本發明屬于新型功能化納米材料以及電化學傳感技術領域，具體涉及一種氧化石墨烯/甲胎蛋白適體電化學傳感器的制備方法。

背景技術：

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，afp)是一種血清糖蛋白，是目前原發性肝癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)確診最重要的生物標志物。此外，血清中甲胎蛋白含量異常還與一些其他相關疾病有關，如神經管缺陷、腦/脊髓畸形、染色體異常等。因此，血清中甲胎蛋白含量的檢測對肝癌臨床診斷以及一些疾病的早期篩查具有很重要的意義。

目前，血清中甲胎蛋白含量的確定，臨床檢測主要采用免疫測定法。常規免疫測定包括酶聯免疫吸附測定、放射免疫測定以及熒光免疫測定。但是，這些方法固有其自身缺陷，如會存在部分標記抗體的損失，會造成輻射危害以及環境污染等；并且，熒光免疫測定中所需的鑭系元素標記物價格昂貴且容易受到外界干擾。此外，以上分析方法所需分析時間長，且需具備熟練的操作員。

目前亟需一種靈敏度高、選擇性好、制備簡單、分析速度快、反應條件溫和、制備成本低的方法用于甲胎蛋白的檢測。

技術實現要素：

為了克服現有技術中甲胎蛋白檢測方法的不足，本發明的第一個方面，提供一種用于甲胎蛋白檢測的氧化石墨烯/甲胎蛋白適體電化學傳感器，該電化學傳感器是通過以下方法制備得到的：

以羧基化氧化石墨烯為基底，通過碳二亞胺反應在基底上嫁接氨基化甲胎蛋白適體，得到氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物；

然后以該氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物修飾玻碳電極，并用牛血清蛋白封閉修飾后玻碳電極上的非特異性吸附位點，得到氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物-電極；

再將氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物-電極浸于不同濃度的甲胎蛋白中孵化；孵化結束后，取出電極并洗滌，得到捕獲有目標分析物甲胎蛋白的氧化石墨烯/甲胎蛋白適體電化學傳感器。

本發明還保護所述的氧化石墨烯/甲胎蛋白適體電化學傳感器在檢測甲胎蛋白含量中的應用。

為了提供一種靈敏度高、選擇性好、制備簡單、分析速度快、反應條件溫和、制備成本低的甲胎蛋白的檢測方法，本發明的第二個方面，提供一種采用上述電化學傳感器檢測甲胎蛋白的方法，該方法不屬于疾病的診斷與治療方法，包括以下步驟：

(1)采用電化學工作站的三電極體系進行檢測，以上述結合了甲胎蛋白目標分析物的電化學傳感器為工作電極，以銀-氯化銀電極、鉑絲電極為參比電極和對電極，交流阻抗測試參數設置：頻率范圍為0.05～100khz，交流微擾振幅為5mv，極化電路選擇開路電位；

(2)將三電極浸沒于含4～10mm鐵氰化鉀的pbs電解質溶液中進行交流阻抗測試，不同濃度甲胎蛋白溶液孵化的傳感界面，其阻抗信號大小不同，據此繪制工作曲線；

(3)采用以上方法對實際樣品中的甲胎蛋白進行分析檢測。

與現有技術相比，本發明的技術方案具有如下有益效果：

(1)本發明采用羧基化氧化石墨烯作為傳感器的基底材料，氧化石墨烯比表面積大、機械性能好、生物相容性好，其不僅能夠增大電極表面積，還能夠增加甲胎蛋白適體的修飾量。

(2)本發明將氨基化甲胎蛋白適體用于捕獲甲胎蛋白分析物，能夠克服抗體分析穩定性較差、制備較復雜以及成本高等缺點，既可以提高檢測的特異性，又可以增強分析的靈敏度。

(3)本發明采用阻抗法考察傳感界面由不同濃度甲胎蛋白溶液所引起的阻抗信號的變化，采用這種免標記測定簡化了分析步驟，提高了分析速度。

(4)與傳統甲胎蛋白分析檢測方法不同，本發明將具有高特異性識別的甲胎蛋白適體引入傳感界面，克服了傳統方法中存在的冗雜標記操作和輻射、污染等危害。本發明設計了一種靈敏度高、選擇性好、制備簡單、反應條件溫和、成本低的電化學分析方法以實現對甲胎蛋白的高效檢測。

