專利名稱：增加轉基因生物質的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高轉基因生物質的數量和質量的方法，并且將以玉米為例進行更具體地說明。
延緩具有治療用途的重組蛋白在植物中表達的開發的因素是獲得含有所述重組蛋白的植物原材料所需要的時間，這一時間不能夠減少。
這一問題在諸如玉米的某些物種中顯得尤為突出，因為一方面獲得初級轉化體所需要的時間比較長，另一方面，進行所述重組蛋白表達的器官(在這里是組織)的產量較小。因此，這種類型植物的使用，在純化并提取所產生的重組蛋白之前，需要繁殖階段。這些階段對于工程動力學來說是有害的。
本發明的目的是增加第一代所獲得的生物質，并因此減少為了獲得大量的生物質所需要繁殖階段的數量。這將有可能極顯著地縮短研究和開發過程時間，并獲得較廉價的、大量的植物原材料或生物質，同樣還能縮短分析感興趣的重組蛋白的一致性所需要的時間。
種子繁殖是一種對數現象在每一代，所獲得的具有典型的可轉化基因型的種子的數量大約增殖100倍，這一過程的農藝價值是較低的。根據所采用的雜交技術——回交或者自交，由可變比例的所形成的種子會含有感興趣的基因。
本申請人業已發現，這一問題的解決方案在一定程度上有賴于增加有性繁殖之前的原始種子庫，這樣，有可能獲得一個繁殖周期，并極迅速的獲得另人滿意的生物質的數量，用于在上述類型的植物中進行實驗和重組蛋白生產。
因此，本發明的一個目的是增加轉基因植物生物質的方法，其特征在于它包括以下步驟(a)繁殖植物愈傷組織，該愈傷組織含有一個感興趣的遺傳轉化事件，并且能夠再生；(b)可選地選擇至少含有一個感興趣的遺傳轉化事件的愈傷組織；(c)由所述愈傷組織再生完整的轉基因植株，稱之為原始轉化體或T0植株；
(d)用非轉基因花粉給所述原始轉化體授粉；(e)收獲所得到的種子，稱之為T1，它里面至少整合了一個感興趣的轉基因；(f)播種所述轉基因T1種子，并通過自花授粉或自由授粉形式讓所產生的植株授粉；(g)收獲T2種子。
該方法優選預先[有遺漏]還包括另一個對T2種子實施收獲后表型分類的步驟。
更優選所述分類是對來自僅被用作母本的植株的T2種子進行的。在本發明的一種優選實施方案中，轉基因T2種子具有不同于非轉基因種子的有色表型。
特別優選的是，來自被用作父本植物和用作母本植物的植株的T2種子是彼此獨立地收獲的。
所述植物優選是異花授粉的，所述植物更優選是玉米。
在一種優選實施方案中，所述在用非轉基因花粉授粉之前，對所述原始轉化體進行割穗或去雄。
在另一種優選實施方案中，所述繁殖步驟包括產生幾十個，優選大約20個拷貝的含有每一種遺傳轉化事件的植株。例如，對玉米來說，為了獲得含有一個或多個轉基因的玉米愈傷組織，可以使用用農桿菌屬轉化玉米的技術，涉及到使用未成熟的胚胎。該技術包括一個再生階段，由此產生能夠有效拷貝的轉化體。這一拷貝過程比較容易實施，從而有可能體外獲得幼小的轉化T0植株，這些植株在轉基因上是嚴格相同的。這些植株可用肉眼分離，并且是具有良好的可靠性的原始植株的拷貝。所涉及到的額外的工作相當于克隆工作，在人工氣候室中培養所有的克隆，然后在溫室中培養，以及通過分子分析有價值的克隆的性質而進行的控制。可以對所有的原始轉化體進行所述克隆，然后，再進行一次生化篩選之后，舉例來說，僅有最有價值的(有與插入片段一致的最強的表達)轉化體被保留下來。
根據另一種優選實施方案，播種轉基因T1種子，培養并用作父本植物。
優選地，所述轉基因T1種子優選以4/2或6/2的比例與用作母本植物的非轉基因植物成行地相間種植。
在這種情況下，更優選的是所述母本轉基因植物是雄性不育植物。
根據上述實施方案的一種優選變體，所述母本非轉基因植物是去過雄的。
最后，與父本植物相比，所述母本植物優選具有較高的農藝價值。
下面的詳細說明通過非限定性實施例的形式說明了本發明的優選對玉米進行遺傳轉化的技術，如Y.Ishida等所述(自然生物技術，14卷，1996年6月，745-749)，要么使用粒子槍要么使用農桿菌，包括繁殖具有再生潛力的轉化的愈傷組織。本發明的第一部分包括擴大由遺傳轉化事件所獲得的再生的數量。
