本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫學(xué)中熒光免疫層析技術(shù)領(lǐng)域，包括蛋白交聯(lián)技術(shù)、膜層析技術(shù)、標(biāo)記免疫分析技術(shù)等。具體地說(shuō)是一種能夠快速準(zhǔn)確的對(duì)血清、血漿和全血等樣品中孕酮進(jìn)行定量分析的孕酮測(cè)定試劑盒及制作方法。

背景技術(shù)：
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孕酮(Progesterone,PROG)是一種含21碳的固醇類激素，為類固醇激素合成過(guò)程中的中間代謝產(chǎn)物。由膽固醇經(jīng)孕烯醇酮通過(guò)異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化而成。在非妊娠婦女，卵巢中的卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生孕酮，妊娠期間，孕酮?jiǎng)t主要由胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞層分泌，故血中孕酮水平主要與胎盤重量及血液灌注量相關(guān)。孕早期上升較慢，13周后增快，足月時(shí)達(dá)高峰。在血中，孕酮主要與皮質(zhì)類固醇結(jié)合蛋白(CBG)及白蛋白相結(jié)合，血液中絕大部分孕酮為結(jié)合型，極少數(shù)為游離型。孕酮主要在肝臟降解，被還原成孕二醇，孕二醇再與硫酸或葡萄糖醛酸結(jié)合后經(jīng)腎排出。孕酮對(duì)調(diào)節(jié)月經(jīng)周期和維持妊娠具有重要的生理作用，可促進(jìn)子宮內(nèi)膜分泌期的轉(zhuǎn)化，為受精卵著床做準(zhǔn)備；松弛子宮肌，降低對(duì)前列腺素和催產(chǎn)素的反應(yīng)性；抑制輸卵管節(jié)律性收縮。孕酮還有促乳腺腺泡增生，增加能量代謝，升高基礎(chǔ)體溫，促進(jìn)水鈉排除的作用。孕酮對(duì)下丘腦-垂體系統(tǒng)具有正、負(fù)反饋?zhàn)饔?，可調(diào)控垂體促性腺激素的合成和分泌。排卵前小劑量孕酮協(xié)同E3誘發(fā)排卵前LH高峰出現(xiàn)，排卵后大劑量孕酮對(duì)下丘腦-垂體系統(tǒng)則呈現(xiàn)負(fù)反饋?zhàn)饔谩?/p>

血液中的女性孕酮幾乎都是由黃體或胎盤所產(chǎn)生；男性孕酮水平很低，主要由腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生。孕酮是一個(gè)重要的激素，它不僅在月經(jīng)周期的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，在維持妊娠中也是必不可少的。孕酮在月經(jīng)周期后期使子宮黏膜內(nèi)腺體生長(zhǎng)，子宮充血，內(nèi)膜增厚，為受精卵植入作好準(zhǔn)備；受精卵植入后則使之產(chǎn)生胎盤，并減少妊娠子宮的興奮性，抑制其活動(dòng)，使胎兒安全生長(zhǎng)。血清中的孕酮在排卵后濃度迅速升高，因可能發(fā)生的流產(chǎn)和異常妊娠的手段。孕酮測(cè)定用于確定排卵、孕激素治療監(jiān)測(cè)和早期妊娠狀況的評(píng)價(jià)，在判斷黃體功能狀態(tài)和方面具有特別重要的意義，是研究卵巢生理和病理生理不可缺少的手段。

免疫分析技術(shù)是利用微量抗原與相應(yīng)的高特異性抗體之間的免疫反應(yīng)，來(lái)檢測(cè)如激素、藥物、蛋白質(zhì)、多肽、酶、腫瘤相關(guān)抗原、微生素、病毒、細(xì)菌及金屬元素等生物體內(nèi)活性物質(zhì)。免疫分析技術(shù)包括標(biāo)記免疫分析、非標(biāo)記免疫分析和儀器免疫分析。本試劑盒利用的含有稀土元素的羧基乳膠微球標(biāo)記免疫分析技術(shù)是屬于標(biāo)記免疫分析之一種。