附圖說明

構成本發明的一部分的說明書附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。

圖1是氧化石墨烯/甲胎蛋白適體電化學傳感器制備原理圖。

圖2是氧化石墨烯羧基化處理前后阻抗譜圖。

圖3是電極修飾及用于檢測甲胎蛋白的阻抗譜圖。

具體實施方式

應該指出，以下詳細說明都是示例性的，旨在對本發明提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據本發明的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式也意圖包括復數形式，此外，還應當理解的是，當在本說明書中使用術語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

沒有特殊說明的話，本發明中采用的試劑或材料均可通過常規途徑得到。

本發明中的pbs是磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersaline)，它是生物化學研究中使用最為廣泛的一種緩沖液。

正如背景技術所介紹的，現有技術中甲胎蛋白的檢測方法存在著一些不足，為了解決如上的技術問題，本發明的第一個方面，提出一種用于甲胎蛋白檢測的氧化石墨烯/甲胎蛋白適體電化學傳感器，該電化學傳感器是通過以下方法制備得到的：

以羧基化氧化石墨烯為基底，通過碳二亞胺反應在基底上嫁接氨基化甲胎蛋白適體，得到氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物；

然后以該氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物修飾玻碳電極，并用牛血清蛋白封閉修飾后玻碳電極上的非特異性吸附位點，得到氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物-電極；

再將氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物-電極浸于不同濃度的甲胎蛋白中孵化；孵化結束后，取出電極并洗滌，得到捕獲有目標分析物甲胎蛋白的氧化石墨烯/甲胎蛋白適體電化學傳感器。

經過試驗發現，不同的工藝參數對得到的氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物具有一定的影響，本發明從提高檢測靈敏度的角度出發，經過對各個步驟工藝參數的篩選優化，得到一種氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物的制備方法，通過該制備方法將足夠量的氨基化甲胎蛋白嫁接至羧基化的氧化石墨烯上，以最大程度的提高該電化學傳感器的靈敏度。該制備方法包括以下步驟：

(1)將2～6mg氧化石墨烯于1～3ml去離子水中超聲分散1～1.5h，得到分散均勻的氧化石墨烯懸乳液；

(2)向獲得的氧化石墨烯懸乳液中加入0.3～0.6gnaoh和0.2～0.5g氯乙酸，并超聲處理10～12h，以增加氧化石墨烯上的羧基；

(3)將經過羧基化的氧化石墨烯離心洗滌后，加入1～4ml0.3m的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和1～3ml0.2m的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，并進行超聲處理1～1.5h，以活化氧化石墨烯上的羧基；

(4)將經過活化的氧化石墨烯離心洗滌后，加入0.5～1ml濃度為30～250μg/ml的氨基化甲胎蛋白適體溶液孵化20～40min，以將甲胎蛋白適體鏈嫁接到氧化石墨烯表面；

(5)將步驟(4)中獲得的氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物進行離心洗滌，以除去未結合的甲胎蛋白適體，然后將離心洗滌后所得復合物用pbs溶解，并超聲分散得到均勻分散液，即得到氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物分散液。

本發明中的基底材料采用羧基化氧化石墨烯，目的是增加氧化石墨烯表面的羧基官能團含量，進而提高后續采用edc/nhs將氨基化甲胎蛋白適體嫁接到基底材料上的嫁接量，從而提高傳感器的靈敏度；經過試驗驗證，采用羧基化的氧化石墨烯對最終的檢測結果具有重要的影響，它是顯著提高該電化學傳感器檢測靈敏度的關鍵因素之一。否則，就會使得氧化石墨烯表面剩余較多的未嫁接位點，由于石墨烯及石墨烯衍生物等材料本身就有好的吸附性，若適體嫁接數量很少，就會殘留較多的吸附位點，導致在進行目標蛋白甲胎蛋白分析時存在較大背景。

本發明采用氨基化甲胎蛋白適體作為基底材料的修飾物，用來捕獲甲胎蛋白目標分析物，不僅可以提高傳感器檢測的選擇性，而且還可以提高分析的靈敏度。

本發明中，氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物修飾玻碳電極的方法包括以下步驟：

將3～10μl氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物分散液滴涂于玻碳電極表面，晾干后，將4～8μl質量分數為0.5％～1.5％的牛血清蛋白滴涂于修飾后的玻碳電極表面，并孵化15～60min，以封閉傳感界面的非特異性結合位點，即得到氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物-電極。

其中，在修飾玻碳電極之前，對玻碳電極進行預處理，預處理方法為：將玻碳電極(直徑為3mm)依次用粒徑為0.3μm、0.05μm的三氧化二鋁拋光粉處理，并先后用乙醇、去離子水將玻碳電極超聲清洗干凈。

