本發明涉及光學成像技術領域，特別是涉及一種飛秒脈沖激光調制器及具有其的微型雙光子顯微成像裝置。

背景技術：

神經科學的最終目標之一是在自由活動的動物上了解亞細胞、細胞、環路和更高層次的神經元信息處理的基本原理。結合熒光指示劑，光學顯微鏡已經成為這一任務中的基本研究工具，因為它允許在多個時間和空間尺度上直接觀測神經元活動。單個突觸是信息傳遞，處理和存儲的基本單位，對于理解腦功能和疾病機理至關重要。突觸后結構--樹突棘是亞微米結構，深埋在腦內，并以毫秒級的速度活動。由于其固有的光學切片和深層組織穿透能力，多光子顯微鏡一直是過去二十年內體內無創光學腦成像的首選技術。使用臺式雙光子顯微鏡(英文全稱為“two-photonmicroscopy”，下文均簡稱為“tpm”)，已能夠在活體內觀察到樹突棘的形態變化，比如學習和記憶的神經元的活動。觀察在清醒狀態下活體樣本頭部復雜的樹突棘活動可以通過配備有快速圖像采集(采集頻率大于15hz)、高激發和光電探測效率的最先進的臺式多光子顯微鏡實現。然而，活體樣本的頭部一直被固定，整個實驗期間都處在物理約束和情緒壓力下，而且沒有先驗證據表明神經元對外界的響應在虛擬現實和自由探索下是等價的。更重要的是，許多社會行為，比如親子護理、交配和戰斗，都不能用頭部固定的實驗來研究。

為了應對這些挑戰，一個理想的解決方案是開發能夠長時間觀察活體樣本在自由活動過程中的樹突棘的結構和功能動態的微型化顯微鏡。denk和他的同事在2001年建立了基于光纖尖端掃描的第一個微型雙光子顯微鏡(英文全稱為“microtwo-photonmicroscopy”，下文均簡稱為“mtpm”)，然后接下來的十年里，其他許多課題組采取不同方法繼續嘗試。然而，這些mtpm沒有一個被用于后續的生物應用，主要是由于兩個主要的限制：第一，沒人能夠成像應用最廣泛的熒光探針，如gcamps，原因是缺乏適當的光纖用來傳輸920納米飛秒激光脈沖，以保證脈沖到樣品沒有失真。第二，mtpms在體內實驗中經常表現出低于它們的理論分辨率，原因可能是采樣率低，微型漸變折射率(英文全稱為“graded-indexlenses”，下文均簡稱為“grin”)透鏡的像差，微型光學器件的缺陷和運動引起的成像噪聲等等。目前，樹突棘分辨率的神經元結構的活動不能被mtpms很好的解決，盡管其理論橫向分辨率為大約1μm。

另一方面，微型單光子寬場顯微鏡，例如由ghosh及其同事開發的顯微鏡，已經實現了快速采集和大視場(英文全稱為“fieldofvision”，下文均簡稱為“fov”)以及解決了運動引起的噪聲問題(在神經元分辨率)。然而，當前的無創微型寬場顯微鏡僅能獲得細胞分辨率，并且圖像對比度受到累積的焦外背景信號的影響。到目前為止，可以提供很好的成像能力和實驗方案，而且足夠強大到可以滿足神經科學家的日常實驗的新型的mtpm仍有待完成。

因此，希望有一種技術方案來克服或至少減輕現有技術的上述缺陷中的至少一個。

技術實現要素：

發明的目的在于提供一種飛秒脈沖激光調制器及具有其的微型雙光子顯微成像裝置來克服或至少減輕現有技術的上述缺陷中的至少一個。

為實現上述目的，本發明提供一種飛秒脈沖激光調制器，所述飛秒脈沖激光調制器具有負色散光路和正色散光路，其中：所述負色散光路包括激光輸入光纖，所述激光輸入光纖用于將脈沖展寬預啁啾補償好的激光傳輸給所述掃描成像部；所述正色散光路，其位于所述飛秒脈沖激光器和所述負色散光路之間，用于補償由所述激光輸入光纖在傳輸激光過程中引起的負色散。

本發明還提供一種微型雙光子顯微成像裝置，所述微型雙光子顯微成像裝置包括：飛秒脈沖激光器，其用于產生波長為920納米的激光；飛秒脈沖激光調制器，其為權利要求如上所述的飛秒脈沖激光調制器，用于接收所述飛秒脈沖激光器輸出的激光，并預啁啾補償激光的脈沖展寬至預設值，并輸出；以及微型探頭，所述微型探頭包括：掃描成像部分，用于接收所述飛秒脈沖激光調制器輸出的激光，該激光對活體樣本內部的組織進行掃描，以激發所述活體樣本產生熒光信號；和熒光輸出光纖，其用于接收所述掃描成像部分輸出的所述熒光信號，并進行輸出。

本發明提供的微型雙光子顯微成像裝置(下文簡稱為“firm-tpm”)測試和應用的速度快、分辨率高，能夠用于解決自由活動動物中單個樹突棘的成像問題的整套實驗方法。在涉及到不規則的、頻繁的身體和頭部運動的行為范例中(例如，尾懸掛，跳臺，和社交行為)，本發明的微型顯微鏡都可以對gcamp6f標記的的皮層神經元的體細胞，樹突和樹突棘進行觀測。綜合起來，firm-tpm代表了下一代微型顯微鏡，它滿足在自由活動動物中進行高分辨率腦成像的需求。

附圖說明

圖1是本發明所提供的firm-tpm一優選實施方式的結構示意圖。

圖2是圖1中的微型探頭安裝在小老鼠上的狀態示意圖。

圖3是圖1中的微型探頭的光路原理示意圖。

圖4是本發明所提供的飛秒脈沖激光調制器一優選實施方式的結構示意圖。

圖5a是本發明利用圖1的微型雙光子顯微成像裝置的活體樣本行為成像系統的結構示意圖。

圖5b是圖5a中的數據收集組件和線路安裝組件的分解示意圖。

圖6是臺式tpm、微型寬場熒光顯微鏡和firm-tpm各項性能的集成平臺在臺式雙光子模式下的光路示意圖，該圖示意出了臺式tpm的結構示意圖。

圖7是圖6的集成平臺在寬場成像模式下的光路示意圖。

圖8是圖6的集成平臺在firm-tpm成像模式下的光路示意圖，該圖示意出了在圖6的臺式tpm中的物鏡與物面(活體樣本或活體樣本)之間的光路上設置有圖1的firm-tpm。