熒光免疫分析(FIA)和放射免疫分析(RIA)自問(wèn)世以來(lái)，經(jīng)歷了幾十年的發(fā)展，但是人們?cè)絹?lái)越感覺(jué)到FIA因自然本地太高，干擾檢測(cè)結(jié)果；RIA采用同位素標(biāo)記，對(duì)人體有極大危害并給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)不便。酶免疫分析(EIA)也因酶本身不穩(wěn)定，受其他影響因素較大，推廣應(yīng)用受到限制。80年代初，人們開始研究用稀土元素代替熒光物質(zhì)和同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)或抗體，將時(shí)間分辨技術(shù)引入到生物檢測(cè)領(lǐng)域，建立了新型的超微量時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(Time resolved Fluoroimmunoassay，簡(jiǎn)稱TrFIA)。該技術(shù)采用多學(xué)科先進(jìn)技術(shù)，集結(jié)了其他免疫分析的特點(diǎn)，在免疫學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，取得長(zhǎng)足的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。

TrFIA利用了具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘?價(jià)稀土離子及螯合物為示蹤物代替熒光物質(zhì)、酶、同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質(zhì)、核酸探針及生物細(xì)胞，待反應(yīng)體系(如抗原抗體反應(yīng)、核酸探針雜交、生物素親和素反應(yīng)以及靶細(xì)胞對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)等)發(fā)生后，用TrFIA檢測(cè)儀測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度。根據(jù)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，從而達(dá)到定量分析。在通常的熒光測(cè)定中，由于測(cè)試樣品中含有多種熒光成分，背景熒光(來(lái)自樣品中的膠體顆粒和溶劑分子引起的散射光以及血清中蛋白質(zhì)和其他化合物發(fā)出的非特異性熒光)強(qiáng)度大、干擾強(qiáng)，成為熒光分析法大范圍推廣的瓶頸。TrFIA之所以能夠成為繼EIA、RIA之后一種新的靈敏的檢測(cè)方法，主要取決于鑭系元素獨(dú)特的熒光特點(diǎn)、檢測(cè)中采用的波長(zhǎng)分辨和時(shí)間延遲技術(shù)以及解離-增強(qiáng)技術(shù)。

鑭系元素(lanthanide,Ln)屬于稀土元素，共有17中，常用于TrFIA主要有銪(Eu)、釤(Sm)、鋱(Tb)、鏑(Dy)。鑭系元素具有獨(dú)特的熒光發(fā)光特點(diǎn)，與普通熒光相比，鑭系離子螯合物熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，為傳統(tǒng)熒光的10³-10⁶倍。如鑭系離子螯合物的熒光衰變時(shí)間在60-900μs，常用的Eu³⁺熒光衰變時(shí)間為714μs，普通熒光免疫分析中熒光團(tuán)的熒光衰變時(shí)間只有1-100μs，樣品中一些蛋白質(zhì)的熒光衰變時(shí)間僅為1-10μs，因此利用時(shí)間分辨技術(shù)，延遲一定時(shí)間后測(cè)量，便可獲得Eu³⁺特異性熒光信號(hào)。同時(shí)由于衰變時(shí)間長(zhǎng)，Eu³⁺標(biāo)記物在測(cè)量時(shí)間里可以反復(fù)被激發(fā)，每次激發(fā)后由激發(fā)態(tài)很快躍遷到基態(tài)，就有熒光發(fā)出，然后又可被重新激發(fā)，如此每秒可有1000次激發(fā)，使得TrFIA熒光標(biāo)記物的相對(duì)比活性很高。鑭系元素?zé)晒夤庾V的最大特征是激發(fā)光與發(fā)射光之間的Stokes位移較大，Eu³⁺激發(fā)波長(zhǎng)為337nm，發(fā)射波長(zhǎng)為615nm，Stokes位移可達(dá)278nm；同時(shí)Eu³⁺被激發(fā)的熒光光帶極窄，熒光的發(fā)射峰非常尖銳，可使儀器調(diào)整在極窄的波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定，這樣就幾乎完全消除了背景熒光的干擾，繼而通過(guò)時(shí)間延遲和波長(zhǎng)分辨，將強(qiáng)特異性熒光和背景熒光辨開(故稱為時(shí)間分辨)，使干擾達(dá)到幾乎為零。

鑒于以上標(biāo)記方法及檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，本試劑盒具有良好的檢測(cè)特異性、較高的靈敏度、操作的簡(jiǎn)便性以及穩(wěn)定的熒光標(biāo)記物保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)和不足，提出了一種利用熒光免疫層析的靈敏性，結(jié)合熒光免疫層析分析儀實(shí)現(xiàn)的靈敏度高、快捷簡(jiǎn)便，可以準(zhǔn)確定量的孕酮測(cè)定試劑盒及制作方法。