本發中的甲胎蛋白適體是針對甲胎蛋白特異性篩選得到的，在本發明的一些技術方案中，所述甲胎蛋白適體為按照scientificreports|5:15552|doi:10.1038/srep15552設計的序列。與采用抗體分析的方法相比較，適體具有性質穩定、可長期保存、容易大量合成以及成本低等優勢。

經過試驗驗證，不同的制備方法使得檢測的靈敏度和準確性差異顯著，本發明針對甲胎蛋白的檢測，首先通過制備氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物，然后將復合物修飾于玻碳電極表面；這樣使得氧化石墨烯與甲胎蛋白適體直接在溶液中進行嫁接，反應充分，耗時短，避免了長時間浸泡反應導致的基底材料—羧基化氧化石墨烯的脫落現象，進而提高了甲胎蛋白檢測的靈敏度和準確性。本發明還考察了其它的制備方法，例如：首先制備氧化石墨烯-玻碳電極，然后制備氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物-玻碳電極，但是發現該制備方法得到的電化學傳感器的靈敏度和準確性都顯著降低，效果不理想。

本發明中所述的用于甲胎蛋白檢測的氧化石墨烯/甲胎蛋白適體電化學傳感器的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)將玻碳電極依次用粒徑為0.3μm、0.05μm的三氧化二鋁拋光粉處理，并先后用乙醇、去離子水將玻碳電極超聲清洗干凈；

(2)將3～10μl氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物分散液滴涂于玻碳電極表面，晾干；

(3)將4～8μl質量分數為0.5％～1.5％的牛血清蛋白滴涂于修飾后的玻碳電極表面，并孵化15～60min；

(4)將封閉后的玻碳電極浸沒于1～2ml含0.00001～100ng/ml甲胎蛋白的pbs溶液中孵化15～60min；電極取出后用pbs振蕩清洗，以除去未結合或弱結合的物質，即得到捕獲有目標分析物甲胎蛋白的氧化石墨烯/甲胎蛋白適體電化學傳感器。

為了提供一種靈敏度高、選擇性好、制備簡單、分析速度快、反應條件溫和、制備成本低的甲胎蛋白的檢測方法，本發明的第二個方面，提供一種采用上述電化學傳感器檢測甲胎蛋白的方法，為使得檢測結果的重復性好、準確性高，該方法對檢測條件進行篩選優化，得到包括以下步驟的檢測方法：

(1)采用電化學工作站的三電極體系進行檢測，以上述結合了甲胎蛋白目標分析物的電化學傳感器為工作電極，以銀-氯化銀電極、鉑絲電極為參比電極和對電極，交流阻抗測試參數設置：頻率范圍為0.05～100khz，交流微擾振幅為5mv，極化電路選擇開路電位；

(2)將三電極浸沒于含4～10mm鐵氰化鉀的pbs溶液中進行交流阻抗測試，不同濃度甲胎蛋白溶液孵化的傳感界面，其阻抗信號大小不同，據此繪制工作曲線；

(3)采用以上方法對實際樣品中的甲胎蛋白進行分析檢測。

以上方法為非疾病診斷和治療方法。在非疾病診斷和治療方法上，通過檢測甲胎蛋白的含量，可以發現相關的抗癌藥物，以及進行對相關抗癌藥物的篩選研究。

傳統的分析甲胎蛋白的方法如酶聯免疫吸附測定、放射免疫測定以及熒光免疫測定，這些方法會存在部分標記抗體的損失，會造成輻射危害以及污染環境等，并且熒光免疫測定中所需的鑭系元素標記物價格昂貴且容易受到外界干擾，而本發明將具有高特異性識別的甲胎蛋白適體引入傳感界面的設計，克服了傳統方法中存在的冗雜標記操作和輻射、污染等危害。采用氨基化甲胎蛋白適體捕獲甲胎蛋白目標分析物，不僅可以增強檢測的選擇性，而且可以提高分析的靈敏度。經試驗驗證，本發明的檢測方法檢測線可低至20～80fg/ml級別。以氧化石墨烯/甲胎蛋白適體修飾電極為工作電極，采用阻抗法考察傳感界面由不同濃度甲胎蛋白溶液所引起的阻抗信號的變化。當電極表面的適體結合了待測溶液中的甲胎蛋白后，會增大電極阻抗，并引起電解質溶液中氧化還原信號在電極表面的電子轉導速率降低，使得所測阻抗信號增大。本發明采用阻抗法進行免標記檢測，可簡化分析步驟，并提高分析速度。

