本發(fā)明涉及檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于適配體識別的試紙條檢測技術(shù)。

背景技術(shù)：

臨床上對惡性腫瘤進(jìn)行快速靈敏篩查常以腫瘤標(biāo)志物作為檢測的目標(biāo)分子。例如凝血酶是一種由凝血酶前體形成的絲氨酸蛋白質(zhì)水解酶，具有催化纖維蛋白元變成纖維蛋白，促進(jìn)血液凝固和調(diào)控凝血等作用，在解釋腫瘤的發(fā)生機(jī)制及作為早期診斷、療效及預(yù)后判斷等方面均具有重要意義。發(fā)展可以高靈敏檢測這些腫瘤標(biāo)志物蛋白質(zhì)的生物傳感器是惡性腫瘤早期診斷的一個非常有效的方法。

傳統(tǒng)的檢測方法需要昂貴的設(shè)備支持，同時樣品處理時間長，過程復(fù)雜，耗時耗力。而適配體試紙條技術(shù)可在5min內(nèi)觀察到檢測結(jié)果，價格低廉、反應(yīng)快速、靈敏度高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明利用適配體高特異性、高親和力等優(yōu)點(diǎn)，將其替代抗體用于試紙條技術(shù)，解決了試紙條技術(shù)中常見的假陰性假陽性等問題。同時利用核苷酸序列堿基互補(bǔ)配對原理制備質(zhì)控線，結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

納米金適配體探針的制備：取新制備粒徑為10nm左右的納米金溶液，濃縮后加入100μm巰基化適配體溶液，4℃內(nèi)反應(yīng)過夜。加入sds溶液，混勻后分批加入nacl溶液至終濃度為80mm，放于4℃避光環(huán)境下孵育過夜。于10000rpm下離心20min，用pbs重懸洗滌后用重懸液(0.01mpbs，5％蔗糖、0.5％peg，0.1％tween-20，0.05％mgso4，0.05％(nh4)2so4)重懸。

結(jié)合墊的制備：將納米金探針制備完成后，用點(diǎn)晶噴膜儀將金標(biāo)溶液噴于聚酯膜上，37℃烘干，于避光霞密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

核酸序列與鏈霉親和素復(fù)合物的制備：取鏈霉親和素20μl，分別加入100μmaptamer2及dna1序列，混勻后37℃孵育30min備用。

硝酸纖維素膜的處理：用點(diǎn)晶噴膜儀將制備好的核酸序列與鏈霉親和素復(fù)合物噴涂于140孔徑硝酸纖維素膜上，噴樣量為0.6μl/cm，檢測線與質(zhì)控線之間距離為6mm。處理后將其放于37℃烘箱烘干并于密閉環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

試紙條的組裝：將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次固定于聚乙烯底板上，相鄰兩部分重疊2mm，并用板條切割機(jī)將其切割成4mm寬，避光密閉環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明制備的試紙條使用方法：將試紙條至于水平面上，取待測液20μl，滴加于試紙條樣品墊上，5min后觀察結(jié)果。若硝酸纖維素膜上有兩條線，則檢驗結(jié)果呈陽性，若只有一條線，則檢驗結(jié)果呈陰性。

本發(fā)明制備的試紙條是利用適配體識別底物，納米金顯色原理制備。當(dāng)有凝血酶存在時，樣品中的凝血酶首先與結(jié)合墊上的納米金適配體探針結(jié)合形成凝血酶-aptamer1-納米金復(fù)合物結(jié)構(gòu)。當(dāng)其通過層析作用流過檢測線時，凝血酶再次被線上固定的另一種適配體捕獲形成aptamer2-凝血酶-aptamer1-納米金的復(fù)合結(jié)構(gòu)，因此t線顯色。當(dāng)液體流過質(zhì)控線時，線上固定的dna1序列會通過堿基互補(bǔ)非對原理捕獲金標(biāo)探針。無論有無底物存在，質(zhì)控線均可顯色。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明利用適配體代替?zhèn)鹘y(tǒng)免疫層析試紙條中的抗體，保證了與待測物的高親和力、高特異性的通知，大大降低了試紙條的制備成本。同時適配體制備周期短，性能穩(wěn)定，對有無免疫原性的靶標(biāo)均可篩選得到相應(yīng)的適配體，因此大大拓寬了試紙條的適用范圍。