本發(fā)明可以通過(guò)以下措施達(dá)到：

一種孕酮測(cè)定試劑盒，設(shè)有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設(shè)有：PVC板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結(jié)合墊上吸附有稀土Eu³⁺熒光微球標(biāo)記的抗孕酮單克隆抗體-微球偶聯(lián)復(fù)合物，所述稀土熒光微球的直徑為100-250nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素中的一種或幾種，在基態(tài)下穩(wěn)定，在300-400nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長(zhǎng)范圍為550-650nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來(lái)源于針對(duì)2-6個(gè)不同的孕酮抗原表位的單克隆抗體細(xì)胞株。

本發(fā)明所述結(jié)合墊的稀土熒光微球的直徑優(yōu)選是120-150nm；所述稀土熒光微球優(yōu)選含有一種或幾種稀土鑭系元素；結(jié)合墊上稀土熒光微球標(biāo)記的抗體優(yōu)選來(lái)源于針對(duì)2個(gè)不同抗原表位的單克隆細(xì)胞細(xì)胞株。

本發(fā)明所述結(jié)合墊采用如下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于150mM Tris-HCL處理液中(含1.0％Triton X-100，2.5％BSA，pH7.4)，4℃浸泡2小時(shí)，然后取出37℃烘箱烘干4小時(shí)，備用，將玻璃纖維膜放在Bio-DotXYZ3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)上，用Bio-Jet Quanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標(biāo)記的抗孕酮單克隆抗體偶聯(lián)復(fù)合物噴到玻璃纖維膜，37℃烘干1小時(shí)后制得。

本發(fā)明中結(jié)合墊上的所述稀土熒光微球標(biāo)記的抗孕酮單克隆抗體采用如下步驟制得：

步驟1：?jiǎn)慰寺】贵w細(xì)胞株的獲得：用孕酮純品免疫小鼠，采用標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體制備方法制備特異性高親和力的單克隆抗體細(xì)胞株，對(duì)所獲得的單抗細(xì)胞株進(jìn)行配對(duì)篩選，根據(jù)配對(duì)結(jié)果和親和力數(shù)據(jù)優(yōu)選出用于試劑盒的單抗細(xì)胞株；

步驟2：?jiǎn)慰寺】贵w的制備：采用標(biāo)準(zhǔn)的腹水生產(chǎn)工藝制備并純化抗孕酮單克隆抗體，分裝后保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟3：稀土熒光微球的醛基化：取5mg稀土熒光微球，用20mM，pH 9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時(shí)間為5分鐘，最后重懸于100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，加入500μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時(shí)，采用同樣的離心法洗滌和重懸到100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟4：稀土熒光微球標(biāo)記的抗孕酮單克隆抗體的制備：選取來(lái)自2個(gè)不同抗原表位的單克隆細(xì)胞細(xì)胞株的單克隆抗體，按照質(zhì)量比1:1將2mg孕酮單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過(guò)夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應(yīng)過(guò)夜；然后，加入硼氫化鈉至終濃度5mM，4℃反應(yīng)4小時(shí)；再加入等體積的封閉液(50mM Tris-HCL，pH7.4，含2％BSA，5％蔗糖)，4℃封閉過(guò)夜；然后用50mM Tris-HCL，pH7.4的緩沖液采用離心法洗滌3遍，重懸于100μl的50mM Tris-HCL緩沖液中(含1.2％NaCL，0.5％BSA，0.1％Tween 20)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明所述包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜通過(guò)以下步驟制得：

步驟1：采用與結(jié)合墊上所用抗孕酮單克隆抗體細(xì)胞株不同的細(xì)胞株，采用標(biāo)準(zhǔn)的腹水生產(chǎn)工藝制備并純化抗孕酮單克隆抗體，保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟2：分別用包被稀釋液將上述鼠源抗孕酮單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體調(diào)整濃度到1-3mg/ml，膜液量為1-3μl/cm，將它們分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進(jìn)行包被，檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔為3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時(shí)。

本發(fā)明所述樣品墊通過(guò)以下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于含有1.0％Triton X-100，2.5％BSA，0.15M Tris緩沖液，pH7.5的處理液中，于4℃浸泡4個(gè)小時(shí)，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時(shí)。

本發(fā)明還提供了一種如上所述試劑盒實(shí)現(xiàn)的孕酮制作方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟1：將檢測(cè)試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；

步驟2：讀卡：將IC卡放置在干式熒光免疫分析儀標(biāo)注位置，讀取相關(guān)信息，所述熒光免疫層析分析儀是一種光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)孕酮的測(cè)定范圍為0.30-50ng/mL；

步驟3：加樣：血清/血漿：取100μL血清/血漿樣本垂直滴加至測(cè)試卡加樣處；全血：取150μL全血樣本垂直滴加至測(cè)試卡加樣處；取樣時(shí)注意不要吸入氣泡；

