本發明涉及細胞檢測，尤其涉及一種循環腫瘤細胞的檢測方法。

背景技術：

1、循環腫瘤細胞(ctc)檢測技術的背景技術涉及多個領域，包括免疫選擇和物理特性的ctc分離方法：免疫選擇方法依賴于腫瘤細胞表面特定的生物標記，如epcam抗體，具有較高的選擇特異性，但可能影響腫瘤細胞活性；物理特性分離方法則基于腫瘤細胞與正常血細胞之間的物理差異，如大小和密度，實現高通量分離，但容易產生假陽性結果；為了克服單一方法的局限性，研究者嘗試結合生物和物理特性進行ctc分離，如側向過濾器陣列微流體技術(lfam)結合不同尺寸的孔篩原理和epcam抗體修飾的過濾器，以提高ctc捕獲率。

2、中國專利公告號cn110456034b，公開了一種循環腫瘤細胞的檢測方法：采集人體液樣本，用甲醛固定后增加細胞膜通透性，將細胞加入若干組pcr多聯管中，每管加有攜帶id1的逆轉錄引物，逆轉錄成cdna分子后，收集細胞混合加入另一組pcr多聯管中，每管中加有攜帶id2且3’端能夠特異性識別cdna分子的3’端的延伸引物，通過序列互補后進行延伸反應，收集并裂解細胞，通過pcr引物預擴增延伸產物。高通量測序，分析id1:id2的組合方式。該發明同時對不同的標志物進行逆轉錄與pcr擴增，可準確識別循環腫瘤細胞、發生emt的循環腫瘤細胞，并能聯合其他技術使用，最大程度檢測體液樣本中極少的循環腫瘤細胞以及其他非體液稀有細胞。由此可見，該發明存在以下問題：

3、該發明未根據tnm報告和影像學圖像綜合優化包被免疫磁珠的包被厚度進而提高循環腫瘤細胞的檢測精度和效率的問題。

技術實現思路

1、為此，本發明提供一種循環腫瘤細胞的檢測方法，用以克服現有技術中未根據綜合tnm報告和影像學圖像綜合優化包被免疫磁珠的包被厚度進而提高循環腫瘤細胞的檢測精度和效率的問題。

2、為實現上述目的，本發明提供一種循環腫瘤細胞的檢測方法，包括：

3、步驟s1，對患者進行影像學檢查和區域淋巴結活檢以獲取影像學圖像和患者的tnm分期報告；

4、步驟s2，對所述影像學圖像進行清晰處理以獲得清晰影像，并根據所述清晰影像確定原發腫瘤的邊緣表征狀態和微血管密度；

5、步驟s3，根據所述tnm分期報告、所述邊緣表征狀態和所述微血管密度確定患者的腫瘤轉移等級；

6、步驟s4，采集5ml～10ml的患者外周靜脈血樣本并對其進行預處理；

7、步驟s5，根據所述腫瘤轉移等級和對應腫瘤細胞新型特異性表面標志物抗體的抗體親和度確定包被免疫磁珠的包被厚度，并根據所述包被厚度制備包被免疫磁珠以制備磁珠懸液；

8、步驟s6，在所述血液樣本中添加預設量的磁珠懸液后轉移至動態孵育裝置進行孵育以形成循環腫瘤細胞的富集前混合液；

9、步驟s7，根據所述富集前混合液的顏色和渾濁度判斷是否結束孵育，并根據孵育結束的判斷結果將所述循環腫瘤細胞的富集前混合液轉移至分離器并施加磁場以對進行富集形成循環腫瘤細胞的富集后混合液；