圖9a-9f是比較gcamp-6f在800nm、920nm和1030nm激發下的雙光子激發效率。

圖10a是定制設計的hc-920光纖的傳輸損耗和色散參數，其中，上方左側的插圖顯示了hc-920的截面照片，上方右側的插圖顯示了由hc-920射出并由具有3mm的焦距的雙合透鏡準直之后的920nm激光的圖像。

圖10b是在不同激光功率下1米hc-920出口處920-nm飛秒激光脈沖寬度的自相關分布。

圖10c中，左側圖：mems掃描器的x(淺灰色)和y(黑色)軸的頻率響應。右側板：機械傾斜角作為mems掃描器的x(黑色)和y(淺灰色)軸的驅動電壓的函數。

圖11a-11d是圖4的飛秒脈沖激光調制器中色散補償說明。

圖12a-12e是比較在頭部固定和自由移動條件下在黑暗環境下活體樣本v-1皮質中的樹突活性。

圖13a-13c是利用圖5中的活體樣本行為成像系統在不同的行為范例中活體樣本的成像視覺皮層活動。

圖14a-14d是firm-tpm與臺式tpm、微型寬視場顯微鏡的性能比較。

具體實施方式

在附圖中，使用相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面結合附圖對本發明的實施例進行詳細說明。

在本發明的描述中，術語“中心”、“縱向”、“橫向”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底”“內”、“外”等指示的方位或位置關系為基于附圖所示的方位或位置關系，僅是為了便于描述本發明和簡化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構造和操作，因此不能理解為對本發明保護范圍的限制。

如圖1所示，本實施例所提供的一種微型雙光子顯微成像裝置(英文全稱為“fasthighresolutionminiaturetwophotonmicroscope”；下文均簡稱為“firm-tpm”)包括飛秒脈沖激光器、飛秒脈沖激光調制器1和微型探頭2，其中：

所述飛秒脈沖激光器用于產生波長為920納米的激光。所述飛秒脈沖激光器在圖中并未示意出來，其可以使用相干公司變色龍固體激光器作為光源，中心波長為920nm，輸出功率100±1mw。相比于現有的波長為1030nm和800nm的激光，波長為920納米的激光能夠有效地激發常用的生物指示劑(例如thy1-gfp和gcamp-6f，其中的gcamp是最普遍使用的鈣離子指示劑)產生熒光。下面是比較gcamp-6f分別在800nm、920nm和1030nm激光激發下的雙光子激發效率，利用可調諧的鈦寶石飛秒激光器(coherent，usa，vision-s，680-1080nm，85-110fs)中選擇不同波長進行激發。

如圖9a-9f所示，圖9a是在不同激發波長下在v-1皮質中表達gcamp-6f的aav轉染活體樣本中成像相同組的神經元胞體cell1、cell2和cell3，圖中從左至右依序分別是使用800nm、920nm和1030nm激光獲得的熒光圖像。圖9b是10個膠質細胞的ca²⁺信號的神經元胞體的頻率。圖9c中的c是10個膠質細胞的ca²⁺信號的神經元胞體的幅度，圖9c中的d是10個膠質細胞的ca²⁺信號的神經元胞體的平均時程。圖9d如在圖9a中，在不同的焦平面成像神經元樹突dendrite1、dendrite2和dendrite3，圖中從左至右依序分別是使用800nm、920nm和1030nm激光獲得的熒光圖像。圖9e是來自圖9d中所示的十個樹突ca²⁺信號的頻率。圖9f中的g是來自圖9d中所示的十個樹突ca²⁺信號的幅度，圖9f中的h是來自圖9d中所示的十個樹突ca²⁺信號的平均時程。從這些實驗數據可以看出：以800nm為中心的飛秒激光脈沖完全不能激發來自神經元胞體或樹突的gcamp6信號，1030nm激發與920nm激發相比，僅能記錄到樹突鈣離子活性的1/10，同時所記錄的熒光信號的振幅顯著降低。實驗數據進一步證明使用波長為920nm的激光可以更加有效地激發gcamp-6f產生熒光。

再次參閱圖1，飛秒脈沖激光調制器1用于接收所述飛秒脈沖激光器輸出的激光，并預啁啾補償激光的脈沖展寬至其預設值，并輸出。85fs、920nm為中心的激光脈沖，在經由飛秒脈沖激光調制器1預啁啾補償之后，調制成大約為100fs的激光脈沖，傳輸功率可以從5mw到200mw(該數據是通過實驗在激光輸入光纖11的出口處測量獲得)。

微型探頭2包括掃描成像部分和熒光輸出光纖21，其中：所述掃描成像部分用于接收飛秒脈沖激光調制器1輸出的激光，該激光對活體樣本內部的組織進行掃描，以激發所述活體樣本產生熒光信號。熒光輸出光纖21用于接收所述掃描成像部分輸出的所述熒光信號，并進行輸出。

如圖1和圖2所示，熒光輸出光纖21選擇的是一種新型的柔性光纖束(sfb)，本實施方式中的熒光輸出光纖21由700-900根玻璃光纖熔接而成，同時，保持各玻璃光纖松散并在兩者之間分開，這樣便于由自由活動的活體樣本攜帶并減少運動偽影的輕質顯微鏡探頭，進而最小化動物運動引起的扭矩和張力，而不降低光子收集效率。所有的玻璃光纖熔接的兩個端部呈1.5mm直徑的圓柱體，以方便安裝在微型探頭2上。下表1是本實施例中的熒光輸出光纖21的性能參數，其與多模光纖相比具有更高的收集效率，并且比之前使用的塑料光纖和傳統的融合型光纖束更靈活，能夠進行多波長發射檢測。熒光輸出光纖21將來自微型探頭2中的物鏡的熒光信號傳遞到遠端的gaasppmt(10770p-40，hamamatsu，日本)中，其總收集效率在532nm處為大約80％。

表1

如圖2所示，微型探頭2中集成在固定支架28上。通過固定支架28，微型探頭2以可拆卸的方式(螺釘連接)安裝在活體樣本(如圖2中示出的小老鼠等活體樣本)的頭上。微型探頭2和固定支架28的總重量大約位2.15g，體積不超過1cm³，系統足夠小而緊湊和足夠輕以便活體樣本攜帶。固定支架28采用鋁材料制成，比如鋁框架。固定支架28的形狀可以設計成一個頭盔形狀，這樣易于安裝和拆卸，主要是可以穩固地將微型探頭2安裝在自由活動的活體樣本的頭部，因此有利于在同一個動物中進行數小時成像，并保持微型雙光子顯微成像裝置的視場(下文簡稱為“fov”)在存在強烈的身體和頭部運動的情況下不產生漂移。除此之外，利用本發明進行成像之前，會預先訓練活體樣本適應安裝在其頭骨上的微型探頭2，并滴加1.5％低熔點瓊脂糖使其充滿在微型探頭2的物鏡和活體樣本的腦組織之間，這些操作都顯著降低了微型探頭2與大腦之間的相對運動，這些措施改善了實驗短期和長期的穩定性，允許在動物進行包含大量身體和頭部自由活動的行為檢測中進行高分辨率成像。