步驟4：檢測(cè)，可采用自動(dòng)測(cè)試或即時(shí)測(cè)試兩種模式進(jìn)行檢測(cè)，自動(dòng)測(cè)試：將測(cè)試卡插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，按測(cè)試鍵，儀器將自動(dòng)對(duì)測(cè)試卡進(jìn)行掃描分析檢測(cè)，即時(shí)測(cè)試：測(cè)試卡室溫放置10min后，插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，點(diǎn)擊即時(shí)測(cè)試。

本發(fā)明提供一種利用稀土羧基乳膠微球標(biāo)記的熒光免疫層析技術(shù)制備的孕酮測(cè)定試劑盒，同時(shí)適合血清、血漿和全血樣本，并適合臨床上單人份檢測(cè)，相對(duì)于孕酮定性膠體金試劑，能定量檢測(cè)樣本中的孕酮含量，具有更明確的臨床指導(dǎo)意義，具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明：

附圖1是本發(fā)明中試紙卡的結(jié)構(gòu)示意圖。

附圖2是本發(fā)明中實(shí)施例2的準(zhǔn)確度分析結(jié)果示意圖。

附圖3是本發(fā)明中實(shí)施例2的準(zhǔn)確度分析結(jié)果示意圖。

附圖4是本發(fā)明中實(shí)施例2的準(zhǔn)確度分析結(jié)果示意圖。

附圖標(biāo)記：PVC板1、樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4、吸水墊5。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明：

如附圖1所示，本發(fā)明首先提出了一種孕酮測(cè)定試劑盒，盒內(nèi)設(shè)有試紙卡，所述試紙卡由下至上依次設(shè)有：PVC板1、樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5，其中結(jié)合墊上吸附有稀土Eu³⁺熒光微球標(biāo)記的抗孕酮單克隆抗體-微球偶聯(lián)復(fù)合物，所述稀土熒光微球的直徑為150nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素Eu³⁺，在基態(tài)下穩(wěn)定，在337nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長(zhǎng)615nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來(lái)源于針對(duì)2-6個(gè)不同的孕酮抗原表位的單克隆抗體細(xì)胞株。

所述結(jié)合墊3的稀土熒光微球的直徑優(yōu)選是150nm；所述稀土熒光微球優(yōu)選含有稀土鑭系元素銪(Eu³⁺)；結(jié)合墊上稀土熒光微球標(biāo)記的抗體優(yōu)選來(lái)源于針對(duì)2個(gè)不同抗原表位的單克隆細(xì)胞細(xì)胞株。

實(shí)施例1：

孕酮測(cè)定試劑盒中試紙卡的各組成部分可以通過(guò)以下措施制得：

1、樣品墊2的制備：

將玻璃纖維膜浸泡于含有1.0％Triton X-100，2.5％BSA，0.15M Tris緩沖液，pH7.5的處理液中，于4℃浸泡4個(gè)小時(shí)，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時(shí)。2、吸附熒光微球標(biāo)記抗體的結(jié)合墊3的制備：

將玻璃纖維膜浸泡于150mM Tris-HCL處理液中(含1.0％Triton X-100，2.5％BSA，pH7.4)，4℃浸泡2小時(shí)，然后取出37℃烘箱烘干4小時(shí)，備用，將玻璃纖維膜放在Bio-DotXYZ3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)上，用Bio-Jet Quanti300非接觸式微定量噴頭將稀土Eu³⁺熒光微球標(biāo)記的抗孕酮單克隆抗體偶聯(lián)復(fù)合物噴到玻璃纖維膜，37℃烘干1小時(shí)后制得。

稀土熒光納米微球的醛基化：取5mg稀土熒光納米微球，用20mM，pH9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時(shí)間為5分鐘，最后重懸于100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，加入500μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時(shí)，采用同樣的離心法洗滌和重懸到100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃?zhèn)溆茫?/p>

稀土Eu³⁺熒光微球標(biāo)記的抗孕酮單克隆抗體的制備：選取來(lái)自2個(gè)不同抗原表位的單克隆細(xì)胞細(xì)胞株的單克隆抗體，按照質(zhì)量比1:1將2mg抗孕酮單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過(guò)夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應(yīng)過(guò)夜；然后，加入硼氫化鈉至終濃度5mM，4℃反應(yīng)4小時(shí)；再加入等體積的封閉液(50mM Tris-HCL，pH7.4，含2％BSA，5％蔗糖)，4℃封閉過(guò)夜；然后用50mM Tris-HCL，pH7.4的緩沖液采用離心法洗滌3遍，重懸于100μl的50mM Tris-HCL緩沖液中(含1.2％NaCL，0.5％BSA，0.1％Tween 20)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