10、步驟s8，將所述富集后混合液的上層清液分離以獲得磁珠-循環腫瘤細胞復合物；

11、步驟s9，對所述磁珠-循環腫瘤細胞復合物進行自動化洗滌和檢測以對循環腫瘤細胞進行分析。

12、進一步地，所述步驟s2包括，

13、步驟s21，對所述影像學圖像進行清晰處理以獲得清晰影像，所述清晰處理包括，

14、步驟s211，采用空間域濾波或頻率域濾波對所述影像學圖像進行去噪處理獲得去噪影像；

15、步驟s212；采用灰度拉伸或直方圖均衡化調整所述去噪影像的對比度以獲得增強影像；

16、步驟s213，采用梯度算子或拉普拉斯算子對所述增強影像進行邊緣增強和銳化后得到清晰影像；

17、步驟s22，采用深度學習模型根據所述清晰影像確定原發腫瘤的邊緣表征狀態和微血管密度。

18、進一步地，在所述步驟s3中確定腫瘤轉移等級的方法包括，

19、步驟s31，獲取tnm分期報告、所述邊緣表征狀態和所述微血管密度，并確定t值、n值和m值；

20、步驟s32，根據所述m值確定腫瘤轉移等級，包括，

21、若m值為m1，則判定所述腫瘤轉移等級為高級；

22、若m值為m0，則根據所述邊緣表征狀態、所述微血管密度、所述t值和所述n值判定所述腫瘤轉移等級；

23、步驟s33，根據所述邊緣表征狀態和所述微血管密度確定腫瘤轉移傾向，包括，

24、若所述邊緣表征狀態為不規則邊緣且所述微血管密度大于或等于預設密度，則判定所述腫瘤轉移傾向為顯性轉移；

25、若所述邊緣表征狀態為規則邊緣且所述微血管密度小于預設密度，則判定所述腫瘤轉移傾向為隱性轉移；

26、步驟s34，根據所述t值和所述n值確定淋巴受累傾向，包括，

27、若所述t值為t2且所述n值為n0，則判定所述淋巴受累傾向為隱性受累；

28、若所述t值為t2且所述n值不為n0，則判定所述淋巴受累傾向為顯性受累；

29、步驟s35，根據所述腫瘤轉移傾向和所述淋巴受累傾向確定腫瘤轉移等級。

30、進一步地，在所述步驟s35中，根據所述腫瘤轉移傾向和所述淋巴受累傾向確定腫瘤轉移等級，包括，

31、若所述腫瘤轉移傾向為顯性轉移且所述淋巴受累傾向為顯性受累，則判定所述腫瘤轉移等級為高級；

32、若所述腫瘤轉移傾向為顯性轉移或所述淋巴受累傾向為顯性受累，則判定所述腫瘤轉移等級為中級；

33、若所述腫瘤轉移傾向為隱性轉移且所述淋巴受累傾向為隱性受累，則判定所述腫瘤轉移等級為低級。

34、進一步地，步驟s4包括，

35、步驟s41，利用含有抗凝劑的真空采血管對患者外周靜脈血樣本進行采集；

36、步驟s42，根據血液樣本的檢測時間與抽血時間之間的時間差確定是否對其進行冷藏保存，其中，

37、若所述時間差大于預設時長，則將所述血液樣本置于4℃的冰箱中冷藏保存；

38、若所述時間差小于或等于預設時長，則不將血液樣本冷藏保存；

39、步驟s43，將所述血液樣本在室溫下搖勻使抗凝劑在血液樣本中均勻分布，

40、其中，

41、若所述血液樣本冷藏保存，則將其恢復至室溫后在室溫下搖勻；

42、若所述血液樣本未冷藏保存，則將其在室溫下直接搖勻備用。

43、進一步地，在所述步驟s5中，根據所述腫瘤轉移等級和所述抗體親和度確定包被免疫磁珠的包被厚度，包括，

44、若所述腫瘤轉移等級為高級且抗體親和度大于或等于預設抗體親和度，則判定所述包被厚度為第一厚度；

