專利名稱：一種建立草地早熟禾基因轉化體系的方法
技術領域：
本發明涉及農業生物技術領域或植物基因工程領域，更具體地說，本發明涉及一種建立草地早熟禾基因轉化體系的方法，包括滅菌和萌發，胚性愈傷組織誘導繼代分化培養和小苗生根及試管苗移栽等步驟；應用該方轉化體系在建立轉基因抗旱草地早熟禾中的用途和應用該轉化體系得到的轉基因抗旱草地早熟禾。
國內外早熟禾轉化體系雖有報道，但大多體系轉化效率較低。1999年復旦大學馬忠華等將抗除草劑基因轉入草地早熟禾其愈傷組織誘導頻率為89.0％，再生頻率為50.0％(復旦大學學報，38卷第5期1999)。韓國東國大學LEE，Jae Sin(Korean J.Plant Tissue Culture，2001)等做了Kentucky Blue胚性愈傷組織的誘導和分化的工作，其方法較復雜且重復性差。
七十年代末轉基因技術飛速的發展起來，至今相繼通過農桿菌，基因槍，PEG，電擊法，激光離子束等方法都得到了轉化的植物細胞。Sanford等于1987年用基因槍轟擊法轉化洋蔥表皮細胞獲得成功。此后基因槍轟擊法得到廣泛的應用，該方法受體廣泛，可以是外植體(幼穗、幼胚或成熟胚)、愈傷組織或懸浮細胞等，操作相對簡單，效果較好。1999年復旦大學馬忠華等應用此方法將抗除草劑基因PPT轉入草地早熟禾。但該方法成本高，轉化頻率欠佳，轉基因后代發生基因沉默的頻率高。
農桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，1907年人們發現它是植物致瘤的起因，植物細胞被侵染后，形成腫瘤。能夠誘發冠癭瘤的稱為根癌農桿菌，誘導毛發狀根的稱為發根農桿菌。受感染的細胞可產生正常細胞所不能產生的生物堿-冠癭堿，被農桿菌利用作為碳源和氮源。經過持續不斷的基礎研究，直到1974年，發現在根癌和發根農桿菌中分別有一種環型的Ti或Ri質粒，質粒上的一段T-DNA(轉移DNA)包含有生長素基因和細胞分裂素基因，它可以插入植物基因組從而引起細胞特性的變化。由于T-DNA能夠進行高頻率轉移，而且Ti質粒上可插入大到50kb的外源DNA，因此可以利用這種天然的遺傳轉化體系，將外源DNA轉移到植物細胞，并利用植物細胞的全能性，經過細胞或組織培養，由一個轉化細胞再生成完整的轉基因植物。在迄今發展起來的轉基因技術中，農桿菌介導的遺傳轉化占據主導地位，應用最為廣泛，特別是在雙子葉植物上尤其普遍。近幾年來農桿菌轉化在水稻等谷類作物上取得成功，其應用范圍將進一步擴大。農桿菌介導的優點是轉化頻率高，可轉移較大的DNA片段，所轉移DNA很明確地為T-DNA左右邊界之間的序列，并可直接用不同的植物組織進行基因轉移，不需要原生質體培養再生植株的技術，從而縮短轉育周期。
本發明的目的是提供一套建立草地早熟禾轉基因轉化體系的方法，它可有效地克服草地早熟禾基因型的制約，而從絕大多數基因型的培養細胞再生出轉基因植株，且誘導和再生頻率高，再生植株性狀變異小，取材不受季節限制。
因此，在本發明的一方面，提供了一種建立草地早熟禾基因轉化體系的方法，包括滅菌和萌發，胚性愈傷組織誘導繼代分化培養和小苗生根及試管苗移栽等步驟。
在本發明的另一方面，提供了一種上述草地早熟禾轉化體系在建立轉基因抗旱草地早熟禾中的用途。
在本發明的另一方面，提供了一種轉基因抗旱草地早熟禾，其是通過應用該草地早熟禾轉化體系而得到的。
另外，需要指出的是，在本申請說明書的上下文的公開內容的基礎上，本發明的其它具有實質性特點的方面和其它具有創造性的有益效果對本領域的普通技術人員來說是顯而易見的。
圖2是本發明的愈傷組織分化成苗的照片。
