專利名稱：菊苣轉基因植株的擴繁方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及的是一種菊苣轉基因植株的擴繁方法。
背景技術：
菊苣(Cichorium intybus )為菊科菊苣屬多年生草本植物。菊苣不僅是高產優質的飼用作物，又具藥用、食用和蜜源用等多方面的開發潛力。菊苣根系含有豐富倍半萜內酯、糖苷、香豆素、黃酮類、花青甙、細胞激肽類和有機酸等物質，具有清肝利膽，防病抗癌的功效。根中提取的苦味物質可作為咖啡的代用品，肉質根上長出的嫩芽可作為蔬菜食用，其肉質根加工而成的保健食品出口韓國、日本等地很受歡迎，藍色的花冠具有一定的觀賞價值，是一種大力推廣的新興多用途經濟植物，倍受國內外學者的重視。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種菊苣轉基因植株的擴繁方法。本發明的技術方案如下一種菊苣轉基因植株的擴繁方法，包括以下步驟:Al、農桿菌介導的轉zeolin基因的菊苣植株的檢測采用CTAB法提取轉基因菊苣基因組DNA，以含有外源目的基因zeolin的質粒DNA做陽性對照，未轉化菊苣植株DNA及ddH20做陰性對照,利用設計的引物進行PCR擴增和Southern雜交檢測，選取陽性的菊苣轉基因植株，再用改良SDS法提取RNA,進行RT-PCR檢測，選取都為陽性的轉基因菊苣作為后續材料；A2、轉基因植株葉片滅菌選取步驟Al檢測為陽性的轉基因菊苣葉片，先采用自來水沖洗，在超凈工作臺上用O. IffigCl2浸泡葉片8-10min，期間不停搖動，無菌水反復沖洗4-5遍，無菌濾紙吸干多余水分；A3、轉基因菊苣芽的誘導與增殖用無菌刀片將滅菌后的菊苣葉片切成O. 5X0. 5cm，葉片近軸面向下，接種在含25mg/L潮霉素、2. Omg/L 6_BA、0. 2mg/L IBA、O. O lmg/L TDZ的芽誘導培養基上誘導分化出不定芽綠點，將小芽點接種到含有15mg/L潮霉素、2. Omg/L 6-BA、0. 2mg/L IBA的芽增殖培養基上形成大量叢生芽；所述芽誘導培養基MS基本培養基+25mg/LHyg+2. 0mg/L 6-BA+O. 2mg/LΙΒΑ+0. 0lmg/L TDZ+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂，pH 5. 8 6. 0 ;芽增殖培養基MS基本培養基 +15mg/L Hyg+2. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L IBA+30g/L鹿糖+8g/L瓊脂，pH 5. 8 6. 0 ;A4、轉基因菊苣芽生根待叢生芽長到2-3cm時，小心將芽剝離葉片基部，接種到含有10mg/LHyg和0. lmg/L NAA的生根培養基上進行生根培養；所述生根培養基1/2MS培養基+10mg/LHyg+0·lmg/L NAA+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH 值 5· 8 6· O ;Α5、轉基因菊苣再生植株的PCR檢測在無菌操作臺上，從玻璃瓶中取出生根20天左右的轉基因擴繁菊苣，剪取葉片1-2片，放于PCR管，液氮保存，小量提取DNA，進行PCR檢測，將陽性的再生植株重新轉入新的1/2MS培養基中繼續培養至煉苗；A6、轉基因菊苣擴繁植株的煉苗和移栽對步驟A5檢測為陽性的再生植株進行煉苗和移栽，具體煉苗方法為首先在培養室中將封口膜或瓶蓋打開，適應1-2天，在培養容器內注入清水，溫室中煉苗2-3d，然后取出小植株，小心洗凈根部的培養基，移栽到裝有滅菌基質的花盆中，于溫室煉苗5d后移到室外常規培養，每2天噴施1/2MS鹽溶液；植株煉苗后移栽到田間，成活的植株即為擴繁的帶有外源目的基因的轉基因植株。菊苣常規農桿菌遺傳轉化效率較低，最高的達到百分之十幾，最低的只有百分之幾，通過常規遺傳轉化得到轉基因菊苣植株的量很少，且假陽性率高，轉化的工作量很大，利用轉基因菊苣葉片作為外植體進行擴殖，省去了遺傳轉化的繁瑣步驟，可以在短時間內得到大量含有目的外源基因的陽性轉基因菊苣植株。本發明以轉基因菊苣葉片為外植體進行擴繁，分化率達90%以上，每個幼葉外植 體平均可分化出18. 69個不定芽，不定芽易于生根，生根率到90%以上，在芽分化、芽繁殖和生根階段，都通過不同濃度的潮霉素篩選，PCR檢測再生植株陽性率高達85. 54%，是常規遺傳轉化率的7-8倍，煉苗移栽后平均成活率達97%以上。通過該技術，一株轉基因菊苣，經離體擴繁2個月可產生上千株轉基因陽性組培苗。與常規遺傳轉化獲得轉基因植株相比，該技術培養周期短，程序簡單，擴繁系數高，成本低，對菊苣重要農藝性狀影響小，產生的后代目的基因遺傳穩定，可實現轉基因菊苣的快速和大規模培育，也為菊苣基因工程和菊苣遺傳改良奠定了基礎。


