9、147.0；碰撞能分別設(shè)置為15eV和28eV。

作為優(yōu)選，步驟(3)中，內(nèi)標(biāo)法定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)5-硝基-2-糠醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度設(shè)置為0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL，5-硝基-2-糠醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中PDAB濃度恒定為100ng/mL。

本發(fā)明的有益效果是：以5-硝基-2-糠醛(NF)為檢測對(duì)象，采用2,4-二硝基苯肼為衍生化試劑將目標(biāo)物轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定、檢測器下響應(yīng)靈敏的化合物，突破現(xiàn)有研究無法克服內(nèi)源性等非呋喃西林源生物標(biāo)示物產(chǎn)生的局限性。

附圖說明

圖1為標(biāo)準(zhǔn)溶液中PDAB-DNPH的MRM色譜圖(濃度100ng/mL)。

圖2為標(biāo)準(zhǔn)溶液中NF-DNPH的MRM色譜圖(濃度2ng/mL)。

圖3為南美白對(duì)蝦中PDAB-DNPH的MRM色譜圖(濃度100ng/mL)。

圖4為南美白對(duì)蝦中PDAB-DNPH的MRM色譜圖(濃度2ng/mL)。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

PDAB：對(duì)二甲氨基苯甲醛。

實(shí)施例：

一種呋喃西林生物標(biāo)識(shí)物5-硝基-2-糠醛的內(nèi)標(biāo)檢測方法，包括如下步驟：

(1)試劑配制

將100毫克DNPH(2,4-二硝基苯肼)溶解在1毫升濃鹽酸(12M)中，然后用甲醇定容至100毫升的容量瓶里，制得濃度為1.0mg/mL的衍生化試劑溶液；

(2)衍生化及凈化

稱取1.0±0.1g的樣品，放入50毫升的樣品管內(nèi)，加入10毫升鹽酸(0.2mol/L)、100μL衍生化試劑溶液、100μL PDAB溶液(1.0μg/mL)，充分渦旋后，避光放置于60℃的水浴中衍生反應(yīng)20分鐘，隨后6000轉(zhuǎn)/min離心五分鐘，取上清液經(jīng)Oasis PRiME HLB固相萃取小柱(Waters)凈化后，得到的液體旋蒸至干后，殘留物用1.0毫升的流動(dòng)相(乙腈/水＝7/3，V/V)復(fù)溶，超聲溶解后用0.2μm的濾膜過濾，得待檢測液供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析；

(3)UPLC-MS分析

待檢測液經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測分析，內(nèi)標(biāo)法定量；

色譜條件為：色譜柱：Waters ACQUITY CSHTM C₁₈柱，規(guī)格：100*2.1mm，1.7μm；進(jìn)樣量：10μL；流速：0.2mL/min；柱溫為45℃；流動(dòng)相設(shè)置為：A相超純水，30％體積；B相為乙腈，70％體積；洗脫程序設(shè)置為等度洗脫：A保持30％不變，B保持70％不變。

質(zhì)譜條件為：質(zhì)譜設(shè)置為負(fù)離子模式，純度99.39％的氮?dú)鉃殄F孔氣，流速60L/h，純度99.9999％的氬氣為碰撞氣，流速600L/h；毛細(xì)管電壓：3.5KV，離子源溫度120℃，汽化溫度，380℃；NF-DNPH和PDAB-DNPH的母離子分別設(shè)置為m/z 320.0和m/z 328.1，子離子分別設(shè)置為m/z 273.3、161.2和m/z 294.9、147.0；碰撞能分別設(shè)置為15eV和28eV。(4)方法的線性范圍和檢出限

NF和PDAB標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：NF和PDAB分別用流動(dòng)相(乙腈/水＝7/3，V/V)配制成濃度為0.1和1.0μg/mL的儲(chǔ)備液。根據(jù)實(shí)際需要用流動(dòng)相稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

配制一系列不同濃度的NF標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ng/mL，其中PDAB濃度恒定為100ng/mL，經(jīng)DNPH衍生和凈化步驟(步驟2)，依次進(jìn)樣，分別以NF-DNPH的峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度值為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，NF-DNPH在0.5-1.0ng/mL濃度范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R²大于0.995。

(5)長期穩(wěn)定性和特異性

在兩個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，將PDAB-DNPH內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液每隔兩周分析一次，色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5％，這表明PDAB-DNPH衍生物具備足夠的穩(wěn)定性，可以存放數(shù)月。用分析不同種類空白樣品(魚，蟹和蝦)的方式考察衍生物的特異性。結(jié)果顯示，檢測目標(biāo)物附近沒有基質(zhì)效應(yīng)的干擾作用(圖1-圖4)。

研究表明，NF的加標(biāo)回收率很低，盡管將前處理方法經(jīng)過各種優(yōu)化，回收率依然維持在50％以下，究其原因可能是NF化學(xué)性質(zhì)不太穩(wěn)定，具有光和空氣敏感性。這也是以NF為目標(biāo)物的檢測方法報(bào)道極少的原因之一。以2,4二硝基苯肼為衍生化試劑，將NF轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的腙類化合物，解決了定性識(shí)別的問題，如果要定量測定NF的準(zhǔn)確含量，方法學(xué)上需要NF的同位素內(nèi)標(biāo)物，而目前市面上并無相關(guān)的化合物研究和出售。本發(fā)明提出了一種定量檢測NF的內(nèi)標(biāo)物，經(jīng)過方法學(xué)的驗(yàn)證，對(duì)二甲氨基苯甲醛(PDAB)能夠起到內(nèi)標(biāo)校正的作用，使NF的加標(biāo)回收率達(dá)到90％左右，滿足了定量測試的要求。

實(shí)際樣品測定

采用本方法對(duì)水產(chǎn)品批發(fā)市場采購的15份南美白對(duì)蝦和25份海捕的梭子蟹中的NF殘留量進(jìn)行測定，其中有3個(gè)樣品中檢出NF含量在0.5-1.5ng/g之間。

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以PDAB為內(nèi)標(biāo)物、采用DNPH在酸性水溶液中衍生化，Oasis PRiME HLB固相萃取小柱凈化等前處理方法提取凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定水產(chǎn)品中痕量呋喃西林代謝物5-硝基-2-糠醛殘留量。結(jié)果表明，本方法具有簡便、靈敏、準(zhǔn)確的有點(diǎn)，可以用于水產(chǎn)品中痕量呋喃西林代謝物的定性和定量分析。

以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。