圖3是本發明的轉基因植株的總DNA的PCR產物電泳照片，其中A陽性植株，B陰性植株，C質粒。
圖4是本發明的PCR檢測為陽性的轉基因植株的DNA的Southern Blot結果的照片，其中A質粒，B陽性植株，C陰性植株。
以上相關培養中采用的培養基包括基本培養基MS培養基、愈傷組織誘導培養基、分化培養基、生根培養基、壯苗培養基。
基本培養基為MS培養基KNO31900mg/l，NH4NO31650mg/l，CaCl2·2H2O440mg/l，MgSO4·7H2O370mg/l，KH2PO4170mg/l，KI0.83mg/l，H3BO36.2mg/l，MnSO4·4H2O22.3mg/l，ZnSO4·7H2O8.6mg/l，Na2MoO4·2H2O0.25mg/l，CoCl2·6H2O0.025mg/l，Na2-EDTA37.3mg/l，FeSO4·7H2O27.8mg/l，CuSO4·5H2O0.025mg/l，蔗糖30g/l，肌醇100mg/l，煙酸0.5mg/l，鹽酸吡哆醇0.5mg/l，甘氨酸2.0mg/l，鹽酸硫銨等0.4mg/l，卡拉膠6g/l，ph＝5.8。
愈傷組織誘導培養基是指基本培養基附加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1-5mg/l用于誘導胚性愈傷組織。
分化培養基是指基本培養基附加激動素(KT)1-3mg/l，用于促使愈傷組織分化出苗。
生根培養基是指基本培養基附加吲哚丁酸(IBA)0.1-0.2mg/l用于促進小苗生根。
壯苗培養基是指基本培養基的大量元素(KNO3，NH4NO3，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，KH2PO4)減半，其它成分不變，用來使試管苗強壯。
滅菌和萌發技術是指將草地早熟禾種子用紗布包好放入70％的乙醇溶液浸泡30秒，取出放入0.1％氯化汞溶液中消毒5-15分鐘，然后用無菌水沖洗3遍，其中第一遍和第二遍要快速振蕩沖洗以除去大部分殘留的氯化汞，第三遍要將種子浸泡在無菌水中5-15分鐘左右，這樣才能徹底清除殘留的氯化汞，避免種子發芽點受損影響發芽率。通過在MS基本培養基上進行發芽實驗，得到的結果是經過這種嚴格的滅菌和沖洗污染率為0.001％，發芽率高達90.4％。
愈傷組織誘導繼代分化技術是指將消毒后的種子接入愈傷組織誘導培養基上，暗培養，20天左右從種子根部膨大出白或淡黃色的愈傷組織，直徑約為1-2mm。每20天用愈傷組織誘導培養基繼代培養一次，注意培養基中不能有多余的水，如果有，應用無菌濾紙將水分吸干，以保持培養基表面干燥，否則易形成粘液化的愈傷組織，這種愈傷組織難以分化。在此后的60天中愈傷組織外表逐漸干燥并變成致密的黃色顆粒狀，用鑷子將其壓碎后可見葡萄狀排列的直徑0.2-0.5mm的小顆粒，這種狀態的愈傷組織為胚性愈傷組織。一般在此時進行轉基因。將轉基因的胚性愈傷組織接入到愈傷組織分化培養基上，25℃光照培養10-20天左右愈傷組織上出現綠色芽點，并進而分化出小芽，本發明中愈傷組織誘導率為91％(本發明中愈傷組織誘導率＝愈傷組織數/接種種子數)，分化率約為80％(本發明中愈傷組織分化率＝出現綠色芽點的愈傷組織數/接種的愈傷組織數)。
小苗生根技術是指將分化出來小芽的愈傷組織切成小塊，每塊愈傷組織上有2-3個芽，接入生根培養基中。光照培養2000-3000LX，14-20小時/天。三周左右大部分小苗開始生根，未生根的小苗將根部切傷接入新的生根培養基中，大部分會生根。
