一種磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開屬于免疫技術(shù)檢測領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒的制備方 法，W及采用此方法制備的試劑盒；本公開還設(shè)及一種檢測人血清中肌紅蛋白的定量試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌紅蛋白是一種存在于屯、肌和骨骼肌細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)，分子量為17. 8kD。
[0003] 在肌細(xì)胞受損后，肌紅蛋白快速釋放到循環(huán)系統(tǒng)中。測定血清中的肌紅蛋白是診 斷急性屯、肌梗塞（AMI)、再梗塞W及溶栓治療后成功再灌入診斷的重要指標(biāo)之一。濃度在癥 狀出現(xiàn)后約兩個小時肌紅蛋白濃度升高，因此可作為診斷屯、肌梗塞的早期指標(biāo)。根據(jù)不同 的再灌入治療措施，在梗塞形成開始之后，血液循環(huán)中的肌紅蛋白濃度在梗塞發(fā)生后4到 12小時可達(dá)到高峰，約24小時之后下降至正常水平。骨骼肌受損后W及腎功能嚴(yán)重障礙也 可導(dǎo)致肌紅蛋白濃度升高。
[0004] 在沒有骨骼肌損傷的情況下，肌紅蛋白用作屯、肌梗塞病癥的早期標(biāo)志。肌紅蛋白 的陰性預(yù)測結(jié)果是99%，用來排除非屯、肌梗塞患者。當(dāng)結(jié)合其他屯、臟標(biāo)志物（如CK-MB或 肌巧蛋白I) 一起應(yīng)用時，肌紅蛋白具有卓越的診斷價值，可用于評估潛在的急性屯、肌梗塞 患者。
[0005] 目前臨床上采用的肌紅蛋白檢測手段包括：ELISA法和免疫比濁法。然而，運些方 法的缺點在于靈敏度不夠高，檢測用時長，線性范圍不夠?qū)挘瑯颖静坏貌贿M(jìn)行稀釋處理。
[0006] 鑒于上述不足之處，人們開發(fā)了一種新的檢測方法，其結(jié)合了磁分離技術(shù)和化學(xué) 發(fā)光技術(shù)的雙重優(yōu)勢，例如中國專利CN102435752B中公開了 一種肌紅蛋白定量測定試劑 盒及其檢測方法，該試劑盒包含標(biāo)記有抗肌紅蛋白單克隆抗體的磁性微球、和堿性憐酸酶 標(biāo)記的抗肌紅蛋白單克隆抗體。改方法將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，從而提供了 一種接近均相的反應(yīng)體系，具有較高的檢測靈敏度和特異性。然而，現(xiàn)有技術(shù)中抗體包被磁 微粒的方法是先將磁微粒和抗體混合均勻后加入交聯(lián)劑（如邸C)。即便在CN102435752B 中，也是將抗體和交聯(lián)劑辛二酸二班巧酷亞胺醋進(jìn)行事先混合。在運些包被方法中，交聯(lián)劑 會損害抗體的活性。并且，試劑線性范圍不夠?qū)拸V，高值樣本需要事先進(jìn)行稀釋處理。鑒于 此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員非常希望獲得一種新型的磁微粒包被方法W便改善上述技術(shù)中的缺 陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 根據(jù)本申請的一方面，提供一種磁微粒的包被方法，其包括步驟：
[0008] a)將磁微粒和結(jié)合緩沖液進(jìn)行接觸，獲得第一混合物；
[0009] b)將碳二亞胺和第一混合物在20°C至30°C接觸lOmin至比，獲得第二混合物；W 及
[0010] C)將單克隆抗體和第二混合物在20°C至30°C避光反應(yīng)化至地，得到包被有單克 隆抗體的磁微粒。 陽0川根據(jù)一些實施方式，所述結(jié)合緩沖液的抑為4. 5至6.0 ;優(yōu)選地，抑選自：4. 5、 4. 8、5. 0、5. 2、5. 5、W及上述任意兩個數(shù)值之間的范圍。在更優(yōu)選的實施方式中，所述結(jié)合 緩沖液的抑為5.0。在具體的實施方式中，所述結(jié)合緩沖液是MES緩沖液。在更優(yōu)選的實 施方式中，結(jié)合緩沖液是抑為5. 0的0. 1MMES緩沖液。
[0012] 根據(jù)一些實施方式，所述磁微粒的粒徑為1μπι至3μπι。在優(yōu)選的實施方式中，所 述磁微粒的粒徑為0. 8至1. 2μm。技術(shù)人員理解，本公開方法中所用的磁微粒實際上不可 能是單個的磁微粒，而是眾多磁微粒。因此，磁微粒的粒徑在統(tǒng)計學(xué)意義上是個粒徑范圍的 分布。例如，當(dāng)提及粒徑為1μm的磁微粒時，并不意味著每一個單個的磁微粒的粒徑剛好 是1μm，而是允許在1μm附近（例如± 10%的誤差）的范圍之內(nèi)。鑒于此，在本申請的上 下文中，W粒徑的范圍來表示磁微粒的粒徑。