圖I為轉基因菊苣在篩選培養基上分化形成的芽點；圖2為轉基因菊苣擴繁中芽的增殖；圖3為轉基因菊苣擴繁植株生根培養；圖4為轉基因菊苣擴繁生根后的試管苗；圖5為轉zeolin基因菊苣再生擴繁后的PCR電泳檢測；注M: DL 2000 DNAmarker;P: pCB-zeolin (陽性對照的質粒)；CK:陰性對照(非轉基因菊苣)；I 6轉基因
菊苣；圖6為轉基因菊苣擴繁植株煉苗后成活的植株；圖7為轉基因菊苣擴繁植株田間表現。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。轉zeolin基因菊苣植株獲得的方法為常規方法，簡述如下采用菊苣葉片為外植體，外植體預培養2d，用0D600=0. 4Abs的農桿菌菌液侵染IOmin,，過2- 3d的共培養和1_2d的恢復培養后將轉化后的外植體接種在含適量抑菌劑頭孢和篩選劑潮霉素的培養基上進行篩選、抗性芽的再生和增殖，再進行生根培養、煉苗、移栽和檢測，最后得到轉zeolin基因的菊苣植株。菊苣轉基因植株的擴繁方法
(I)農桿菌介導的轉zeolin基因的菊苣植株的檢測。采用CTAB法提取轉基因菊苣基因組DNA，以含有外源目的基因zeolin的質粒DNA做陽性對照，未轉化菊苣植株DNA及ddH20做陰性對照，利用設計的弓I物進行PCR擴增和Southern雜交檢測，選取陽性的菊苣轉基因植株，再用改良SDS法提取RNA，進行RT-PCR檢測，選取都為陽性的轉基因菊苣作為后續材料。(2)轉基因植株葉片滅菌。選取第一步檢測為陽性的轉基因菊苣葉片，先采用自來水沖洗，在超凈工作臺上用O. IffigCl2浸泡葉片8-10min，期間不停搖動，無菌水反復沖洗4-5遍，無菌濾紙吸干多余水分。(3)轉基因菊苣芽的誘導與增殖。用無菌刀片將滅菌后的菊苣葉片切成O. 5X0. 5cm，葉片近軸面向下，接種在含25mg/L潮霉素、2. Omg/L 6_BA、0. 2mg/L IBA、 O. O lmg/L TDZ的芽誘導培養基上誘導分化出不定芽綠點，如圖I所示，由圖I可以看出，轉基因菊苣的一個外植體能分化形成許多不定芽的綠點，統計分析其分化率達到90%以上。將小芽點接種到含有151^/1潮霉素、2.011^/1 6-BA.0. 2mg/L IBA的芽增殖培養基上形成大量叢生芽，如圖2所示，由圖2看出一個外植體可以形成大量叢生芽，統計得出每個外植體平均可以形成18. 69個不定芽，最多的可以形成41個叢生芽。所述芽誘導培養基MS基本培養基+25mg/LHyg+2. Omg/L 6-BA+O. 2mg/LΙΒΑ+0. 0lmg/L TDZ+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂，pH 5. 8 6. 0。芽增殖培養基MS基本培養基 +15mg/LHyg+2. 0mg/L 6-BA+O. 2mg/L IBA+30g/L 蔗糖+8g/L 瓊脂，pH 5.8 6.0。(4)轉基因菊苣芽生根。待叢生芽長到2-3cm時，小心將芽剝離葉片基部，接種到含有10mg/LHyg和0. lmg/L NAA的生根培養基上進行生根培養，2周后產生大量根，如圖3所示，從圖3可以看出不定芽易于生根，長勢良好，統計分析生根率到90%以上。所述生根培養基1/2MS培養基+lOmg/LHyg+O.lmg/L NAA+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH 值 5· 8 6· O。(5)轉基因菊苣再生植株的PCR檢測。在無菌操作臺上，從玻璃瓶中取出生根20天左右的轉基因擴繁菊苣(圖4所示)，剪取葉片1-2片，放于PCR管，液氮保存，小量提取DNA，進行PCR檢測，如圖5所示，圖5可以看出，PCR檢測的大部分擴繁植株都為陽性，統計分析PCR檢測再生植株陽性率高達85. 54%，是常規遺傳轉化率的7-8倍。將陽性的再生植株重新轉入新的1/2MS培養基中繼續培養至煉苗。(6)轉基因菊苣擴繁植株的煉苗和移栽。對第5步檢測為陽性的再生植株進行煉苗和移栽，具體煉苗方法為首先在培養室中將封口膜或瓶蓋打開，適應1-2天，在培養容器內注入清水，溫室中煉苗2-3d，然后取出小植株，小心洗凈根部的培養基，移栽到裝有滅菌基質(沙、土壤和蛭石)的花盆中，于溫室煉苗5d后移到室外常規培養，每2天噴施1/2MS鹽溶液，如圖6所示，圖6可以看出，植株煉苗后成活率高，長勢良好。