試管苗移栽技術是指的是根長到2-3cm時，接入壯苗培養基中培養至出現3-4個分蘗，洗去培養基后，移栽到以蛭石為栽培介質的花盆中，植株在自然光下生長，日溫22-28℃夜溫15-21℃，隔天澆灌1/2MS培養基無機鹽成分KNO3，NH4NO3，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，KH2PO4。生長2周左右，移植苗產生發達根系，然后定植于田間。
以上所限定的早熟禾轉基因轉化體系可選用基因槍轟擊法、農桿菌介導法進行遺傳轉化，通過篩選獲得轉基因細胞進而再生出轉基因植株。
本發明利用草地早熟禾轉基因轉化體系進行轉基因的應用(一)以農桿菌為中介進行遺傳轉化將帶有雙元載體(Ti質粒帶有卡那霉素抗性基因)的根癌農桿菌(如LB4404，EHA101)在附加抗生素卡那霉素150mg/l，利福平20mg/l的YEP培養基(每升培養基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物10g NaCl10g pH7.0，熱壓滅菌)中28℃下震蕩培養，震蕩速率為110轉/分，使其處于對數生長期。用MS培養基稀釋5-10倍，添加乙?；∠阃?0-200μmol/l，用于轉化。
取在愈傷組織誘導培養基培養60天左右的胚性愈傷組織放入含乙?；∠阃?00mg/l的農桿菌菌液(OD值0.5)中浸染10-60分鐘。
浸染后的愈傷組織用無菌濾紙吸干，置于基本培養基上黑暗恢復培養2天。
將愈傷組織轉入附加頭孢霉素250mg/l的愈傷組織分化培養基上，抑制細菌生長。將抑菌后的愈傷組織轉入加有卡那霉素(150mg/l)的愈傷組織分化培養基上，每2周繼代一次，選擇存活材料轉移。篩選3代后只有少數存活。將其轉入無選擇劑的愈傷組織分化培養基中，長出健壯小苗。
小苗長到3-4片葉子時轉入生根培養基中生根，根系發達后的植株移栽到花盆成活后，取葉片進行分子生物學檢測確定轉基因植株。
(二)采用基因槍轟擊法轉化愈傷組織1、DNA包裹微彈和基因槍轟擊(1)從宿主中提取帶有目的基因的質粒，提取和純化采用標準程序和方法(參見《分子克隆》第二版)。質粒質量為OD260 1.7-1.8之間。質粒DNA濃度稀釋為1μg/μl，于-20℃保存備用。
(2)60mg鎢粉放在離心管中加無水乙醇，用超聲波粉碎機超聲至手感溫度發燙。
(3)離心，棄掉上清液。加1ml無水乙醇，旋渦振蕩3-5分鐘。靜置1分鐘。離心棄掉上清液。
(4)加入1ml消毒蒸餾水，旋渦振蕩，離心沉淀，棄盡上清液(重復3次)。
(5)在沉淀的鎢粉中加入50％的甘油，濃度為60mg/ml。
(6)振蕩在50％甘油中的鎢粉，使之成為懸浮液。取50μl懸浮液于離心管中(可打6槍)。
(7)取一個小管在液體上的壁處加入5-10μl質粒DNA(濃度為lμg/μl)振蕩30秒，再在小管壁上加入20μl亞精胺(0.1M)，振蕩30秒邊振蕩邊加入50μl旋渦振蕩30秒-1分鐘，靜置一分鐘，離心沉淀，棄掉上清液。加入150μl 70％乙醇吹打沉淀使沉淀均勻分開，離心(3000轉10秒)，去掉上清加入150μl無水乙醇，不破壞沉淀，靜置1分鐘，棄上清液。
(8)加入60μl無水乙醇振蕩使其成懸浮液，加樣器取樣10μl分別滴在鋼膜上，制成子彈。
用基因槍轟擊愈傷組織，每皿轟擊一次轟擊參數可裂膜與載體距離2.5cm，載體與阻擋網的距離為0.8cm，微彈飛行距離7cm，其他參數見寧波新芝科器研究所產品型號為GJ-1000的說明書。
2、轉化后材料的篩選和培養(1)轟擊后的材料在黑暗中恢復培養2-3天，然后將材料轉入成分相同的新培養基中培養3周以使轉入的基因表達。
(2)將愈傷組織轉入加有卡那霉素的愈傷組織分化培養基上，每2周繼代一次，選擇存活材料轉移。篩選3代后只有少數存活。將其轉入無選擇劑的愈傷組織分化培養基中，長出健壯小苗。