為了使得本領域技術人員能夠更加清楚地了解本發明的技術方案，以下將結合具體的實施例詳細說明本發明的技術方案。

實施例1

氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物的制備方法，包括以下步驟：

(1)將2mg氧化石墨烯于1ml去離子水中超聲分散1h，得到分散均勻的氧化石墨烯懸乳液。

(2)于上述氧化石墨烯懸乳液中加入0.3gnaoh和0.2g氯乙酸，并超聲處理12h，以增加氧化石墨烯上的羧基。如圖2所示，氧化石墨烯在羧基化處理前后，其對應的阻抗譜發生了較大變化，表明羧化后的氧化石墨烯其表面的羧基官能團含量增加。

(3)將經過羧基化的氧化石墨烯離心洗滌，然后加入1.5ml0.3m的edc和1ml0.2m的nhs，并進行超聲處理1h，以活化氧化石墨烯上的羧基。

(4)將經過活化的氧化石墨烯離心洗滌后，加入0.5ml濃度為100μg/ml的氨基化甲胎蛋白適體溶液(tris-edta溶液配制備)孵化20min，以將甲胎蛋白適體鏈嫁接到氧化石墨烯表面。

(5)將上述氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物進行離心并用pbs洗滌，以除去未結合的甲胎蛋白適體。然后將離心所得復合物用0.5mlpbs溶解，并超聲分散得到均勻分散液。

實施例2

氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物的制備方法，包括以下步驟：

(1)將4mg氧化石墨烯于1.5ml去離子水中超聲分散1h，得到分散均勻的氧化石墨烯懸乳液。

(2)于上述氧化石墨烯懸乳液中加入0.4gnaoh和0.3g氯乙酸，并超聲處理12h，以增加氧化石墨烯上的羧基。

(3)將經過羧基化的氧化石墨烯離心洗滌，然后加入3ml0.3m的edc和2ml0.2m的nhs，并進行超聲處理1h，以活化氧化石墨烯上的羧基。

(4)將經過活化的氧化石墨烯離心洗滌后，加入0.75ml濃度為200μg/ml的氨基化甲胎蛋白適體溶液(tris-edta溶液配制備)孵化30min，以將甲胎蛋白適體鏈嫁接到氧化石墨烯表面。

(5)將上述氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物進行離心并用pbs洗滌，以除去未結合的甲胎蛋白適體。然后將離心所得復合物用0.5mlpbs溶解，并超聲分散得到均勻分散液。

實施例3

氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物的制備方法，包括以下步驟：

(1)將6mg氧化石墨烯于2ml去離子水中超聲分散1h，得到分散均勻的氧化石墨烯懸乳液。

(2)于上述氧化石墨烯懸乳液中加入0.6gnaoh和0.5g氯乙酸，并超聲處理12h，以增加氧化石墨烯上的羧基。

(3)將經過羧基化的氧化石墨烯離心洗滌，然后加入4ml0.3m的edc和3ml0.2m的nhs，并進行超聲處理1h，以活化氧化石墨烯上的羧基。

(4)將經過活化的氧化石墨烯離心洗滌后，加入1ml濃度為250μg/ml的氨基化甲胎蛋白適體溶液(tris-edta溶液配制備)孵化40min，以將甲胎蛋白適體鏈嫁接到氧化石墨烯表面。

(5)將上述氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物進行離心并用pbs洗滌，以除去未結合的甲胎蛋白適體。然后將離心所得復合物用0.75mlpbs溶解，并超聲分散得到均勻分散液。

實施例4

如圖1所示，一種用于腫瘤標志物檢測的氧化石墨烯/甲胎蛋白適體電化學傳感器的制備方法和甲胎蛋白的檢測方法，包括以下步驟：

(1)將直徑為3mm的玻碳電極依次用粒徑為0.3μm、0.05μm的三氧化二鋁拋光粉處理，并先后用乙醇、去離子水將電極超聲清洗干凈。

(2)將3μl氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物分散液(實施例1中制備得到的)滴涂于電極表面，并于室溫下晾干，4℃保存備用。

(3)將4μl質量分數為0.5％的牛血清蛋白滴涂于以上修飾電極表面，并于4℃環境下孵化15min，以封閉傳感界面的非特異性結合位點。

(4)將封閉后的修飾電極浸沒于1ml含0.00001～100ng/ml一系列不同濃度的甲胎蛋白的pbs標準溶液中孵化15min。電極取出后用pbs振蕩清洗，以除去未結合或弱結合的物質。