本發(fā)明采用兩條不同適配體分別識別底物形成夾心結(jié)構(gòu)，大大降低了假陰性的出現(xiàn)。

本發(fā)明的質(zhì)控線沒有采用金標(biāo)探針適配體識別序列的互補(bǔ)序列，而是在通過polya識別探針適配體尾端添加的polyt序列，解決了適配體識別底物后無法與質(zhì)控線上dna1序列堿基互補(bǔ)配對的問題，使質(zhì)控線更穩(wěn)定，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。

附圖說明

圖1本發(fā)明試紙條的檢測原理示意圖；

圖2本發(fā)明檢測結(jié)果示意圖；

圖3本發(fā)明實(shí)際檢測結(jié)果圖。

具體實(shí)施方案

1.試紙要求

(1)陰性參考品符合率

用磷酸鹽緩沖溶液(0.01mpbs溶液，ph7.4)配制濃度為10mm的血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行10次平行檢測，一正常或矯正目力觀察結(jié)果，反應(yīng)在5min時觀察結(jié)果，應(yīng)為陰性。

用磷酸鹽緩沖溶液(0.01mpbs溶液，ph7.4)配制濃度為10mm的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行10次平行檢測，一正常或矯正目力觀察結(jié)果，反應(yīng)在5min時觀察結(jié)果，應(yīng)為陰性。

(2)陽性參考品符合率

用磷酸鹽緩沖溶液(0.01mpbs溶液，ph7.4)配制濃度為1000、700、400、100nm的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行10次平行檢測，一正常或矯正目力觀察結(jié)果，反應(yīng)在5min時觀察結(jié)果，不得出現(xiàn)陰性。

(3)最低檢出量

用磷酸鹽緩沖溶液(0.01mpbs溶液，ph7.4)配制濃度為1000、700、400、100、50、10、0nm的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行10次平行檢測，一正常或矯正目力觀察結(jié)果，反應(yīng)在5min時觀察結(jié)果，最低檢出量不高于10nm。

(4)再現(xiàn)性

用磷酸鹽緩沖溶液(0.01mpbs溶液，ph7.4)配制濃度為400nm的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行10次平行檢測，一正常或矯正目力觀察結(jié)果，結(jié)果一致，顯色度均一。

(5)穩(wěn)定性檢測

37℃放置10天后，各項指標(biāo)復(fù)合以上要求。

2.復(fù)雜樣品中凝血酶的檢測

為了考察所建立的方法能否用于實(shí)際樣品檢測，選擇稀釋的人血液作為檢測樣品。正常人血漿中凝血酶主要由外源性凝血途徑產(chǎn)生，每毫升血漿可產(chǎn)生210-360u的凝血酶。將血液盛于離心管中，置37℃環(huán)境中促其凝固，待血液凝固后，將其平衡后離心(3000rpm，離心10min)，取上清，分裝備用。

將人血清稀釋倍20(5％serum)，配制得到一定濃度的凝血酶樣品(5μl樣品分析對應(yīng)的凝血酶濃度為0，10，20，50，100nm，將試紙條平放于水平桌面上，取20μl待測液滴加于試紙條樣品墊上，5min后觀察結(jié)果。檢測線顏色隨著凝血酶濃度的增大逐漸加深，且與相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品得到的條帶基本無差異。

序列表

〈110〉江南大學(xué)

〈120〉一種基于適配體識別的凝血酶快速檢測試紙條

〈130〉

〈160〉1

〈170〉patentinversion3.5

〈210〉1

〈211〉40

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉1

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〈210〉2

〈211〉40

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉2

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〈211〉30

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉3

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