小苗長到3-4片葉子時轉入生根培養基中生根，根系發達后的植株移栽到花盆成活后，取葉片進行分子生物學檢測確定轉基因植株。
本發明農桿菌轉染法基本同石田(Ishida)等報道的(Nat Biotechnol.1996 Jun；14(6)745-50)。在轉染液添加乙酰基丁香酮，浸染10-60分鐘。要在黑暗中進行恢復培養，然后才能進行篩選。
本發明中基因槍轟擊法(particle bombardment)是借助高速度的金屬微粒將核酸分子引入活細胞的一種遺傳轉化技術。本發明所用的基因槍為寧波新芝科器研究所產品，型號為GJ-1000。除特殊說明外操作參數基本同本儀器說明書。
本發明中胚性愈傷組織是指愈傷組織生長到一定階段所形成的易分化狀態，草地早熟禾的愈傷組織為淡黃或黃色，表面呈顆粒狀突起。胚性愈傷組織轉入分化培養基能再生出大量植株。
本發明所提供的草地早熟禾轉化體系高效可靠，可重復性強，具有廣泛的應用前景，是利用基因改造草地早熟禾的關鍵技術。
下面結合具體的制備實施例和生物學效果實施例，并參照附圖進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
2.轉化草地早熟禾草地早熟禾種子用紗布包好放入70％的乙醇溶液浸泡30秒，取出放入0.1％氯化汞溶液中消毒5-15分鐘，然后用無菌水振蕩沖洗3-6遍。將消毒后的種子接入愈傷組織誘導培養基上，暗培養，20天左右從種子根部膨大出白或淡黃色的愈傷組織(見


圖1)。每20天用愈傷組織誘導培養基繼代培養一次，得到胚性愈傷組織。接入種子200粒得到愈傷組織182塊，愈傷組織誘導率為91％，出現綠色芽點的愈傷組織165塊，分化率約為80％。
3.基因轉化取在愈傷組織誘導培養基培養60天左右的胚性愈傷組織放入含乙?；∠阃?100mg/l)的農桿菌菌液(OD值0.5)中浸染20分鐘。浸染后的愈傷組織用無菌濾紙吸干，置于基本培養基上黑暗恢復培養2天；將愈傷組織轉入附加頭孢霉素250mg/l的愈傷組織分化培養基上，抑制細菌生長。將抑菌后的愈傷組織轉入加有卡那霉素(150mg/l)的愈傷組織分化培養基上，每2周繼代一次，選擇存活材料轉移。
4.轉基因苗的獲得篩選3代后只有少數存活。將其轉入無卡那霉素的愈傷組織分化培養基中，長出健壯小苗(見圖2)。小苗長到3-4片葉子時轉入生根培養基中生根，根系發達后的植株移栽到花盆成活后，取葉片進行分子生物學檢測確定轉基因植株。
5.轉基因植株的鑒定提取植物總DNA進行PCR檢測，PCR引物為根據SacB基因設計的兩個引物5’-gatctagAAAGAAACGAACCAAAAGGCCATATAAG，3’-cagtcgaccTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC。
PCR結果參見附圖3。
對PCR檢測為陽性植株的DNA進行適當的內切酶切割、電泳、轉膜，然后進行Southern雜交，雜交探針為同位素標記的卡那霉素抗性NPT II基因(方法見《分子克隆(二)》)。Southern雜交顯示陽性信號者(參見附圖4)，被確定為轉基因植株。其中檢測30株顯示陽性12株信號，轉化頻率40％。
轉基因植株植入大田繁殖，由于草地早熟禾屬無融合生殖，所以轉基因植株所得的種子為轉基因種子。
(1)從宿主大腸桿菌E.coli DH5α中提取帶有SacB的質粒pKP，提取和純化采用標準程序和方法(參見《分子克隆》第二版)。質粒質量為OD2601.7-1.8之間。質粒DNA濃度稀釋為1μg/μl，于-20℃保存備用。