45、若所述腫瘤轉移等級為高級或抗體親和度大于或等于預設抗體親和度，則判定所述包被厚度為第二厚度；

46、若所述腫瘤轉移等級不為高級且抗體親和度小于預設抗體親和度，則判定所述包被厚度為第三厚度；

47、其中，所述第一厚度≤所述第二厚度≤所述第三厚度。

48、進一步地，在所述步驟s5中，制備包被免疫磁珠時添加顏色標記；

49、其中，所述顏色標記的顏色為與紅色對比強烈的顏色。

50、進一步地，步驟s6包括，

51、步驟s61，在血液樣本中添加預設量的磁珠懸液并拍攝初始血液樣本圖像，并根據深度學習模型確定初始渾濁度；

52、步驟s62，將添加磁珠懸液的血液樣本轉移至動態孵育裝置；

53、步驟s63，以預設拍攝頻率獲取血液樣本的若干孵育圖像，并根據深度學習模型確定各所述孵育圖像的顏色實時均勻度和實時渾濁度。

54、進一步地，在所述步驟s7中，根據所述孵育圖像與所述初始血液樣本圖像判斷是否結束孵育包括，

55、若所述顏色實時均勻度大于或等于預設均勻度且所述渾濁度差值大于或等于預設差值，則判斷結束孵育；

56、若所述顏色實時均勻度小于預設均勻度和/或所述渾濁度差值小于預設差值，則判斷未結束孵育。

57、進一步地，渾濁度差值為所述實時渾濁度與初始渾濁度之差。

58、與現有技術相比，本發明的有益效果在于，本發明提供的循環腫瘤細胞的檢測方法根據患者的腫瘤轉移等級和對應腫瘤細胞新型特異性表面標志物抗體的抗體親和度確定包被免疫磁珠的包被厚度，從而制備出適合患者個體差異的磁珠懸液，提高了檢測的針對性和準確性，本方法為臨床提供了完整且可靠的循環腫瘤細胞檢測方法，有助于醫生更準確地了解患者的腫瘤轉移情況，制定個性化的治療方案/監測治療效果，也為腫瘤的早期發現、預后評估和復發監測提供了重要的參考依據。

59、進一步地，本發明步驟s2不僅提高了循環腫瘤細胞檢測的精確性，也為臨床提供了更為詳盡和可靠的腫瘤信息。

60、進一步地，本發明通過邊緣表征狀態和微血管密度綜合判定腫瘤轉移傾向，可以避免判定結果的局限性；此外，邊緣表征狀態和微血管密度是由深度學習模型確定的，減少了人的主觀影響可以更為客觀的判斷腫瘤轉移等級。

61、進一步地，本發明通過步驟s3的綜合評估方式不僅提高了評估的準確性，而且減少了人為主觀判斷的影響，使得評估結果更加客觀可靠；此外，還通過注射造影劑后的增強ct或mri檢查來評估腫瘤內部的微血管密度，進一步增強了評估的精確性和科學性。

62、進一步地，本發明通過整合多維度信息，不僅提升了腫瘤轉移等級的評估準確性，還引入了抗體親和度來確定包被免疫磁珠的包被厚度，從而進一步優化了循環腫瘤細胞的檢測效率與純度：對于高級轉移等級或高親和度抗體，采用較薄的包被層以提高捕獲效率；而對于低轉移等級或低親和度抗體，則選擇較厚的包被層以確保足夠的穩定性和捕獲純度；這種動態調整包被厚度的策略，不僅提升了檢測靈敏度，還有效減少了非特異性結合，使得循環腫瘤細胞的分離與富集更加高效、純凈。本發明提供的循環腫瘤細胞的檢測方法通過精確評估腫瘤轉移等級、科學測定抗體親和度，并據此優化免疫磁珠的包被厚度，實現了循環腫瘤細胞檢測技術的全面升級，提高了檢測的準確性和靈敏度。

63、進一步地，本發明通過實時監測孵育過程中血液樣本的顏色實時均勻度和渾濁度變化能夠準確地判斷孵育是否結束，從而確保了免疫磁珠與循環腫瘤細胞的結合效率。