在一個實施例中，如圖4所示，飛秒脈沖激光調制器1具有負色散光路和正色散光路，其中：所述負色散光路包括激光輸入光纖11，激光輸入光纖11用于將脈沖展寬預啁啾補償好的激光傳輸給所述掃描成像部分。所述正色散光路位于所述飛秒脈沖激光器和所述負色散光路之間，用于補償由所述激光輸入光纖11在傳輸激光過程中引起的負色散。

由于材料色散和非線性效應，單模光纖會將飛秒激光脈沖展寬。而本實施例中使用的激光輸入光纖11為空心光子晶體光纖(下文簡稱為“hc-pcf”)，即圖中或文中出現的hc-920，其中大多數激光傳播是通過hc-920中間的充氣芯，這有效地最小化了由于非線性效應產生的脈沖展寬。本實施例的激光輸入光纖11用于傳輸數百毫瓦的920納米飛秒激光脈沖，其非線性脈沖展寬可忽略不計(圖10a和表2)。

表2

本實施例的激光輸入光纖11為920納米飛秒激光脈沖提供了無畸變傳輸，這種改進讓有效激發常用的生物指示劑成為可能，例如thy1-gfp和gcamp-6f。

在一個實施例中，所述正色散光路包括色散補償元件12和聲光調制器13，其中：聲光調制器13用于接收經由色散補償元件12補償后的激光，并調節激光強度，然后輸出給所述掃描成像部分。聲光調制器13可以采用現有產品實現。

色散補償元件12臨近所述飛秒脈沖激光器設置，用于補償由激光輸入光纖11在傳輸激光過程中引起的負色散。

激光輸入光纖11中的負色散相對較低，色散補償元件12只要使用具有特定長度的正色散的商業玻璃材料通過預啁啾方法就可以精確地補償。在預啁啾補償之后，85fs、920nm為中心的激光脈沖經過1m長的激光輸入光纖11傳輸后變成大約為100fs的脈沖，傳輸功率可以從5mw到200mw(該數據是通過實驗在激光輸入光纖11的出口處測量獲得)(圖10b)。

優選地，色散補償元件12采用的是h-zf62玻璃管，其在920nm波長的激光中具有458ps/nm/km的正色散。其中：圖11a是使用h-zf62玻璃管補償hc-920色散示意圖；圖11b是玻璃h-zf62的色散參數；圖11c是從沒有色散補償的1米的hc-920輸出的920nm飛秒激光的脈沖寬度；圖11d是在具有和沒有色散補償的1米的hc-920之前和之后的920nm飛秒激光器的脈沖寬度。

下面是對飛秒脈沖激光調制器1實現對85fs、920nm為中心的激光脈沖預啁啾補償之后，變成大約為100fs的激光脈沖，傳輸功率可以從5mw到200mw的詳細說明。

在超快激光脈沖的傳輸期間，兩個因素有導致脈沖展寬：材料的色散以及高激光峰值功率的非線性效應。在激光輸入光纖11中，大多數激光傳播通過空氣芯，因此非線性效應最小。在微型探頭2的光路中，諸如透鏡和反射鏡的光學部件的中心處的光密度相對較低，因為光束尺寸較大(直徑為不超過2mm)，因此幾乎不引起非線性。由于顯微鏡的前部件和樣本中的微型部件的長度相對較短，因此也可忽略。因此，主要的擴展效應起源于由臺式光學器件和激光輸入光纖引起的材料色散。通過簡化，在本實施方式的系統中僅考慮二階色散。因此，整個系統的脈沖展寬為：

bsystem＝|∑n{ln∫λ,δλdn(λ)dλ}|(1.1)

其中：n表示系統中的光學器件的數量；dn(λ)由第n個分量(光學器件)引起的色散參數；ln表示第n分量(光學器件)的光路長度；λ和δλ是激光的中心波長和光譜寬度；||表示來自透鏡的正色散(負d(λ))和來自激光輸入光纖異常色散(正d(λ))總和的絕對值。因此，當δλ<<λ，在本發明的系統中(λ＝920nm，δλ不超過15nm)，方程簡化為：

bsystem＝|∑n{ln·dn(λ)·δλ}|(1.2)

最終脈沖寬度表示為：

poutput＝pinput+|bsystem|(1.3)

其中pinput和poutput表示激光器的輸入和輸出脈沖寬度。

在本實施例提供的系統中使用的hc-920的長度為1m(lhc-920)，由制造商測量并在圖10a中示出。因此，hc-920的擴展是：

lhc-920·dhc-920(920nm)·δλ～1(m)·75(ps/nm/km)·15(nm)＝1.125(ps)

容易確定諸如偏振分束器、透鏡和聲光調制器的長度，并且通過它們使用的鏡片折射率信息來計算，其表示為：

和

其中，gvd表示介質中群速度色散，c是光速，n是介質的折射率。

加在一起，這些分量引起約-200fs的展寬，因此從85fs變換限制脈沖的hc-920輸出的計算脈沖寬度約為：

(0.085+1.125-0.2)(ps)＝1.01(ps)

其與實驗測量的脈沖寬度(不超過1ps)(圖11c)匹配，并且對于有效的雙光子激發太弱。通過將h-zf62玻璃管(本實施例中的色散補償元件12均采用h-zf62玻璃管)插入具有正色散的光路中，本實施例預補償了由hc-920引起的負色散。本實施例選擇h-zf62玻璃管，因為它具有大的正色散(在波長為920nm中的色散大約為58ps/nm/km)，由scott公司提供的折射率信息和等式(1.4)計算，如圖11b所示)。所需的h-zf62玻璃管的長度計算如下：

(1.125-0.2)(ps)/458(ps/nm/km)/15(nm)＝13.5(cm)

考慮到由顯微鏡前端和樣品引起的小的正色散，本實施例使用一個12厘米長、12.7毫米直徑的h-zf62玻璃管，小于計算值。在h-zf62玻璃管(圖11b和圖6)的這種“預線性調頻”之后，來自hc-920的激光脈沖寬度在測試照明功率的整個范圍內被壓縮到大約為100fs(圖11d和圖10b)。本實施例的firm-tpm通過使用自行設計的hc-pcf來傳輸具有可忽略的非線性脈沖展寬的920納米飛秒激光脈沖(名為hc-920)，能夠實驗對常用的生物指示劑進行成像，并取得了和臺式tpm相當的性能。