(2)60mg鎢粉放在離心管中加無水乙醇，用超聲波粉碎機超聲至手感溫度發燙。
(3)離心，棄掉上清液。加1ml無水乙醇，旋渦振蕩3-5分鐘。靜置1分鐘。離心棄掉上清液。
(4)加入1ml消毒蒸餾水，旋渦振蕩，離心沉淀，棄盡上清液(重復3次)。
(5)在沉淀的鎢粉中加入50％的甘油，濃度為60mg/ml。
(6)振蕩在50％甘油中的鎢粉，使之成為懸浮液。取50μl懸浮液于離心管中(可打6槍)。
(7)取一個小管在液體上的壁處加入5-10μl質粒DNA(濃度為1μg/μl)振蕩30秒，再在小管壁上加入20μl亞精胺(0.1M)，振蕩30秒邊振蕩邊加入50μl旋渦振蕩30秒-1分鐘，靜置一分鐘，離心沉淀，棄掉上清液。加入150μl 70％乙醇吹打沉淀使沉淀均勻分開，離心(3000轉10秒)，去掉上清加入150μl無水乙醇，不破壞沉淀，靜置1分鐘，棄上清液。
(8)加入60μl無水乙醇振蕩使其成懸浮液，加樣器取樣10μl分別滴在鋼膜上，制成子彈。
2、用基因槍轟擊愈傷組織，每皿轟擊一次轟擊參數可裂膜與載體距離2-2.5cm，載體與阻擋網的距離為0.8-1cm，微彈飛行距離7-10cm，其他參數見寧波新芝科器研究所產品型號為GJ-1000的說明書。
3、轉化后材料的篩選和培養(1)轟擊后的材料在MS培養基黑暗中恢復培養2-3天，然后將材料轉入成分相同的新培養基中培養3周以使轉入的基因表達。
(2)將愈傷組織轉入加有卡那霉素150mg/l的愈傷組織分化培養基上，每2周繼代一次，選擇存活材料轉移。篩選3代后只有少數存活。將其轉入無選擇劑的愈傷組織分化培養基中，長出健壯小苗。
小苗長到3-4片葉子時轉入生根培養基中生根，根系發達后的植株移栽到花盆成活后，取葉片進行分子生物學檢測確定轉基因植株。
4.轉基因植株的鑒定提取植物總DNA進行PCR檢測，PCR引物為根據SacB基因設計的兩個引物5’-gatctagAAAGAAACGAACCAAAAGGCCATATAAG，3’-cagtcgaccTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC。
對PCR檢測為陽性植株的DNA進行適當的內切酶切割、電泳、轉膜，然后進行Southern雜交，雜交探針為同位素標記的NPT II基因。Southern雜交顯示陽性信號者，被確定為轉基因植株。檢測50株，顯示陽性19株，轉化效率38％。
權利要求
1.一種建立草地早熟禾基因轉化體系的方法，其特征在于包括以下步驟①滅菌和萌發；②胚性愈傷組織誘導繼代分化培養；和③小苗生根及試管苗移栽技術，并且在相關培養中采用的培養基包括基本培養基MS培養基、愈傷組織誘導培養基、分化培養基、生根培養基、壯苗培養基。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所說的基本培養基為MS培養基KNO31900mg/l，NH4NO31650mg/l，CaCl2·2H2O440mg/l，MgSO4·7H2O370mg/l，KH2PO4170mg/l，KI0.83mg/l，H3BO36.2mg/l，MnSO4·4H2O22.3mg/l，ZnSO4·7H2O8.6mg/l，Na2MoO4·2H2O0.25mg/l，CoCl2·6H2O0.025mg/l，Na2-EDTA37.3mg/l，FeSO4·7H2O27.8mg/l，CuSO4·5H2O0.025mg/l，蔗糖30g/l肌醇100mg/l，煙酸0.5mg/l，鹽酸吡哆醇0.5mg/l，甘氨酸2.0mg/l，鹽酸硫銨等0.4mg/l，卡拉膠6g/l，ph＝5.8；愈傷組織誘導培