細胞生物學家能夠檢測、取樣并分離源于轉化事件的每一種類型的細胞，因為所述細胞能夠在一種選擇培養基上發育(而非轉化組織不能夠在所述選擇培養基上繁殖)。然后，通過連續改變培養基中所含的合適植物激素的平衡，可以形成遺傳上修飾過的新型植株。生物學家是根據觀察愈傷組織形成的確切位點來鑒定轉基因愈傷組織的。這種宏觀篩選不能夠區分發生在相鄰細胞中的兩個遺傳轉化事件。這就是不會從同一個原始愈傷組織中明顯產生各種轉化事件的風險的原因，生物學家通常讓所鑒定的每一種愈傷組織的1-2個植株生長到成熟。
可以通過對其DNA進行分子分析證實有關植株是否確實源于相同的轉化事件。通過用針對所述轉基因的一種或多種探針進行Southern分析，通過正確選擇限制酶，可以證實所述轉基因確實插在同一位點。經驗表明，一個有經驗的細胞生物學家能夠很好地篩選愈傷組織，并且由同一個愈傷組織所產生的再生在絕大多數情況下是來自同一個轉化事件。因此，通過在轉基因愈傷組織繁殖的常規階段增加一個或多個額外的繼代步驟，有可能增加由一個轉化事件所獲得的再生的數量。額外的細胞生物學工作很少，并且該方法僅比常規方法延長了3周，而一種常規方法平均需要持續29周。如上文所述，通過Southern分析控制，可以證實所獲得的所有植株確實原于同一個轉化事件。就所述轉基因而言，它們是拷貝，盡管有可能發生體細胞克隆變異。有理由設想用這種方法產生每一種轉化事件的大約20個拷貝。
常規采用的遺傳轉化植物的技術不能夠完全控制轉基因的整合選擇轉基因的整合位點、拷貝數量。因此，通常用一種分子結構產生幾十個原始轉化體，目的是讓所述分子結構整合到該植物的基因組中，以便能夠篩選到最佳轉化體(例如，以確保僅有需要的序列存在，或者能進行正確表達)。通常，這些新產生的植株被稱為原始轉化體，在體外經過短暫的發育之后，馴化并在溫室中生長到成熟。對玉米來說，一方面由于其育性在體外培養中所遇到的問題，另一方面為了避免通過花粉混雜的任何轉化事件，最常見的是對原始轉化體進行割穗(去雄)。所述轉基因植物的后代是通過用非轉基因花粉對轉基因雌穗授粉而獲得的。由于一方面用于實施所述遺傳轉化的玉米的品種，另一方面在體外它所經受的壓力，所獲得的總的T0種子數量大多在50-150之間。對于轉基因的單一座位整合來說(這是最常見的)，在原始轉化體上所產生的種子(被稱為T1)只有50％是轉基因的。這些種子可以像任何種子一樣使用。如果一種轉基因能夠產生對一種除草劑的抗性，那么通過這種除草劑很容易篩選源于轉基因種子的植株。通常，讓這些植株自花授粉或自由授粉，以便獲得T2種子。對于適合體外培養的這一類品種來說，世代繁殖的程度大約為100倍。由于每一個轉化事件制備了大約20個拷貝，這使得能夠獲得每一個轉化事件的大約1000個轉基因T1種子(而不是傳統技術的平均50個)。這樣能夠用最低的工作量獲得足夠的花粉數量，用于對非轉基因植物授粉。這是本發明的第二部分。在大田中或是在溫室中進行的培養，是以類似玉米雜交種的常規生產的方式進行的。在這種情況下，被用作父本的轉基因植物是成行地、與被用作母本的非轉基因植物相間種植的(4/2或最常見為6/2系統)。這些轉基因植物優選是雄性不育植物，這樣可以減少去雄的工作。所述植物是成行播種的，而不是混合播種，因為必須能夠用除草劑處理雄性植株，以便能夠清除沒有繼承所述轉基因的植株(50％)。另外，成行播種還能夠區分父本和母本植物的雌穗。
這一方法具有雙重優點——相對沒有母本的培養來說，其生物質量得到極顯著地提高。我們在大田中進行的兩次實驗可以將生物質增加6倍收獲的母本植物的生物質比父本植物的生物質多5倍；
——所述生物質的質量更好，因為用作母本的植物是雜交種，它與父本植物相比具有較高的農業附加值。可將其用作母本植物，玉米雜交種是以使用所述轉基因為目標的。從第二代開始，由此獲得的生物質的質量與僅用父本植物進行的工作相比，更接近于未來的工業生物質。