在一個實施例中，所述正色散光路還包括激光方位調整組件，所述激光方位調整組件設置在色散補償元件12與聲光調制器13之間，所述激光方位調整組件包括第一半波片14、第一反射鏡15和第二反射鏡16，其中：

第一半波片14用于接收經由色散補償元件12補償后的激光，并調整激光偏振方向，以使得聲光調制器13的調制效率最高。第一反射鏡15用于接收經由第一半波片14的激光，并反射激光，以調整激光射入聲光調制器13的位置。第二反射鏡16用于接收經由第一反射鏡15的激光，并反射激光，以調整激光射入聲光調制器13的角度，并傳輸給聲光調制器13。

在一個實施例中，所述正色散光路還包括分光組件，所述分光組件臨近激光輸入光纖11設置，用于接收經由聲光調制器13調節好強度的激光以及將該激光分成至少兩束，并傳輸給激光輸入光纖11。

在一個實施例中，激光輸入光纖11的數量至少為兩根，包括第一激光輸入光纖和第二激光輸入光纖。

所述分光組件包括偏振分束器17、第二半波片18、第三反射鏡19、第一準直透鏡110、第三半波片111、第四反射鏡112、第二準直透鏡113和第四半波片114，其中：

偏振分束器17用于接收經由聲光調制器13調節好強度的激光以及將該激光分成至少兩束，分別傳輸給所述第一激光輸入光纖和第二激光輸入光纖。第二半波片18布置在偏振分束器17和聲光調制器13之間，用于改變偏振分束器17的分光比。第三反射鏡19布置在偏振分束器17和第二半波片18之間，用于反射激光，以調整激光的位置并投射到所述偏振分束器17的入射面上。第一準直透鏡110布置在偏振分束器17的第一出射面與第一激光輸入光纖11之間，用于接收偏振分束器17輸出的激光以及將激光耦合進第一激光輸入光纖11。第三半波片111布置在偏振分束器17的第一出射面與第一準直透鏡110之間，用于接收偏振分束器17輸出的激光，并調整激光偏振方向，使得激光耦合進第一激光輸入光纖11的效率最高。第四反射鏡112布置在偏振分束器17的第二出射面與所述第二激光輸入光纖之間，用于接收偏振分束器17輸出的激光，用于反射激光，以調整激光的位置并投射到所述第二激光輸入光纖中。第二準直透鏡113布置在第四反射鏡112與第二激光輸入光纖之間，用于接收偏振分束器17輸出的激光以及將激光耦合進所述第二激光輸入光纖。第四半波片114布置在第四反射鏡112與第二準直透鏡113之間，用于接收第四反射鏡112反射的激光，并調整激光偏振方向，使得激光耦合進所述第二激光輸入光纖的效率最高。

如圖1和圖3所示，在一個實施例中，所述掃描成像部分包括微機電掃描儀22、物鏡23、掃描透鏡24、準直器25、雙色鏡26和采集透鏡27，其中：

微機電掃描儀22(mems)用于通過轉動改變激光入射角角度的方式將激光對所述活體樣本內部的組織平面進行二維掃描。優選地，微機電掃描儀22的直徑為0.8mm，封裝尺寸為9×9mm²，第一諧振頻率為不超過6khz，其最大光學掃描角度為±10度,支持幀大小為256×256和最大視場為130×130μm²的40hz成像,以實現視頻速率圖像采集。與其它掃描方式相比，例如使用壓電致動器的螺旋或lissajous圖案的光纖掃描相比，本實施例提供的微機電掃描儀22掃描對于其在整個視場上的高速，均勻激發和大掃描角、大視野都是有利的。微機電掃描儀22掃描過程中的x和y控制信號由fpga(現場可編程門陣列)卡(pxi-7853r)生成，該卡也用于驅動聲光調制器以調整激光強度和觸發其它器件(例如，紅外攝像機采集)。來自光電檢測器(h10770p-40，hamamatsujapan)的信號通過高速前置放大器(dhpca-100，femtogmbh，berlin，germany)放大，然后連接到120ms/s數字轉換器適配器模塊(ni5734，nationalinstrumentsinc.，austin，tx，usa)和flexriofpga(pxie-7961r，nationalinstrumentsinc.，austin，tx，usa)，用于高速數據采集。整個系統由基于labview平臺的定制開發軟件控制。

物鏡23用于將來自微機電掃描儀22的激光會聚到所述活體樣本內部，以激發所述活體樣本產生所述熒光信號以及用于輸出所述熒光信號。優選地，物鏡23的數值孔徑(下文均簡稱為“na”)為0.8，na較高，光學層切較薄，這有利于實現亞微米成像分辨率，進而能夠在自由活動的樣本中分辨出樹突和樹突棘的結構和功能變化。

本實施例中，物鏡23使用的是grintechgmbh(jena，germany)的高分辨率水浸小型物鏡(gt-mo-080-018-ac900-450)，這是用4.76×的放大率，0.80的物方na和0.173的像方na進行有限校正。物鏡23的長度為6mm長，直徑是1.4mm，并且具有200μm的工作距離。物鏡23具體包括薄菲涅耳透鏡231、平凸透鏡232、中繼透鏡233和聚焦透鏡234，其中，薄菲涅耳透鏡231和平凸透鏡232都是微型漸變折射率(grin)透鏡。與現有技術中使用的物鏡相比，本實施例入射到物鏡23中的衍射分量(菲涅爾透鏡)有效地校正了雙光子成像期間激發和發射波長之間的大色差，這會使得更好的光束聚焦質量，且改善信號收集效率，從而有利于實現亞微米成像分辨率，進而為能夠在自由活動的樣本中分辨出樹突和樹突棘的結構和功能變化提供有利條件。

掃描透鏡24布置在微機電掃描儀22和物鏡23之間的光路上，用于將微機電掃描儀22二維掃描所產生的角度變化的激光轉化成位置變化的激光。掃描透鏡24使用非球面透鏡(#355160b，lightpathtechnologies，orlando，fl，usa；直徑：3mm；等效焦距：2.7mm)作為掃描透鏡，以減少球面像差。