養基是指基本培養基附加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1-5mg/l；分化培養基是指基本培養基附加激動素(KT)1-3mg/l；生根培養基是指基本培養基附加吲哚丁酸(IBA)0.1-0.2mg/l；壯苗培養基是指基本培養基的大量元素KNO3，NH4NO3，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，KH2PO4減半，其它成分不變。
3.根據權利要求1或者2所述的方法，其中所說的滅菌和萌發步驟包括將草地早熟禾種子用紗布包好放入70％的乙醇溶液浸泡30秒，取出放入0.1％氯化汞溶液中消毒5-15分鐘，然后用無菌水振蕩沖洗3-6遍。
4.根據權利要求l或者2所述的方法，其中所說的愈傷組織誘導繼代分化步驟包括將消毒后的種子接入愈傷組織誘導培養基上，暗培養，20天左右從種子根部膨大出白或淡黃色的愈傷組織，每20天用愈傷組織誘導培養基繼代培養一次，60天左右愈傷組織外表逐漸干燥并變成致密的黃色顆粒狀，為胚性愈傷組織，一般在此時進行轉基因，并且將得到的胚性愈傷組織接入到愈傷組織分化培養基上，25℃光照培養10-20天左右從愈傷組織上分化出芽基，并進而分化出小芽。
5.根據權利要求1或者2所述的方法，其中所說的小苗生根步驟包括將分化出來小芽的愈傷組織切成小塊，每塊2-3個芽，接入生根培養基中，光照培養2000-3000LX，14-20小時/天，三周左右大部分小苗開始生根，未生根的小苗將根部切傷接入新的生根培養基中，大部分會生根。
6.根據權利要求1或者2所述的方法，其中所說的試管苗移栽步驟包括根長到2-3cm時，接入壯苗培養基中培養至出現3-4個分蘗，洗去培養基后，移栽到以蛭石為栽培介質的花盆中，植株在自然光下生長，日溫22-28℃夜溫15-21℃，隔天澆灌1/2MS培養基無機鹽成分(KNO3，NH4NO3，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，KH2PO4)，生長2周左右，移植苗產生發達根系，然后定植于田間。
7.權利要求1-6中任何一項的方法，其中所述的草地早熟禾基因轉化體系通過選自基因槍或者農桿菌法進行遺傳轉化，并通過加壓篩選得到轉基因胚性愈傷組織，進而再生出轉基因植株。
8.根據權利要求1-6中任何一項的方法，其中所說的胚性愈傷組織是指愈傷組織生長到一定階段所形成的易分化狀態，草地早熟禾的愈傷組織為淡黃或黃色，表面呈顆粒狀突起，并且胚性愈傷組織轉入分化培養基能再生出大量植株。
9.一種草地早熟禾轉化體系，其是由權利要求1-8中任何一項的方法所建立的。
10.權利要求9的草地早熟禾轉化體系在建立轉基因抗旱草地早熟禾中的用途。
11.一種轉基因抗旱草地早熟禾，其是通過應用權利要求9的草地早熟禾轉化體系或者權利要求1-8中任何一項的方法而得到的。
12.權利要求11的轉基因抗旱草地早熟禾，其中轉入了含有SacB基因的質粒pKP。
全文摘要
本發明涉及一種建立草地早熟禾基因轉化體系的方法，包括滅菌和萌發，胚性愈傷組織誘導繼代分化培養和小苗生根及試管苗移栽等步驟；應用該轉化體系在建立轉基因抗旱草地早熟禾中的用途和應用該轉化體系得到的轉基因抗旱草地早熟禾。
文檔編號A01H4/00GK1470160SQ0212683
公開日2004年1月28日 申請日期2002年7月22日 優先權日2002年7月22日
發明者胡贊民, 陳宇紅, 孫明杰, 盛立, 朱詩忠, 張紅梅, 章銀梅, 陳正華 申請人:北京春雨林業技術研究所, 中國科學院遺傳與發育生物學研究所