盡管用兩種方法得到的從父本植物上收獲的轉基因種子的比例為75％(轉基因植物本身或雜合型培養)。從母本植物上收獲的種子僅有50％是轉基因的。為了彌補這一缺陷，我們提出讓一種能產生能夠在收獲后進行商業篩選的表型形狀的基因與感興趣的轉基因組合。這是本發明的第三部分。就是說，例如，通過改變負責某種色素生物合成的酶，可以改變玉米種子的顏色。我們自己業已證實，通過混合具有不同顏色的玉米可以有效的，并且以極低的代價進行商業篩選。在經過判斷之后，可以通過商業篩選儀用1-2次傳代獲得純度超過95％的批量種子。考慮到所使用的儀器，所述篩選可以沒有任何困難地進行，并且以極低的成本進行，能生產幾噸重的種子。該方法如下文所述在經過雜交類型的培養之后，可以單獨收獲父本和母本植物[有遺漏]，然后通過表型性質篩選。隨后的生產完全是轉基因的。
以上結果在表1中給出，其中，可以看出的是相對常規技術而言，使用本發明可以獲得高出65倍的生物質，而質量也高出1.33倍。“質量”一詞在本文中是指收獲的生物質中轉基因種子所占的比例。而這樣做所付出的額外代價很小，并且額外的時間也很短，因為它在總共52周的時間中大約只占3周(不采用本發明時是49周)。
如果不需要在感興趣的基因上增加一個能產生特殊表現型的基因的話，僅采用本發明的前兩部分就足夠了。在這種情況下，所獲得的生物質比常規技術多120倍；1/6的生物質的質量就與常規技術的相同，除此之外，有20倍的數量，對于5/6的生物質來說，其質量低于1/3。
在表1中，所給出的數值是平均值，它被作為比較兩種技術的相對值。數量玉米種子數。質量轉基因種子的對照比例。就遺傳性或背景而言，所述雜交種產生的種子比父本轉基因植物更接近于工業體系。
表權利要求
1.增加轉基因植物生物質的方法，其特征在于它包括以下步驟(a)繁殖植物愈傷組織，該愈傷組織含有一個感興趣的遺傳轉化事件，并且能夠再生；(b)可選地選擇至少含有一個感興趣的遺傳轉化事件的愈傷組織；(c)由所述愈傷組織再生完整的轉基因植株，稱之為原始轉化體或T0植株；(d)用非轉基因花粉給所述原始轉化體授粉；(e)收獲所得到的種子，稱之為T1，它里面至少整合了一個感興趣的轉基因；(f)播種所述轉基因T1種子，并通過自花授粉或自由授粉形式讓所產生的植株授粉；(g)收獲T2種子。
2.如權利要求1的方法，其特征在于它還包括一個對T2種子實施收獲后表型篩選的額外步驟。
3.如權利要求2的方法，其特征在于所述篩選是對源于僅被用作母本的植物的T2種子進行的。
4.如上述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述轉基因T2種子的顏色表型不同于非轉基因種子。
5.如上述權利要求中任一項的方法，其特征在于源于被用作父本植物和被用作母本植物的植物的T2種子是彼此分開收獲的。
6.如上述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述植物是異花授粉植物。
7.如上述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述植物是玉米。
8.如上述權利要求中任一項的方法，其特征在于在用非轉基因花粉授粉之前對所述原始轉化體進行割穗或去雄。
9.如上述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述繁殖步驟包括產生每一個遺傳轉化事件的幾十個，優選大約20個拷貝的植物。
10.如上述權利要求中任一項的方法，其特征在于播種所述轉基因T1種子，培養并用作父本植物。
11.如權利要求10的方法，其特征在于所述轉基因T1種子是優選以4/2或6/2的比例與用作母本植物的非轉基因植物成行的相間播種的。
12.如權利要求11的方法，其特征在于所述母本非轉基因植物是雄性不育植物。
13.如權利要求11的方法，其特征在于所述母本非轉基因植物是去過雄的。
14.如上述權利要求11-13中任一項的方法，其特征在于所述母本植物與父本植物相比具有較高的農藝價值。
全文摘要
本發明涉及一種快速提高轉基因生物質數量和質量的方法,特別是用于生產能產生具有治療用途的重組蛋白的轉基因植物,特別適用于玉米。
文檔編號A01H1/04GK1338896SQ00803478
公開日2002年3月6日 申請日期2000年10月10日 優先權日1999年10月12日
發明者P·布爾納特 申請人:默里斯坦治療公司