專利名稱：大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程領(lǐng)域的方法，具體是一種大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn) 化方法。
背景技術(shù)：
大豆是當(dāng)今世界上第五大作物，僅次于小麥、水稻、玉米和大麥。我國(guó)既是大豆生 產(chǎn)大國(guó)，也是消費(fèi)大國(guó)，每年都要進(jìn)口大量轉(zhuǎn)基因大豆。與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)大豆科技水 平相對(duì)落后，大豆品質(zhì)缺乏國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因大豆的自主研究和利用，是我國(guó)今后在 大豆產(chǎn)業(yè)應(yīng)該堅(jiān)持的發(fā)展方向。目前制約我國(guó)大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展的主要因素是， 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)、下胚軸，愈傷組織等轉(zhuǎn)基因受體植株再生系統(tǒng)的不完善，多數(shù)再 生植株畸形，不能伸長(zhǎng)、生根，最后死亡，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因效率低下。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，王萍等在《大豆科學(xué)》上發(fā)表了 “基因槍法將 GmDREB基因?qū)氪蠖沟难芯俊保@得了 4個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子。該文章中使用的轉(zhuǎn)基因受體為體細(xì) 胞胚。體細(xì)胞胚誘導(dǎo)受基因型的限制，目前只有少數(shù)幾個(gè)品種誘導(dǎo)成功。另外體細(xì)胞胚的 植株再生頻率也很低，所以轉(zhuǎn)化效率很低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化方 法，以數(shù)量足夠多的，暴露在外面的大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)為受體，通過基因槍將目的基因?qū)肫?中，然后在后代種子中篩選得到陽性純合轉(zhuǎn)化子。由于大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)植株再生比較容易， 可以顯著提高轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明通過用包含目的基因載體制成子彈， 裝到基因槍上，然后轟擊無菌苗，經(jīng)過接種誘導(dǎo)，得TO代植株；然后將把TO代植株經(jīng)誘導(dǎo)生 根和開瓶煉苗后經(jīng)誘導(dǎo)其開花結(jié)實(shí)，得到Tl代種子；最后將Tl代種子移載到人工氣候室或 大田中，得到T2代植株及其純合陽性轉(zhuǎn)化子，具體包括如下步驟步驟一，用氯氣對(duì)大豆種子表面進(jìn)行消毒，然后接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，得到無 菌苗；所述的大豆種子的種皮完整且健康無病斑。步驟二，剝離足夠多的生長(zhǎng)點(diǎn)，鋪滿到一個(gè)玻璃培養(yǎng)皿中；所述的生長(zhǎng)點(diǎn)是指選取帶有4-6片葉原基且長(zhǎng)度為0. 4-0. 6厘米的無菌苗，扒開 葉原基使生長(zhǎng)點(diǎn)暴露在無菌苗外部。步驟三，用包含目的基因載體制成子彈，裝到基因槍上，然后轟擊培養(yǎng)皿的中央部 位3-4次；所述的子彈是指包裹目標(biāo)DNA的直徑為1. 5 μ m的黃金顆粒，60 μ g金粉包被 1 μ g DNA0所述的基因槍采用BD81-GJ-1000型氣體加速槍，該基因槍將包被外源DNA的金屬微粒加速，使其穿過細(xì)胞壁而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，將外源DNA分子送進(jìn)細(xì)胞核或細(xì)胞器中，整合到 染色體或細(xì)胞基因組上，從而實(shí)現(xiàn)外源DNA的轉(zhuǎn)移。所述的包含目的基因載體，為植物表達(dá)載體PBI221 ；步驟四，將基因槍轟擊后的生長(zhǎng)點(diǎn)接種到成苗培養(yǎng)基，誘導(dǎo)成苗，得到TO代植株；所述的成苗培養(yǎng)基為添加0. 5mg/L 6_芐氨基嘌呤的MS培養(yǎng)基。所述的成苗培養(yǎng)基為添加1. Omg/L赤霉素的1/2MS培養(yǎng)基。所述的MS培養(yǎng)基采用Murashige和Skoog(1962)公開的培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基在現(xiàn) 有的生物以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。具體成分如下
權(quán)利要求