準直器25布置在激光輸入光纖11與微機電掃描儀22之間，用于準直來自激光輸入光纖11輸出的激光以及減少不同頻率激光之間的色差，以與掃描透鏡24共同匹配物鏡23的圖像na。本實施例的準直器25使用的是消色差準直透鏡(#65-286，edmundopticsinc.，barrington，nj，usa；直徑：2mm，等效焦距：3mm，專用近紅外光)，能夠準直輸出激光器并減少飛秒激光器的不同頻率分量之間的色差，這樣有利于提高傳輸效率(從激光源到樣本高達50％)，光束聚焦和激發效率。

雙色鏡26設在掃描透鏡24和物鏡23之間，用于將激光和熒光信號分開以及輸出所述熒光信號。雙色鏡26采用的是中國福建sunlight有限公司生產制造的產品，尺寸3×3×0.2mm³，反射帶是750-1100nm，透射帶是400-650nm，以將來自掃描透鏡24的激光束反射到物鏡23。采集透鏡27用于有效收集熒光信號。

本發明使用光學設計軟件(zemax)來模擬和優化所有光學元件和它們之間的距離，并使用商業cad軟件(solidworks)進行幾何設計。

本發明提供的微型探頭2的分辨率的具體計算過程如下：

首先，有效激發na(naex)由激發的整個光路確定。準直器25之后的激光束的直徑d1為：

d1＝2·nahc-920·eflc(2.1)

其中，nahc-920是hc-920的na(大約為0.15)和eflc準直器25的等效焦距(3mm)。

因為激光束的直徑d1(0.9mm)大于微機電掃描儀22的尺寸(對于x方向為0.8mm，對于y方向為大約為0.6mm)，考慮到微機電掃描儀22的傾斜度受到其尺寸的限制并由下式給出：

naex＝(1/2·dm/efls)·nao/nai(2.2)

其中，efls是掃描透鏡24的等效焦距(2.7mm)。nao,nai分別表示物鏡的na和圖像na，分別為0.8和0.173。

然后，由微機電掃描儀22的x方向決定的最大激發na為：

naex＝(1/2·0.8/2.7)·0.8/0.173～0.685

使用參考文獻2中的方程計算雙光子激發(ipsf²)的點擴散函數的衍射極限橫向(ωxy)和軸向(ωz)1/e半徑，本實施例有：

其中，浸沒介質(生理鹽水)的折射率不超過1.34，激光的波長為920nm。anaex為0.685，ωxy＝0.304μm和ωz＝1.840μm。

分辨率通常定義為psf²的半高寬(fwhm)，本實施例有：

利用嵌入瓊脂糖中的100nm熒光珠的圖像測量得到：本發明提供的微型雙光子顯微成像裝置的橫向分辨率為0.64±0.02μm，軸向分辨率為3.35±0.36μm。

在上述實施例中,測試本發明的分辨率時制作實驗樣本的方法為：首先將2μl的tetraspeck100-nm熒光珠(t7270，lifetechnologies，oregonusa)稀釋到100μl生理鹽水中，然后與900μl1.5％低熔點瓊脂糖混合。再將含有微球熒光珠(4μm)的瓊脂糖小滴加到蓋玻片上，10分鐘后備用。等效橫向像素尺寸為61nm，軸向掃描間隔為80nm，兩者均大于奈奎斯特采樣定理要求的5倍以上，進而足以測量顯微鏡的真實光學分辨率。

表3是本發明提供的firm-tpm與現有技術中mtpm的分辨率的對比表，第2列是本發明提供的firm-tpm的分辨率及其參數說明，第3-6列是現有技術中mtpm的分辨率及其參數說明。需要說明的是：表3中的*:數據來自文獻。從現有的實驗數據證明：現有技術中mtpm盡管在動物的體外得到了較高的空間分辨率，但是，大多數mtpm在動物的體內表現不佳，并未能得到高信噪比(snr)的熒光圖像。從表3中的對比分析可以得出：本發明提供的firm-tpm的分辨率大約為現有技術中的mtpm的最高分辨率的兩倍，這種高分辨率為解決自由活動動物中單個樹突棘的成像問題提供了有利條件。

表3

為了在同一基準上測試和比較現有技術中的臺式tpm和微型寬場顯微鏡與firm-tpm之間的性能差異，本實施例建立了一個集成平臺，允許在同一樣品上進行臺式tpm模式(圖6)、寬場成像模式(圖7)和firm-tpm成像模式(圖8)之間的切換。如圖6-8所示，該集成平臺配備有微型和常規物鏡、多個照明源(用于tpm的激光器和用于寬場的高功率汞燈)和檢測裝置(用于tpm的gaasp和用于寬場的scmos相機)。不同的成像模式具有相同的焦平面和同心視場、總幀采集時間和成像na，而平均照明功率和檢測器靈敏度也進行了仔細選擇和匹配，下面結合圖6至圖8說明上述集成平臺的組成。

上述集成平臺分別在臺式tpm模式、寬場成像模式和firm-tpm成像模式下對同一標本的同一焦平面進行成像。激光(chameleonvision-s，coherent，usa；中心波長：920nm)，通過h-zf62玻璃管，隨后用聲光調制器(mt110-b50a1.5-ir-hk，aasa，orsaycede，france)。然后將中心波長為920nm的激光分成兩束，一束耦合到在firm-tpm中使用的一根hc-920中，另一束耦合到在臺式tpm中使用的另一根hc-920中。

如圖6所示，在臺式tpm模式中，來自hc-920的準直激光器由一對檢流計計掃描鏡a1(6215h，cambridgetechnology，ma，usa)掃描，然后通過掃描透鏡a2(lms05-bb，thorlabsinc，newjersey)、管透鏡a3(olympusjapan)和第一二向色鏡a4(dm1，dmlp650r，thorlabsinc，newjersey，usa)，然后最終傳送到物鏡a5的后焦平面(bfp)(cfiapo40xwnir，nikon，japan；40×na0.8，工作距離：3.5mm)。來自物鏡a5的熒光發射信號由第一二向色鏡a4反射，通過收集透鏡a6(la1213-a，thorlabsinc，newjersey，usa)、第二分色鏡a7(dm2，#87-284，edmundopticsinc.，barrington，usa，反射帶：375-393,466-490和546-565nm；透射帶：420-460,510-531,590-624和677-725nm)，通過聚光透鏡a8(acl25416u-a，thorlabsinc，newjersey，usa)，最后用光電倍增管a9(gaasppmt7422p-40，hamamatsu，japan)檢測。為了實現與firm-tpm(0.685)相同的激發na，將物鏡a5的后焦平面(bfp)處的激發激光束的光束尺寸設置為：

(2×0.685×200)(mm)/40＝6.85(mm)

