一種檢測人類cox-2基因多態(tài)性的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物醫(yī)學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術，特別設及一種檢測人 類C0X-2基因多態(tài)性的試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 環(huán)氧化物水解酶(cyclo-0巧gen-ase，C0X)，是前列腺素(PGs)合成所必須的酶，也 是PGs合成初始步驟中的關鍵性限速酶。C0X有兩種同工酶C0X-1和C0X-2。人體C0X-2基因定 位于染色體的lq25.2~q25.3區(qū)，長度約8.3kb，包含10個外顯子和9個內含子，共編碼604個 氨基酸。在5^端轉錄起始點上游有一些轉錄調控序列，包括2個核轉錄因子-KB(nuclear facto;r-KB，NF-KB)位點、2個激活蛋白質-(2activator po;rtein-2，AP-2)位點、TATA box序 列、cAMP反應元件（cAMPresponsive element，CRE)、CCAAT增強子結合蛋白位點（CCAAT/ enhancer binding protein，C/邸P)、Ets-l轉錄因子位點等。COX-2幾乎在所有組織中有表 達，主要分布于細胞核膜上，其表達調控主要集中在轉錄水平。誘導其表達的因素包括癌基 因、白細胞介素-1、缺氧、紫外線、轉化生長因子和腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis f actor-α，TNF-α)等，而地塞米松、抗氧化劑、抑癌蛋白P53等則可抑制其表達。因此，COX-2 基因多態(tài)性改變可能潛在地影響某種因子的結合，改變基因的轉錄活性，進而影響環(huán)氧化 酶的表達。通過對C0X-2基因多態(tài)性的檢測可為個體對某些疾病(如癌癥等）的易感性診斷 提供幫助
[0003] 在本發(fā)明作出之前，目前進行基因突變檢測的方法有數(shù)十種。金標準法為基因測 序法。基因測序法是目前應用最廣泛、較準確的一種方法，但是該方法需要昂貴的儀器設備 和專業(yè)的人員進行操作，費時費力，在臨床上很難進行推廣。基因忍片法具有快速高通量的 優(yōu)點，但是操作上復雜，步驟多，成本高也不易普及。W限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP) 檢測基因突變的方法具有成本低廉的優(yōu)點，但是過程煩瑣，時間長也不適合普及。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種檢測人類C0X-2基因多態(tài)性的試劑 盒及其應用。
[0005] 本發(fā)明的技術方案是：
[0006] -種檢測人類C0X-2基因多態(tài)性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內的物質，其主要 技術特征在于:所述盒體內的物質包括檢測C0X-2基因上的rs20417號SNP位點的特異性引 物及特異性巧光探針、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCb溶液、巧光定量PCR反應緩沖液和 去離子水；
[0007] 所述特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：
[000引 正義引物：5 ' -CAGAAGAAATACTGTTCTCCGTACC-3 '，
[0009] 反義引物：5 ' -TCCATCAGAAGGCAGGAAACT-3 ' ；
[0010] 所述特異性巧光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：
[0011] 野生型探針：5 ' -FAM-TTTCCCGCCTCTCT-MGB-3 '
[0012] 突變型探針：5 ' -HEX-TTTCCCCCCTCTCT-MGB-3 '。
[0013] 所述盒體中各物質的含量為:濃度為ΙΟμΜ的特異性引物共0.45μ1，其中正義引物 和反義引物各0.22扣1;濃度為扣Μ的特異性巧光探針共0.化1，其中野生型探針和突變型探 針各0.化1;濃度為5單位/μ1的化q DNA聚合酶0.02μ1;濃度為20mM的dNTP混合液0.化1;濃 度為25mM的MgC12溶液0.化1; 5X巧光定量PCR反應緩沖液化1;去離子水4.73μ1。
[0014] 所述特異性引物中，正義引物的Tm值為58.6°C，反義引物的Tm值為58.5°C;所述特 異性巧光探針中，野生型探針的化值為67Γ，突變型探針的化值為66Γ。
[0015] 所述試劑盒的保存溫度為-2(TC。
[0016] 本發(fā)明的另一技術方案是：
[0017] -種檢測人類C0X-2基因多態(tài)性的試劑盒的應用，其主要技術物征在于:所述試劑 盒用于檢測C0X-2基因上的rs20417號SNP位點的基因型。
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，優(yōu)點在于檢測準確性高、檢測簡單方便、檢測時間短、結 果分析簡單的優(yōu)點，適合臨床實驗室使用：
[0019] (1)利用本發(fā)明試劑盒能夠對C0X-2基因多態(tài)性位點進行定性檢測，根據(jù)SNP位點 進行PCR巧光擴增反應，只需根據(jù)兩種不同的巧光曲線是否起線就能進行結果判斷，不會產 生人為誤差，假陽性和假陰性率低，提高效率降低檢測成本。
[0020] (2)無需DNA提取，只需裂解全血細胞，將細胞裂解后的懸液加入反應體系即可完 成擴增，免去DNA提取的步驟和成本并避免氣溶膠污染，提高檢測效率和準確度，縮短檢測 時間。
[0021] (3)本發(fā)明試劑盒所使用的巧光檢測探針為Taqman探針，該探針費用低廉；同時本 發(fā)明所有的反應全程閉管操作，PCR反應后不需要進行PCR產物純化、電泳、酶切、雜交等，在 節(jié)省了檢測成本的同時，大大縮短了檢測周期，提高了檢測的效率，另外降低了 PCR產物污 染引起假陽性的風險。
【附圖說明】
[0022] 圖1--C0X-2基因上的rs20417號SNP位點-純合野生型擴增曲線示意圖。
[0023] 圖2--C0X-2基因上的rs20417號SNP位點-雜合型擴增曲線示意圖。
[0024] 圖3--C0X-2基因上的rs20417號SNP位點-純合突變型擴增曲線示意圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在W本發(fā)明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。
[0026] -種檢測人類C0X-2基因多態(tài)性的試劑盒，試劑盒中包括W下C0X-2基因上的 rs20417號SNP位點的擴增特異性引物1對及2條特異性巧光探針。
[0027] 用于C0X-2基因上的rs20417號SNP位點檢測的特異性引物中的正義引物和反義引 物的序列為：
[002引正義引物：5 ' -CAGAAGAAATACTGTTCTCCGTACC-3 '，
[00巧]反義引物：5 ' -TCCATCAGAAGGCAGGAAACT-3 ' ；
[0030] 所述特異性巧光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：
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