專利名稱：從白樺的葉片誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)，具體的講，本發(fā)明屬植物生物技術(shù)的白樺生物技術(shù)。
目前，白樺作為林木細(xì)胞工程模式種，其組織培養(yǎng)技術(shù)一直為國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注。從七十年代末起，國外就開始對白樺的組織培養(yǎng)進(jìn)行研究。Huhtiren等人于1974年，Mc crown等人于1979年分別對歐洲白樺(Betula pendula)和美洲樺(B.papyrifera)組織培養(yǎng)獲得成功。我國的樺樹離體培養(yǎng)工作開始于九十年代。有關(guān)白樺(B.platyphylla)的組織培養(yǎng)報道僅發(fā)表在1999年東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報上，其中陶靜、詹亞光等人發(fā)表了白樺組織培養(yǎng)的研究，詳細(xì)報道了有關(guān)白樺的組織培養(yǎng)技術(shù)。他們利用腋芽完成了白樺的快繁成功，但并沒有利用葉盤外植體建立起再生體系。
本發(fā)明的目的在于提供一種適合于白樺的葉盤組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是在由硝酸鉀、硝酸銨、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、七水硫酸鋅、硼酸、五水硫酸銅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、乙二胺四乙酸二鐵、六水氯化鈷、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺、鹽酸吡哆醇、瓊脂、蔗糖組成MSB5培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上還增加6－BA、NAA及IBA。
MSB5培養(yǎng)基配方為
本發(fā)明的優(yōu)點是該培養(yǎng)基誘導(dǎo)率高，增殖率高，可以在較短的時間內(nèi)得到大量的再生苗，建立優(yōu)良的再生體系，并為根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化提供了保障。
下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)的描述。
該培養(yǎng)基的組成成分是硝酸鉀、硝酸銨、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、七水硫酸鋅、硼酸、五水硫酸銅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、乙二胺四乙酸二鐵、六水氯化鈷、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺、鹽酸吡哆醇、瓊脂、蔗糖組成MSB5培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上還增加6－BA、NAA及IBA，本發(fā)明的特征是在原來MSB5培養(yǎng)基基礎(chǔ)上增加了6－BA、NAA及IBA，在世界上首次建立起白樺的葉盤再生體系。
MSB5培養(yǎng)基配方為
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB5＋6－BA1.0mg/l＋NAA0.2mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂；所述的伸長培養(yǎng)基MSB5＋6－BA0.4mg/l＋GA30.2mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂；
所述的生根培養(yǎng)基1/2MSB5＋I(xiàn)BA0.5mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂。
各種培養(yǎng)基配置時除添加以上成分外，PH值要調(diào)整為5.8，分裝后在121℃，1.1kg/cm2的壓力下滅菌20分鐘；所述的生根苗移栽的條件的環(huán)境濕度應(yīng)保持在90—100％或過飽合狀態(tài)，光照溫度保持在500—800Lux。
MSB5培養(yǎng)基配方為
應(yīng)用以上培養(yǎng)基，用白樺葉盤接鐘在該培養(yǎng)基上，一個月可以產(chǎn)生不定芽。轉(zhuǎn)移到伸長培養(yǎng)基里培養(yǎng)，并繼代一次，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基即可誘導(dǎo)生根。待生根苗生長健壯后，即可進(jìn)行移栽，經(jīng)溫室培養(yǎng)兩周，逐漸移至苗圃培養(yǎng)。
本發(fā)明用白樺(Betula platyphylla)的葉盤進(jìn)行培養(yǎng)，取得成功，葉盤來源于腋芽再生苗、下胚軸再生苗和莖段再生苗，這些再生苗的基本培養(yǎng)基為改良的WPB5，具體操作如下WPB5培養(yǎng)基配方為
1、腋芽再生苗葉盤的獲得于12月至次年3月從生長健壯、無病蟲害的優(yōu)樹上采集枝條，保存于4℃冰箱。接種前將枝段在室溫下水培7—10天，待芽萌動后即可用于接種。將萌動芽取下后，在表面活性劑的作用下用自來水沖洗，除去表面灰塵，然后用70％乙醇消毒1min。在超凈工作臺中用5％次氯酸鈉處理10min后可進(jìn)行接種。
腋芽可以通過腋芽生枝和愈傷兩種途徑進(jìn)行增殖。腋芽生枝途徑的培養(yǎng)基成分如下起始培養(yǎng)基WPB5(WP大量＋WP微量＋B5有機物)＋0.8mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂增殖培養(yǎng)基WPB5＋0.5mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂愈傷途徑的培養(yǎng)成分如下起始培養(yǎng)基WPB5＋1.0mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂繼代培養(yǎng)基WPB5＋1.0mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂分化培養(yǎng)基WPB5＋0.5mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂離體培養(yǎng)三代以上的再生苗葉盤可用于再生培養(yǎng)。
2、下胚軸再生苗葉盤的獲得9日齡下胚軸接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，7天端部開始膨大，20天后形成各種愈傷組織。將愈傷組織從外植體上切下，在繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天后，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，20天后愈傷組織開始分化出再生苗。再生苗離體培養(yǎng)三代后的葉盤可以用于再生培養(yǎng)。