3、包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜4的制備：

采用與結(jié)合墊上所用抗孕酮單克隆抗體細(xì)胞株不同的細(xì)胞株，采用標(biāo)準(zhǔn)的腹水生產(chǎn)工藝制備并純化抗孕酮單克隆抗體，保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

分別用包被稀釋液將上述鼠源抗孕酮單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體調(diào)整濃度到1mg/ml，膜液量為1μl/cm，將它們分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進(jìn)行包被，檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔為4mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時(shí)。

試紙卡的組裝：在PVC板1上依次粘貼經(jīng)過(guò)處理的樣品墊2、吸附有稀土熒光標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊3、包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜4和吸水墊5，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。

上述各步驟中選用的設(shè)備及原料優(yōu)選以下原料：

孕酮特異性配對(duì)抗體；孕酮質(zhì)控品：英國(guó)朗道實(shí)驗(yàn)診斷有限公司；稀土熒光微球：上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；硝酸纖維素(NC)膜：Millipore公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白：Sigma產(chǎn)品，其它常用試劑均為分析純?cè)噭?/p>

實(shí)施例2：準(zhǔn)確度試驗(yàn)

選用上述試紙卡以及熒光免疫層析分析儀(型號(hào)：NEO-007)，

熒光免疫分析儀參數(shù)的設(shè)定：在熒光免疫分析儀上設(shè)定好試紙卡工藝參數(shù)后，取上述組裝好的試紙卡，分別用0.3、3、6、10、20、40、50ng/mL的孕酮校準(zhǔn)品，用試紙卡進(jìn)行測(cè)定，得到各校準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度值，將結(jié)果輸入到分析儀的參數(shù)中，完成分析儀的參數(shù)的設(shè)定。

主要檢測(cè)材料：臨床樣本由相關(guān)醫(yī)院獲得，共300份膠乳增強(qiáng)免疫比濁法定值樣本，其中血清樣本100份，血漿樣本100份，全血樣本100份，孕酮含量分布區(qū)間為0.3-50ng/mL之間。

檢測(cè)方法：

步驟1：將檢測(cè)試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；

步驟2：讀卡：將IC卡放置在干式熒光免疫分析儀標(biāo)注位置，讀取相關(guān)信息；

步驟3：加樣：血清/血漿：取100μL血清/血漿樣本垂直滴加至測(cè)試卡加樣處，全血：取150μL全血樣本垂直滴加至測(cè)試卡加樣處，取樣時(shí)注意不要吸入氣泡；

步驟4：檢測(cè)，可采用自動(dòng)測(cè)試或即時(shí)測(cè)試兩種模式進(jìn)行檢測(cè)，自動(dòng)測(cè)試：將測(cè)試卡插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，按測(cè)試鍵，儀器將自動(dòng)對(duì)測(cè)試卡進(jìn)行掃描分析檢測(cè)，即時(shí)測(cè)試：測(cè)試卡室溫放置10min后，插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，點(diǎn)擊即時(shí)測(cè)試。

試驗(yàn)結(jié)果分析：

臨床樣本檢測(cè)試劑制備完成后，按檢測(cè)方法對(duì)所有臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，并分析檢測(cè)結(jié)果。

試驗(yàn)結(jié)果：

如附圖2所示，以實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的檢測(cè)值為Y軸，以對(duì)照系統(tǒng)的測(cè)驗(yàn)值為X軸，繪制散點(diǎn)圖，并進(jìn)行相關(guān)性分析。臨床樣本檢測(cè)對(duì)300份臨床定值樣本檢測(cè)，樣本平均偏差值小于10％，最大偏差小于20％，R2>0.98，一致性系數(shù)>0.90。檢測(cè)結(jié)果表明制備的檢測(cè)試劑盒性能良好，適合用于臨床檢測(cè)，滿足不同客戶不同檢測(cè)場(chǎng)合的差異化需要。

本發(fā)明提供一種利用稀土熒光免疫層析技術(shù)制備的孕酮快速定量免疫層析檢測(cè)試劑盒，同時(shí)適合血清/血漿和全血樣本，并適合臨床上單人份檢測(cè)，相對(duì)于孕酮定性膠體金試劑，能定量檢測(cè)樣本中的孕酮含量，具有更明確的臨床指導(dǎo)意義，具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。