(5)采用電化學工作站的三電極體系進行檢測，以特異性結合了甲胎蛋白目標分析物的修飾電極為工作電極，以銀-氯化銀電極、鉑絲電極為參比電極和對電極，交流阻抗測試參數設置：頻率范圍為0.05～100khz，交流微擾振幅為5mv，極化電路選擇開路電位。

將三電極浸沒于含4mm鐵氰化鉀的pbs電解質溶液中進行阻抗測試，不同濃度甲胎蛋白溶液孵化的傳感界面，其阻抗信號大小不同，據此繪制工作曲線。

將實際樣品代替甲胎蛋白標準溶液，然后采用以上方法對實際樣品中的甲胎蛋白進行分析檢測。

如圖3所示，電極經修飾、封閉以及用于檢測目標蛋白后，阻抗譜發生了相應的變化。表明甲胎蛋白適體可以嫁接到氧化石墨烯表面；同時，經牛血清蛋白封閉后，適體能夠對目標蛋白進行特異性捕獲。

實施例5

一種用于腫瘤標志物檢測的氧化石墨烯/甲胎蛋白適體電化學傳感器的制備方法和甲胎蛋白的檢測方法，包括以下步驟：

(1)將直徑為3mm的玻碳電極依次用粒徑為0.3μm、0.05μm的三氧化二鋁拋光粉處理，并先后用乙醇、去離子水將電極超聲清洗干凈。

(2)將6μl氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物分散液(實施例2中制備得到的)滴涂于電極表面，并于室溫下晾干，4℃保存備用。

(3)將6μl質量分數為1％的牛血清蛋白滴涂于以上修飾電極表面，并于4℃環境下孵化25min，以封閉傳感界面的非特異性結合位點。

(4)將封閉后的修飾電極浸沒于1.5ml含0.00001～100ng/ml一系列不同濃度的甲胎蛋白的pbs標準溶液中孵化25min。電極取出后用pbs振蕩清洗，以除去未結合或弱結合的物質。

(5)采用電化學工作站的三電極體系進行檢測，以特異性結合了甲胎蛋白目標分析物的修飾電極為工作電極，以銀-氯化銀電極、鉑絲電極為參比電極和對電極，交流阻抗測試參數設置：頻率范圍為0.05～100khz，交流微擾振幅為5mv，極化電路選擇開路電位。

將三電極浸沒于含6mm鐵氰化鉀的pbs電解質溶液中進行阻抗測試，不同濃度甲胎蛋白溶液孵化的傳感界面，其阻抗信號大小不同，據此繪制工作曲線。

將實際樣品代替甲胎蛋白標準溶液，然后采用以上方法對實際樣品中的甲胎蛋白進行分析檢測。

實施例6

一種用于腫瘤標志物檢測的氧化石墨烯/甲胎蛋白適體電化學傳感器的制備方法和甲胎蛋白的檢測方法，包括以下步驟：

(1)將直徑為3mm的玻碳電極依次用粒徑為0.3μm、0.05μm的三氧化二鋁拋光粉處理，并先后用乙醇、去離子水將電極超聲清洗干凈。

(2)將10μl氧化石墨烯/甲胎蛋白適體復合物分散液(實施例3中制備得到的)滴涂于電極表面，并于室溫下晾干，4℃保存備用。

(3)將8μl質量分數為1.5％的牛血清蛋白滴涂于以上修飾電極表面，并于4℃環境下孵化40min，以封閉傳感界面的非特異性結合位點。

(4)將封閉后的修飾電極浸沒于1.5ml含0.00001～100ng/ml甲胎蛋白的pbs溶液中孵化40min。電極取出后用pbs振蕩清洗，以除去未結合或弱結合的物質。

(5)采用電化學工作站的三電極體系進行檢測，以特異性結合了甲胎蛋白目標分析物的修飾電極為工作電極，以銀-氯化銀電極、鉑絲電極為參比電極和對電極，交流阻抗測試參數設置：頻率范圍為0.05～100khz，交流微擾振幅為5mv，極化電路選擇開路電位。

將三電極浸沒于含10mm鐵氰化鉀的pbs電解質溶液中進行阻抗測試，不同濃度甲胎蛋白溶液孵化的傳感界面，其阻抗信號大小不同，據此繪制工作曲線。

將實際樣品代替甲胎蛋白標準溶液，然后采用以上方法對實際樣品中的甲胎蛋白進行分析檢測。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。