1.一種大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，通過用包含目的基因載體制成 子彈，裝到基因槍上，然后轟擊無菌苗，經(jīng)過接種誘導(dǎo)，得TO代植株；然后將把TO代植株經(jīng) 誘導(dǎo)生根和開瓶煉苗后經(jīng)誘導(dǎo)其開花結(jié)實(shí)，得到Tl代種子；最后將Tl代種子移載到人工氣 候室或大田中，得到T2代植株及其純合陽性轉(zhuǎn)化子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化方法，其特征是，所述的轉(zhuǎn)化方 法包括如下步驟步驟一，用氯氣對(duì)大豆種子表面進(jìn)行消毒，然后接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，得到無菌苗；步驟二，剝離足夠多的生長(zhǎng)點(diǎn)，鋪滿到一個(gè)玻璃培養(yǎng)皿中；步驟三，用包含目的基因載體制成子彈，裝到基因槍上，然后轟擊培養(yǎng)皿的中央部位 3-4 次；步驟四，將基因槍轟擊后的生長(zhǎng)點(diǎn)接種到成苗培養(yǎng)基，誘導(dǎo)成苗，得到TO代植株；步驟五，把TO代植株轉(zhuǎn)入生根用的培養(yǎng)瓶中誘導(dǎo)生根；步驟六，TO代生根植株開瓶煉苗3-5天后，移載到人工氣候室中，并誘導(dǎo)其開花結(jié)實(shí)， 得到Tl代種子；步驟七，Tl代種子移載到人工氣候室或大田中，得到T2代植株；步驟八，對(duì)T2代植株進(jìn)行分子鑒定和轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證，從而得到純合陽性轉(zhuǎn)化子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化方法，其特征是，所述的生長(zhǎng)點(diǎn) 是指選取帶有4-6片葉原基且長(zhǎng)度為0. 4-0. 6厘米的無菌苗，扒開葉原基使生長(zhǎng)點(diǎn)暴露在 無菌苗外部。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化方法，其特征是，所述的子彈是 指包裹目標(biāo)DNA的直徑為1. 5 μ m的黃金顆粒，60 μ g金粉包被1 μ g DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化方法，其特征是，所述的基因 槍采用BD81-GJ-1000型氣體加速槍，該基因槍將包被外源DNA的金屬微粒加速，使其穿過 細(xì)胞壁而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，將外源DNA分子送進(jìn)細(xì)胞核或細(xì)胞器中，整合到染色體或細(xì)胞基因 組上，從而實(shí)現(xiàn)外源DNA的轉(zhuǎn)移。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化方法，其特征是，所述的包含目 的基因載體，為植物表達(dá)載體PBI221。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化方法，其特征是，所述的成苗培 養(yǎng)基為添加0. 5mg/L 6-芐氨基嘌呤的MS培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化方法，其特征是，所述的成苗培 養(yǎng)基為添加1. Omg/L赤霉素的V2MS培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化方法，其特征是，所述的生根用 的培養(yǎng)瓶為，20厘米高，直徑8厘米的桶狀瓶，用可降解的聚內(nèi)交酯制成，該培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)充有 生根培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化方法，其特征是，所述的生根培 養(yǎng)基為添加0. 3mg/L吲哚丁酸1/2MS培養(yǎng)基。
全文摘要
一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化方法，通過用包含目的基因載體制成子彈，裝到基因槍上，然后轟擊無菌苗，經(jīng)過接種誘導(dǎo)，得T0代植株；然后將把T0代植株經(jīng)誘導(dǎo)生根和開瓶煉苗后經(jīng)誘導(dǎo)其開花結(jié)實(shí)，得到T1代種子；最后將T1代種子移載到人工氣候室或大田中，得到T2代植株及其純合陽性轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明利用了大豆離體生長(zhǎng)點(diǎn)植株再生比較容易的特性，可顯著提高轉(zhuǎn)化效率。
文檔編號(hào)C12N15/87GK102071215SQ20101056470
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者代田純, 候彩玲, 徐美紅, 王志民, 王貴榮 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)