其中，200mm是用于該物鏡a5的匹配管透鏡a3的efl，40是物鏡a5的放大率。

如圖7和圖8所示，在寬場成像模式和firm-tpm成像模式中，將本發明提供的微型探頭2連接到定制的微小三軸手動顯微操作器(sigmakoki，tokyo，japan)上，微型探頭2中物鏡像平面是空氣物鏡(planaponir5x，mitutoyo，japan；5×，na為0.14，工作距離為37.5mm)的焦平面。使用具有高精度的雙向重復性(±2.5μm)的4端口物鏡轉盤(ot1，thorlabsinc，newjersey，usa)在微型探頭2和40×尼康物鏡之間切換。通過調整尼康物鏡和微型探頭2之前的鏡頭鏡筒的螺紋，本發明可以設置微型探頭2和尼康物鏡具有相同的焦平面。

如圖7所示，在微型寬視場熒光結構中，使用具有藍光濾光器(mf475-35，thorlabsinc，newjersey，usa；中心波長為475nm，帶寬為40nm)的熒光照明器(x-cite120q，excelitastechnologies，ma，usa)：35nm)作為光源b1。將臺式tpm構造中的第一二向色鏡a4改變為分色鏡b2(dm3，#87-284，edmundopticsinc.，barrington，nj，usa；反射帶：375-393,466-490和546-565nm；透射帶包括：420-460,510-531,590-624和677-725nm),以將照明光反射到微型探頭2,并將來自微型探頭2的熒光發射信號傳輸到科學cmos照相機b3(8050m-ge，thorlabsinc，newjersey，usa)。在臺式tpm和firm-tpm配置中的成像在目標之后使用類似的平均功率，通常為10-25mw。由于單光子和雙光子激發的吸收截面的差異，單光子成像中使用的平均功率通常比雙光子成像中的平均功率低得多。因此，本發明在寬場熒光顯微鏡配置中使用100-500μw照明(在微型物鏡之后)，類似于之前報告中使用的170-600μw照度。

圖14a的左側圖像是thy1-gfp轉基因活體樣本腦的神經元樹突和樹突棘的3d形態成像，在1s的總曝光(firm-tpm和微型寬視場顯微鏡的8hz的8幀的平均值，以及臺式tpm的2hz的2幀的平均值)下獲得大致相同焦平面處的圖像，圖14a的右側曲線是左側圖像中所示的裁剪區域中兩對相鄰樹突棘的橫截面輪廓。圖14b是在表達gcamp6f的活體樣本的pfc中富含神經元胞體的平面(-130μm)的圖像，上部圖片：相同roi的30秒平均圖像。微型寬場圖像顯示為歸一化的δf/f(參見在線方法)；下部波浪線：三個選擇的神經元中ca²⁺的時程變化(持續時間：100秒)(在上圖中用數字標記)。圖14c的左側圖像是來自于(圖14b)中相同活體樣本的樹突和棘突(焦平面-120μm)的ca²⁺信號，由于缺乏可辨別的樹突信號，未示出用微型寬視場顯微鏡記錄的圖像，圖14c的右側上部圖像用臺式tpm捕獲的一個帶樹突軸(d1)和樹突棘(s1，s2，s3)的成像和ca²⁺信號(持續時間：100s)，圖12c的右側下部圖像是用firm捕獲的一個帶樹突軸(d1)和樹突棘(s1，s2，s3)(左)的成像和ca²⁺信號(持續時間：100s)。圖12d是在不同配置中成像的ca2+信號的平均頻率和幅度，來自相同組的神經元胞體(n＝4)，統計：樹突(n＝8)和樹突棘(n＝6)的數據。

對于形態學成像，本發明在thy1-gfp轉基因活體樣本的固定腦中的v1區域(130×130μm²，從表面到60μm以下)進行成像，獲取3d的圖像數據(圖14a)。firm-tpm和臺式tpm在樹突成像中表現出相同的對比度和分辨率(圖14a)。然而，在微型寬場成像模式下，基本上不能分辨結構細節，主要是因為來自焦外組織的強背景信號。在功能成像的比較中，本發明利用腺相關病毒感染的方式在活體樣本前額皮層神經元中表示ca²⁺指標劑gcamp6f，并在頭部固定的清醒活體樣本上進行鈣成像(圖14b-圖14d)。選擇兩個焦平面以顯現來自胞體(表面以下130μm)或樹突和樹突棘(表面以下120μm)的活動。在圖像歸一化和對比增強(δf/f)之后，微型寬場成像以相似的頻率分辨體細胞ca²⁺信號，而它們的幅度(δf/f為5-10％)比用臺式tpm或firm-tpm(δf/f大約為150％)測量的幅度低約一個數量級(圖14d)。值得注意的是，大多數源自樹突結構的ca²⁺信號在這種成像配置中未被檢測到(圖14b和圖14d)。總之，這些基準的測試證明本發明的firm-tpm達到與臺式tpm相同的性能，同時在分辨清醒動物中樹突和樹突棘的結構和功能活性方面優于微型寬場顯微鏡。

在firm-tpm中使用的快速微機電掃描儀22比在高速臺式tpm中使用的共振掃描器具有更加線性的電壓-傾斜響應和可控性。因此其賦予其成像更大的靈活性，使得在單個系統種可以實現快速柵格式掃描成像、任意指定的區域(roi)的隨機掃描成像和超快線掃描成像。特別是128hz的隨機掃描成像有助于分辨ca²⁺信號時間上的超微結構，并且可以賦予mtpm在自由活動的動物中進行精確光遺傳學操作的能力。10khz線掃描成像能力對于利用基因編碼的電壓指示劑來快速觀測動作電位至關重要。

樹突棘活動是神經元信息處理的基本事件，利用臺式tpms在頭固定的動物上的研究表明單個神經細胞的不同樹突棘可以被不同朝向的視覺刺激或不同強度頻率的聲音刺激所激活。雖然通過微型寬場顯微鏡獲得的數百個神經元的整體活動可以幫助探測在不同行為條件下的神經元網絡編碼特性，本發明的firm-tpm提供了一個可供選擇的更加強大的工具，在頭固定動物上不能實現的行為范式中對更加基本的神經編碼單位的時空特性進行觀測。

