本發明涉及生物醫藥，具體涉及一種堿性磷酸酶底物染色液的制備方法及其應用。

背景技術：

1、堿性磷酸酶(alkaline?phosphatase,ap)是一種專一性較廣的磷酸酯水解酶，可以催化所有的磷酸酶水解反應和磷酸基團的轉移反應，在生物體內具有非常重要的生理功能。在免疫組化中，堿性磷酸酶(ap)及其底物作為顯色系統已經廣泛應用。抗體偶聯的堿性磷酸酶能夠水解含萘酚替代物類的磷酸鹽，產生不溶性的萘酚衍生物，隨后與合適的重氮鹽結合，在酶活性部位生成帶有顏色的不溶性偶氮染料，最終使組織切片中的抗原位置呈現不同的著色。常用的底物色原為bcip/nbt(藍色)和萘酚磷酸/重氮類化合物(紅色)。

2、目前，免疫組化染色使用比較廣泛的是過氧化物酶顯色系統，如辣根過氧化物酶(hrp)。hrp常用的底物是dab(棕黃色)和aec(紅色)，然而，dab是致癌劑，且判讀時會受色素沉積和紅細胞等因素的干擾，而aec形成的沉淀溶于酒精，因此，二者均會在應用上有所限制。堿性磷酸酶(ap)常用的底物固紅溶于有機溶劑，因此，需要搭配使用水溶性封片劑，并且顯色后的切片不能經過乙醇和二甲苯脫水處理，所以不利于長期保存。另外，市場上目前某些ap底物的色原和緩沖液的稀釋比例太高，不適用于全自動免疫組化染色機的染色。

3、因此，本領域亟需開發一種堿性磷酸酶底物染色液的制備方法，可形成不溶于有機溶劑的沉淀物以長期用于免疫組化染色，同時還可以適配自動化設備進行染色，以提高染色效率，節省人力與時間成本。

技術實現思路

1、為解決上述技術問題，本發明提供一種堿性磷酸酶底物染色液的制備方法，所述制備方法包括：

2、s1、制備底物色原溶液和底物緩沖液；

3、s2、將底物色原溶液和底物緩沖液混合，得到所述堿性磷酸酶底物染色液；

4、其中，所述底物色原溶液包括新品紅、鹽酸溶液、亞硝酸鈉、甘油、dmso、化學穩定劑和proclin300；所述底物緩沖液包括萘酚as-bi磷酸鹽、tris緩沖液、二甲基甲酰胺和tween-20。

5、具體地，所述底物色原溶液中，新品紅的用量為0.091～0.91g，鹽酸溶液的濃度為1.9％，鹽酸溶液的用量為20～50ml，亞硝酸鈉的用量為0.052～0.52g，甘油用量為10ml，dmso用量為2ml，化學穩定劑用量為40μl，proclin300用量為10μl。所述化學穩定劑為購自biodigen?inc.的concentrated?chemical?stabilizer，用于維持反應的穩定性。

6、具體地，所述萘酚as-bi磷酸鹽的用量為0.3g，所述tris緩沖液的濃度為21％，所述tris緩沖液的用量為50ml，所述tris緩沖液的ph為8.4，所述二甲基甲酰胺的用量為0.5ml，所述tween-20的用量為0.15ml。

7、具體地，所述底物色原溶液和底物緩沖液的混合比例為1:1～1：20。

8、具體地，所述底物色原溶液和底物緩沖液的混合比例為1:20。

9、具體地，所述底物色原溶液的配制方式為：將所述新品紅溶解于鹽酸溶液中，將混合溶液至于冰水浴中，之后在混合溶液中加入亞硝酸鈉，得到懸濁液，將懸濁液固液分離去除固體之后得到所述底物色原溶液。

10、具體地，所述冰水浴為0℃冰水浴。

11、具體地，所述冰水浴的時間是15～20分鐘。

12、具體地，所述底物緩沖液的配制方式為：將萘酚as-bi磷酸鹽加入tris緩沖液中，向所得的混合溶液中加入二甲基甲酰胺和tween-20，混合后得到底物緩沖液。

13、本發明的第二方面，提供了一種前述的堿性磷酸酶底物染色液的制備方法制備得到的堿性磷酸酶底物染色液在免疫組化染色中的應用，所述免疫組化染色包括手工操作的免疫組化染色和使用全自動免疫組化染色機進行的免疫組化染色。