[0013] 根據(jù)一些實施方式，在步驟b)中將碳二亞胺和第一混合物在20°C至30°C接觸 20min至40min，獲得第二混合物。在優(yōu)選的實施方式中，步驟b)中將碳二亞胺和第一混合 物在22°C至28°C混勻25min至35min。在具體的實施方式中，碳二亞胺的濃度為8mg/ml至 15m邑/ml,1?? 10m邑/ml。
[0014] 根據(jù)一些實施方式，步驟c)中將單克隆抗體和第二混合物在22°C至28°C避光反 應(yīng)3h。在具體的實施方式中，單克隆抗體是肌紅蛋白單克隆抗體。然而技術(shù)人員理解，盡管 本申請的具體實例中采用了特定的單克隆抗體，但是任何其它類型的抗體同樣適用于本申 請。因為，本申請的方法設(shè)及的是一種改善的磁微粒包被步驟和封閉步驟，只要抗體可W結(jié) 合至磁微粒即可，不受限于抗體的特定結(jié)構(gòu)（如CDR的序列）。
[0015] 根據(jù)一些實施方式，本申請的磁微粒的包被方法還包括步驟d):向所述包被有單 克隆抗體的磁微粒中加入Biolipi化re,在22至28°C進(jìn)行2至化封閉反應(yīng)；之后在37°C 反應(yīng)15min至60min。任選地，本申請的磁微粒的包被方法還包括步驟e):終止步驟d)中 的封閉反應(yīng)。任選地，本申請的磁微粒的包被方法還包括步驟f):離屯、并收集包被有單克 隆抗體的磁微粒。Biolipidum狡;是一種具有憐脂極性基團(tuán)2-甲基丙締酷憐酸膽堿（MPC) 的聚合物化Ishihara等人J.Biomed.Mater.Res.，39, 323,1"8 年）。BioHpidure巧包 括但不限于Biolipidure-103、Biolipidure-203、Biolipidure-206、Biolipidure-405、 Biolipidure-502、Biolipidure-702、Biolipidure-802、Biolipidure-1002、 Biolipidure-1201 和Biolipidure-1301。在本申請的上下文中，任何和Biolipidure巧 等同的產(chǎn)品同樣可W用于本申請的方法。在具體的實施方式中，所述BioHpidure?；^Biolipidure-502或Biolipidure-1002 ;優(yōu)選Biolipidure-1002。
[0016] 根據(jù)一些優(yōu)選的實施方式，在步驟d)中，向所述包被有單克隆抗體的磁微粒中 加入Biolipidure，在22至28°C進(jìn)行2至化封閉反應(yīng)，之后在37°C反應(yīng)15min、30min或 60min，最優(yōu)選反應(yīng)30min。
[0017] 根據(jù)一些具體的實施方式，通過加入澤滅緩沖液在22至28°C避光反應(yīng)0.5至 1.化來終止封閉反應(yīng)。本領(lǐng)域公知的澤滅緩沖液都可W使用。例如，在具體的實施方式中， 澤滅緩沖液包含lOmMPBS、Ig/lOOmlBSA、40mM甘氨酸，pH為7. 4。
[0018] 根據(jù)一個具體的實施方式，磁微粒的包被方法包括步驟：
[0019] a)將2μm磁微粒和抑5. 0的0.IMMES緩沖液進(jìn)行接觸，獲得第一混合物；
[0020] b)將lOmg/ml碳二亞胺和第一混合物在20°C至30°C接觸30min，獲得第二混合 物；
[0021] C)將單克隆抗體和第二混合物在20°C至30°C避光反應(yīng)化，得到包被有單克隆抗 體的磁微粒；
[0022] d)向所述包被有單克隆抗體的磁微粒中加入Biolipi化re-1002,在22至28°C進(jìn) 行化封閉反應(yīng)，之后在37°C反應(yīng)30min;
[0023] e)加入澤滅緩沖液在20°C至30°C避光反應(yīng)比W便終止所述封閉反應(yīng)，所述澤滅 緩沖液包含lOmMPBS、Ig/lOOmlBSA、40mM甘氨酸，pH為 7. 4 ;
[0024]f)離屯、并收集包被有單克隆抗體的磁微粒。
[00巧]根據(jù)本申請的另一方面，提供了一種包被有單克隆抗體的磁微粒，其是通過本申 請的方法制備得到的。
[00%] 根據(jù)本申請的另一方面，還提供了通過本申請的方法制備得到的包被有單克隆抗 體的磁微粒在制備檢測試劑中的用途。
[0027] 根據(jù)本申請的另一方面，還提供了一種檢測試劑，其包含本申請的包被有單克隆 抗體的磁微粒。
[0028] 根據(jù)本申請的另一方面，還提供了一種肌紅蛋白檢測試劑盒，其包含或者由如下 組成：磁分離試劑R1，標(biāo)記試劑R2,和底物溶液。在【具體實施方式】中，磁分離試劑R1包含 包被有肌紅蛋白單克隆抗體的磁微粒。在R1中，包被有肌紅蛋白單克隆抗體的磁微粒允 許置于適當(dāng)?shù)木彌_液中。R1的緩沖液優(yōu)選包含：〇. 6g/100ml化C1、0. 2g/100ml吐溫20、 0. 2g/100mlNaN3、50mMTris-HCl緩沖液，pH7. 6