總之，新開發的firm-tpm已經實現了高時空分辨率，良好的機械穩定性，以及對應用范圍最廣的指示劑的有效激發。通過使用新一代的mtpm，本發明實現了在自由活動的動物中單突觸水平的長時間成像這一科學家夢寐以求的目標?？梢灶A見未來會有更多的改進和擴展。使用正確設計的微型高na物鏡，可以進一步擴展fov和穿透深度。深腦成像可以通過直接將微型物鏡插入腦中，或通過在大腦中嵌入grin透鏡來實現，類似于以前報告的方法。對于較大的動物，例如大鼠或狨猴，可以在頭骨上安裝多個firm-tpm，以探索大腦中遠程結構和功能連接的相關問題。本發明預計，firm-tpm將被證明是神經科學家以及生物醫學科學家在動物體內探索健康和疾病機制的重要工具。

如圖5a所示，本發明還提供一種活體樣本行為成像系統，所述活體樣本行為成像系統包括箱體3、飛秒脈沖激光器、飛秒脈沖激光調制器1、微型探頭2、數據收集組件7和線路安裝組件，其中：

飛秒脈沖激光器用于產生波長為920納米的激光。飛秒脈沖激光調制器1用于接收所述飛秒脈沖激光器輸出的激光，并預啁啾補償激光的脈沖展寬至預設值，該預設值優選不超過100fs，并輸出。微型探頭2用于安裝在活體樣本身上，且輸入端通過所述飛秒脈沖激光調制器中的激光輸入光纖連接所述飛秒脈沖激光器的輸出端，用于接收所述飛秒脈沖激光調制器輸出的激光，該激光對活體樣本內部的組織進行掃描，以激發所述活體樣本產生熒光信號；以及用于接收所述掃描成像部分輸出的所述熒光信號，并進行輸出。飛秒脈沖激光器、飛秒脈沖激光調制器1和微型探頭2在上文均已經詳細介紹，此處不再贅述。

箱體3為活體活體樣本的自由移動提供限定空間，該限定空間相比于活體樣本的體型要大很多，可以為活體樣本的自由活動提供足夠大的空間。數據收集組件7安裝在箱體3上，數據收集組件7的輸入端通過熒光輸出光纖21連接微型探頭2的輸出端，用于收集微型探頭2輸出的所述熒光信號。激光輸入光纖11和熒光輸出光纖21通過所述線路安裝組件以能夠相對于3箱體隨意轉動的方式安裝在箱體3上。通過線路安裝組件，可以防止熒光輸出光纖21、激光輸入光纖11和其它供電線8彼此之間相互纏繞，為活體樣本的自由活動提供有利條件。

在一個實施例中，數據收集組件7提供探測光路，該探測光路上包括同軸布置的光電倍增管71、聚光器72、發射濾光片73、短通濾光片74和收集透鏡75，其中：光電倍增管71用于將光信號轉化為電信號后輸出。聚光器72用于匯聚由熒光輸出光纖21傳輸的熒光信號。發射濾光片73用于濾掉波長為920納米的激光。短通濾光片74用于過濾掉除信號光以外的雜散光。熒光輸出光纖21與收集透鏡75共軸，且熒光輸出光纖21位于收集透鏡75的焦平面上，收集透鏡75用于將所述熒光信號更充分的收集到光電倍增管71中。

優選地，所述線路安裝組件包括電動旋轉頭6和支架10，其中：電動旋轉頭6貫穿設置在箱體3的頂部，并且，一端連接外部電源，另一端連接供電線8，使所述外部電源與供電線8能夠電連接。支架10罩設在位于箱體3頂部的電動旋轉頭6外，激光輸入光纖11和熒光輸出光纖21穿過電動旋轉頭6的外殼，熒光輸出光纖21與數據收集組件7中的收集透鏡75光信號連接。熒光輸出光纖21通過軸承9連接到數據收集組件7，這樣，電動旋轉頭6和軸承9允許熒光輸出光纖21和供電線8進行獨立地旋轉，同時保持探測光路不變，這種設計防止了活體樣本自由探索其環境時造成的連接線的纏繞，極大地提高了微型探頭2的穩定性，即使活體樣本進行強烈的身體活動也不會有影響，以使動物在自由探索期間線的扭曲和纏繞最小化。

在一個實施例中，所述自由移動活體樣本行為成像裝置還包括供電線8，為微機電掃描儀22供電。供電線8通過所述線路安裝組件以能夠相對于所述箱體隨意轉動的方式安裝在所述箱體上，從而保證供電線8能夠正常供電，也能夠避免供電線8與激光輸入光纖11和熒光輸出光纖21彼此相互纏繞，以使動物在自由探索期間線的扭曲和纏繞最小化。

在一個實施例中，所述自由移動活體樣本行為成像裝置還包括多個相機4，相機4都安裝在箱體3的內壁上，比如圖2中示出的安裝在箱體3的側面以及頂面，分別以不同的角度拍攝和記錄活體樣本的自由移動過程的行為。

在一個實施例中，所述自由移動活體樣本行為成像裝置還包括照明燈5，照明燈5安裝在箱體3的內壁上，用于照明箱體3的內腔。

如圖12a-12e所示，圖12a是v-1皮質l2/3神經元的50張平均firm-tpm(本發明的微型雙光子顯微成像裝置)圖像，圖像中圈出了1、2、3個樹突。圖12b是活體樣本在競技場內的二維軌跡(持續時間：100秒)，從其中頂部的相機捕獲的視頻記錄計算軌跡，并且移動速度用顏色編碼。圖12c和圖12d分別是在頭部固定(12c)和自由移動條件(12d)下從三個樹突(在圖12a中圈出)的ca²⁺信號的時程(持續時間：100s)，活體樣本速度的時間相關變化也顯示在底部。圖12e是在頭部固定和自由移動條件下所有樹突狀ca²⁺瞬變的平均頻率；數據表示為平均值±s.e.m.，n＝15個樹突。***p<0.001，配對t檢驗。由以上實驗數據，可以發現當活體樣本在黑暗中自由地探索時(軌跡顯示在圖12a-12e中)，其視覺皮層的神經元樹突活性相對于活體樣本頭部固定的情況有顯著的增加(圖12a-12e)。

如圖13a-13c所示，圖13a是在三種不同的行為范例內的視覺皮層中成像神經元活動：懸尾試驗、跳臺、社交行為。最左側第一列圖像：通過在行為裝置側面上的側面的兩個相機拍攝的活體樣本參與不同行為的快照；中間第二列圖像：gcamp6f標記的神經元胞體，樹突和樹突棘的firm-tpm成像；右側第三列圖像：相應的鈣活動分布圖(持續時間：100s)。最右側第四列圖像：firm-tpm圖像中指示的三個roi的ca²⁺信號(持續時間：50秒)。圖13b是firm-tpm成像的短期和長期穩定性，圖13b左側曲線是基于每個行為范例中