14、與現有技術相比，本發明的有益效果在于：

15、本發明提供的制備方法，其底物色原溶液的配方經過不斷優化得到，保證了底物色原的穩定性，使得堿性磷酸酶催化底物染色液形成不溶于有機溶劑的紅色偶氮沉淀物能夠長期用于免疫組化染色，同時，通過調整優化底物色原溶液和底物緩沖液的使用比例，使得得到的染色液可直接應用于全自動免疫組化染色機，進一步提升了堿性磷酸酶底物染色液的適用范圍，解決了人工操作可能會引起的手動誤差，同時節省了人力成本和時間成本，提升了免疫組化染色的效率和準確性。

技術特征：

1.一種堿性磷酸酶底物染色液的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：

2.根據權利要求1所述的堿性磷酸酶底物染色液的制備方法，其特征在于，所述底物色原溶液中，新品紅的用量為0.091～0.91g，鹽酸溶液的濃度為1.9％，鹽酸溶液的用量為20～50ml，亞硝酸鈉的用量為0.052～0.52g，甘油用量為10ml，dmso用量為2ml，化學穩定劑用量為40μl，proclin300用量為10μl。

3.根據權利要求1所述的堿性磷酸酶底物染色液的制備方法，其特征在于，所述萘酚as-bi磷酸鹽的用量為0.3g，所述tris緩沖液的濃度為21％，所述tris緩沖液的用量為50ml，所述tris緩沖液的ph為8.4，所述二甲基甲酰胺的用量為0.5ml，所述tween-20的用量為0.15ml。

4.根據權利要求1所述的堿性磷酸酶底物染色液的制備方法，其特征在于，所述底物色原溶液和底物緩沖液的混合比例為1:1～1：20。

5.根據權利要求1所述的堿性磷酸酶底物染色液的制備方法，其特征在于，所述底物色原溶液和底物緩沖液的混合比例為1:20。

6.根據權利要求1所述的堿性磷酸酶底物染色液的制備方法，其特征在于，所述底物色原溶液的配制方式為：將所述新品紅溶解于鹽酸溶液中，將混合溶液至于冰水浴中，之后在混合溶液中加入亞硝酸鈉，得到懸濁液，將懸濁液固液分離去除固體之后得到所述底物色原溶液。

7.根據權利要求6所述的堿性磷酸酶底物染色液的制備方法，其特征在于，所述冰水浴為0℃冰水浴。

8.根據權利要求6所述的堿性磷酸酶底物染色液的制備方法，其特征在于，所述冰水浴的時間是15～20分鐘。

9.根據權利要求1所述的堿性磷酸酶底物染色液的制備方法，所述底物緩沖液的配制方式為：將萘酚as-bi磷酸鹽加入tris緩沖液中，向所得的混合溶液中加入二甲基甲酰胺和tween-20，混合后得到底物緩沖液。

10.根據權利要求1-9中任一項所述的堿性磷酸酶底物染色液的制備方法制備得到的堿性磷酸酶底物染色液在免疫組化染色中的應用，其特征在于，所述免疫組化染色包括手工操作的免疫組化染色和使用全自動免疫組化染色機進行的免疫組化染色。

技術總結
本發明公開了一種堿性磷酸酶底物染色液的制備方法及其應用，所述制備方法包括步驟：S1、制備底物色原溶液和底物緩沖液；S2、將底物色原溶液和底物緩沖液混合，得到堿性磷酸酶底物染色液；其中，底物色原溶液包括新品紅、鹽酸溶液、亞硝酸鈉、甘油、DMSO、化學穩定劑和Proclin300；底物緩沖液包括萘酚AS?BI磷酸鹽、Tris緩沖液、二甲基甲酰胺和Tween?20。本發明提供的底物色原溶液保證了底物色原的穩定性，使得堿性磷酸酶催化底物染色液形成不溶于有機溶劑的紅色偶氮沉淀物，能夠長期用于免疫組化染色，且制得的染色液可直接應用于全自動免疫組化染色機，提升了堿性磷酸酶底物染色液的適用范圍，同時節省了人力成本和時間成本，提升了免疫組化染色的效率和準確性。

技術研發人員：施麗君,楊超超,韓穎鑫
受保護的技術使用者：蘇州藥明澤康生物科技有限公司
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24