獲得下胚軸再生苗的培養(yǎng)基如下愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基WPB5＋1.0mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂愈傷繼代培養(yǎng)基WPB5＋1.0mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂愈傷分化培養(yǎng)基WPB5＋0.5mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂壯苗培養(yǎng)基WPB5＋0.5mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂3、莖段再生苗葉盤的獲得莖段接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基7天后兩端開始膨大，逐漸形成綠色致密愈傷，30天后將愈傷從莖段兩段切下，經(jīng)過30天繼代培養(yǎng)后，將愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基。20天后愈傷分化出再生苗，再生苗離體培養(yǎng)三代后，葉盤可用于再生培養(yǎng)。
愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基WPB5＋1.0mg/lBA＋0.1mg/lNAA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂愈傷繼代培養(yǎng)基WPB5＋1.0mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂愈傷分化培養(yǎng)基WPB5＋0.5mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂壯苗培養(yǎng)基WPB5＋0.5mg/lBA＋20g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂將通過上述途徑獲得的葉片邊緣剪去，沿與主脈垂直的方向?qū)⑵浼舫芍睆郊s為0.5cm的葉盤，將葉盤向軸面朝下接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，一個月后將誘導(dǎo)出的不定芽從邊緣切下轉(zhuǎn)入伸長培養(yǎng)基，在伸長培養(yǎng)中繼代一次后，當(dāng)再生苗長到1.5—2cm直徑為1mm時，將再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，經(jīng)過3—4周培養(yǎng)小苗已具有了發(fā)達(dá)、健壯的根系，苗莖已木質(zhì)化，此時即可進(jìn)行移栽。
將生長健壯的生根試管苗除去棉塞在溫室進(jìn)行3天左右的煉苗，使試管苗適應(yīng)環(huán)境的濕度。移栽前將再生苗從三角瓶中取出，洗去根上粘有的培養(yǎng)基，栽入溫室進(jìn)行培養(yǎng)，澆透水。試管苗移栽初期對環(huán)境要求嚴(yán)格，環(huán)境濕度應(yīng)控制在90％，光照強度為5000Lux左右，才能保證移栽的成活率。
葉盤再生培養(yǎng)基如下誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB5＋6－BA1.0mg/l＋NAA0.2mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂伸長培養(yǎng)基MSB5＋6－BA0.4mg/l＋GA30.2mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂生根培養(yǎng)基1/2MSB5＋I(xiàn)BA0.5mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂
權(quán)利要求
1.一種從白樺的葉片誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基，其特征在于在由硝酸鉀、硝酸銨、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、七水硫酸鋅、硼酸、五水硫酸銅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、乙二胺四乙酸二鐵、六水氯化鈷、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺、鹽酸吡哆醇、瓊脂、蔗糖組成MSB5培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上還增加6—BA、NAA及IBA。MSB5培養(yǎng)基配方為
2.按照權(quán)利要求1所述的從白樺的葉片誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基配方還包括a、誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB5＋6－BA1.0mg/l＋NAA0.2mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂；b、伸長培養(yǎng)基MSB5＋6－BA0.4mg/l＋GA30.2mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂；c、生根培養(yǎng)基1/2MSB5＋I(xiàn)BA0.5mg/l＋40g/l蔗糖＋5.5－6.5g/l瓊脂。
3.按照權(quán)利要求1所述從白樺的葉片誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基，其特征在于生根苗移栽的條件的環(huán)境濕度應(yīng)保持在90—100％或過飽和狀態(tài)，光照強度保持在500—8000Lux。
全文摘要
一種從白樺的葉片誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基,由硝酸鉀、硝酸銨、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、七水硫酸鋅、硼酸、五水硫酸銅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、乙二胺四乙酸二鐵、六水氯化鈷、煙酸、肌醇、鹽酸硫胺、鹽酸吡哆醇、瓊脂、蔗糖組成MSB
文檔編號A01H4/00GK1334003SQ0013431
公開日2002年2月6日 申請日期2000年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月13日
發(fā)明者祖元剛, 孔瑾, 王慧梅, 聶明珠, 石福臣, 谷會巖, 楊逢建, 張寶友 申請人:東北林業(yè)大學(xué)