植株煉苗后移栽到田間，成活的植株即為擴繁的帶有外源目的基因的轉基因植株，如圖7所示，圖7看出，擴繁的植株在田間移栽成活后長勢良好，植株平均成活率達到97%以上。應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.ー種菊苣轉基因植株的擴繁方法，其特征在于，包括以下步驟A1、農桿菌介導的轉zeolin基因的菊苣植株的檢測采用CTAB法提取轉基因菊苣基因組DNA，以含有外源目的基因zeolin的質粒DNA做陽性對照，未轉化菊苣植株DNA及ddH20做陰性對照，利用設計的引物進行PCR擴增和Southern雜交檢測，選取陽性的菊苣轉基因植株，再用改良SDS法提取RNA，進行RT-PCR檢測，選取都為陽性的轉基因菊苣作為后續材料； A2、轉基因植株葉片滅菌選取步驟Al檢測為陽性的轉基因菊苣葉片，先采用自來水沖洗，在超凈工作臺上用0. l%HgC12浸泡葉片8-10min，期間不停搖動，無菌水反復沖洗4_5遍，無菌濾紙吸干多余水分； A3、轉基因菊苣芽的誘導與増殖用無菌刀片將滅菌后的菊苣葉片切成0. 5X0. 5cm,葉片近軸面向下，接種在含25mg/L潮霉素、2. Omg/L 6_BA、0. 2mg/L IBA、0. Olmg/L TDZ的芽誘導培養基上誘導分化出不定芽綠點，將小芽點接種到含有15mg/L潮霉素、2. Omg/L6-BA、0. 2mg/L IBA的芽增殖培養基上形成大量叢生芽； 所述芽誘導培養基MS 基本培養基+25mg/LHyg+2. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L IBA+0. Olmg/L TDZ+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂，pH 5. 8 6. 0 ; 芽增殖培養基MS 基本培養基+15mg/L Hyg+2. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L IBA+30g/L 蔗糖+8g/L 瓊脂，pH 5. 8 6. 0 ; A4、轉基因菊苣芽生根待叢生芽長到2-3cm吋，小心將芽剝離葉片基部，接種到含有10mg/LHyg和0. lmg/L NAA的生根培養基上進行生根培養； 所述生根培養基1/2MS培養基+10mg/LHyg+0. lmg/L NAA+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH值 5. 8 6. 0 ; A5、轉基因菊苣再生植株的PCR檢測在無菌操作臺上，從玻璃瓶中取出生根20天左右的轉基因擴繁菊苣，剪取葉片1-2片，放于PCR管，液氮保存，小量提取DNA，進行PCR檢測，將陽性的再生植株重新轉入新的1/2MS培養基中繼續培養至煉苗； A6、轉基因菊苣擴繁植株的煉苗和移栽對步驟A5檢測為陽性的再生植株進行煉苗和移栽，具體煉苗方法為首先在培養室中將封ロ膜或瓶蓋打開，適應1-2天，在培養容器內注入清水，溫室中煉苗2-3d，然后取出小植株，小心洗凈根部的培養基，移栽到裝有滅菌基質的花盆中，于溫室煉苗5d后移到室外常規培養，每2天噴施1/2MS鹽溶液；植株煉苗后移栽到田間，成活的植株即為擴繁的帶有外源目的基因的轉基因植株。
全文摘要
本發明公開了一種菊苣轉基因植株的擴繁方法，包括以下步驟A1、農桿菌介導的轉zeolin基因的菊苣植株的檢測； A2、 轉基因植株葉片滅菌；A3、轉基因菊苣芽的誘導與增殖；A4、轉基因菊苣芽生根； A5、轉基因菊苣再生植株的PCR檢測；A6、轉基因菊苣擴繁植株的煉苗和移栽。本發明以轉基因菊苣葉片為外植體進行擴繁，分化率達90%以上，每個幼葉外植體平均可分化出18.69個不定芽，不定芽易于生根，生根率到90%以上，在芽分化、芽繁殖和生根階段，都通過不同濃度的潮霉素篩選，PCR檢測再生植株陽性率高達85.54%，是常規遺傳轉化率的7-8倍，煉苗移栽后平均成活率達97%以上。
文檔編號C12Q1/68GK102771396SQ20121028875
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月14日 優先權日2012年8月14日
發明者張玉, 方鵬飛, 李達旭, 白史且, 鄧永昌 申請人:四川省草原科學研究院