這個結果與多位點電學探針記錄到的運動可以增強動物視覺皮層神經元活動一致。接下來，為了證明firm-tpm的魯棒性，本發明在活體樣本的初級視覺皮層中的130×130μm²的fov上進行40hz的成像來觀察其神經元的活動，該活體樣本在三種行為范例中依次測試，包括懸尾實驗、跳臺和社交行為。這些范例都不能在頭部固定的實驗策略中實現，整個測試過程持續約4小時。值得注意的是，即使當活體樣本在懸尾試驗中強烈掙扎，從高臺跳下或與其同胞交流時，來自不同胞體、樹突和樹突棘的活性仍然可以被穩定的觀測。不同的行為范式似乎與同一v1皮層的不同區域的神經活動相關聯(圖13a)。

為了量化本發明提供的微型雙光子顯微鏡的短期和長期穩定性，本發明通過逐幀互相關和視場的一段時間到另一段時間的漂移來分析橫向位移(圖13b)。本發明發現，在2000連續幀內，幀與幀之間的平均位移在跳臺行為范例中(0.19±0.09μm；75％在0.24μm以下)是最大的，但仍然小于像素大小的一半。在整個4h測試中，firm-tpm的fov的整體漂移<10μm，大多數漂移發生在懸尾實驗中劇烈運動的第一個小時。值得注意的是，較高的圖像采集速度降低了幀內的錯位，這種水平的運動偽影并不妨礙本發明對樹突棘結構和功能的成像。為了演示本發明提供的微型雙光子顯微鏡對單突觸活動的成像能力，通過跟蹤樹突棘及其父樹突軸上的ca²⁺活動，本發明進一步分析了整體和局部活動之間的關系?？偠灾?，本發明提供的微型雙光子顯微鏡能夠在自然生理環境中對自由活動的動物的樹突和樹突棘活動進行穩定的觀測。

本發明還提供一種微型雙光子顯微成像方法，所述微型雙光子顯微成像方法包括：

步驟1，選取待成像區域：固定活體樣本，并利用臺式tpm在所述活體樣本上選取待成像區域。在步驟1中，需要采用如圖6示出的成像平臺，并在臺式tpm模式下，也就是說利用臺式tmp在活體樣本上選取待成像區域，具體操作是：利用身體固定器固定活體樣本，以通過臺式tpm來確認活體樣本頭部的病毒感染的區域。

步驟2，采集熒光信號：將連接有激光輸入光纖的微型探頭安裝在所述活體樣本上，釋放活體樣本，以檢測步驟1中選取的待成像區域輸出的熒光信號，完成所述活體樣本內部的組織平面的成像。步驟2具體操作如下：

首先，將本發明提供的微型探頭2粘合到活體樣本頭部顱骨的支架上，該支架在開顱手術準備期間已經固定在活體樣本頭部的顱骨上，再用牙科水泥將微型探頭2加固到活體樣本頭部顱骨的支架上。

然后，將1.5％低熔點瓊脂糖覆蓋到暴露的腦組織區域。該方法顯著的抑制了探頭和大腦之間的相對運動。為了實現隨機存取中對大量神經元的染色，標記神經元的過程為：本發明用人工腦脊液(sigma-aldrich，中國上海；mm，125nacl，4.5kcl，26nahco3，1.25nah2po4，2cacl2，1mgcl2，20葡萄糖，當用95％o2和5％co2充盈時ph為7.4)覆蓋暴露腦區。將50微克cal-520am(aatbioquest.ca，usa)溶解于4μldmso(含20％pluronicf-127)中，并用人工稀釋液(mm，150nacl，2.5kcl，10hepes,ph7.432)稀釋至500μm。使用2-3mω電阻的硼硅酸鹽移液管，通過施加壓力脈沖(1分鐘，400毫巴)將ca²⁺染料注射到初級視覺皮層的層2/3中。1小時后，將sr-101滴加到皮質表面以鑒定星形膠質細胞。將活體樣本頭部固定，并使用firm-tpm以隨機存取模式進行成像。

最后，將活體樣本從固定器上釋放，并放入上述實施例的小動物成像系統的箱體3中，利用微型探頭2對活體樣本進行懸尾實驗測試或滑落實驗測試(圓柱形平，5cm²，5cm高)和社交行為(30×30cm²方形活動場地)。

步驟3，處理所述熒光信號，獲取活體樣本自由活動的三維圖像。

在上述步驟之前,還包括如下步驟4,制作活體樣本，具體包括：

步驟41，選取活體樣本:在實驗中使用c57bl/6野生型和thy-1-gfp轉基因活體樣本(出生后8-16周)。所有程序均符合北京大學動物使用與護理委員會和實驗動物護理評估和認證協會的標準，包括動物育種和實驗操作。將thy-1-gfp轉基因活體樣本麻醉并用0.9％鹽水灌注，然后用4％多聚甲醛灌注，并取出腦。在4℃的4％多聚甲醛的pbs中固定過夜。

步驟42，用于活體腦皮質成像的切骨術：在這些實驗中使用c57bl/6野生型活體樣本。簡言之，通過吸入純o2中的1-1.5％異氟烷將活體樣本麻醉，并置于立體定位框架(68025，rwd，中國深圳)上。同時，使用加溫板(37.5-38℃)保持活體樣本的正常溫度。在局部施用xylocaine并去除皮膚和肌肉之后，在目標皮層的中部用高速顱鉆(尖端直徑0.5mm)鉆開小方形頭窗(0.5×0.5mm²)。gcamp-6f用重組aav在鈣調素依賴性激酶ii(camkii)啟動子(血清型2/9；>2×10¹³個基因組拷貝/ml，由賓夕法尼亞大學基因治療程序載體核心產生)下表達。使用注射器(nanoliter2010，worldprecisioninstruments，sarasota，usa)和玻璃微電極，在20分鐘內將總量為0.5-0.8μl的aav緩慢注射到活體樣本的靶向皮質的2/3層(深度為130-400μm)。在表達3周后，用異氟烷麻醉活體樣本，用氰基丙烯酸膠將自制的支架連接到顱骨上并用牙齒水泥加固。用顱鉆在目標皮質上鉆出小的方形頭窗(2.5×2.5mm²)。小心地去除硬腦膜，將小型玻璃蓋玻片(3.5×2.5mm²)放在開顱上。恢復一周后，然后每天訓練活體樣本適應頭部固定30分鐘，持續3天。在清醒的活體樣本適應之后，操作步驟1和步驟2。

最后需要指出的是：以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制。本領域的普通技術人員應當理解：可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的精神和范圍。