專利名稱：耐鹽堿短芒大麥品種的育種方法
技術領域：
本發明所屬生物技術背景技術我國自50年代以來，由于人口激增，對資源的需求越來越大，在盲目經營管理下，農牧業獨立經營，農田單一種植，廣種薄收，非宜耕地的草原大量開墾，草原過度放牧利用，致使生態平衡失調，生態系統嚴重受損，生態環境惡化。受損農田生態系統表現為土壤鹽堿化、沙化、貧瘠化，地力嚴重衰退，產量下降高達20％，有些土地甚至不能耕種，河流兩岸出現灘涂地；受損草原生態系統表現為草地嚴重超載過牧，出現大面積退化、沙化和鹽堿化，“三化”面積達70％以上(牧草產量由50年代每公頃2000公斤下降到目前的每公頃200-400公斤)，特別是堿斑面積日趨擴大，由50年代的10％，增加到現在的30-70％，每年還以2.8％的速率遞增。積于地表的鹽堿在春天常形成“白風暴”，污染環境，侵襲農田，導致生態的惡性循環，嚴重危害著農牧業生產的持續發展，威脅著人民的生活。每年冬春都因飼草短缺造成家畜大量死亡。草原地區約有50％以上的貧困戶是由于土地鹽堿荒漠化造成的。因此，急需大量適宜當地耐鹽堿的優良牧草，對鹽堿化草地進行治理，使生態環境得到改善、經濟得到持續發展，增加農牧民的收入，使農牧民盡快脫貧致富。
在二十世紀五十年代，人工誘變育種技術的研究首先在歐美等國家開展起來，主要采用的方法有60Co輻射、γ射線及中子處理等，從而有效地獲得了許多有價值的突變體。目前采用的離體誘導育種技術主要包括物理輻射和化學誘變，現已培育出有價值的突變體300多個，前蘇聯已推廣近30個，包括大麥、小麥和向日葵等。印度用60Co照射小麥培育成BHP28、BHP31、BHP15等耐鹽突變體材料，很適應于鹽堿地種植和作為耐鹽堿試驗的親本材料。最近二十年來，人們將組織和細胞培養技術與誘變技術相結合，在篩選耐鹽突變體的研究方面取得了可喜的進展。Nabors等以煙草品種Sam Sun的懸浮細胞為材料，用化學誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS)處理后，獲得最高耐0.8％NaCl的細胞系，并從耐0.64％NaCl的細胞系中得到再生植株。Hosegawa用煙草品種Wiscebsin38莖段愈傷組織的懸浮培養細胞，直接接種于含不同濃度NaCl的液體培養基中，獲得能在1.2％NaCl中生長的細胞系。另外，人們還用同樣的技術獲得了水稻、苜蓿、小麥、大麥、煙草、甘蔗、番茄、燕麥和大豆等植物的耐鹽堿突變體。近十幾年來，植物基因工程育種技術得到很大發展，打破了物種間生殖隔離的障礙，把外源目的基因轉入植物細胞，既豐富和擴大了基因資源，又達到了定向育種的目的。自1983年第一個轉基因植物問世以來，許多有益的目的基因被用于農作物的育種和新品種改良，獲得了大批如抗蟲棉、抗蟲玉米和抗病毒馬鈴薯的新品種。這些成果的取得，標志著生物工程育種技術已經成熟，開始進入了一個新時代。
目前，國內外應用現代生物技術手段，已經培育出了近百種植物數千個新品系或新品種。但是，有關短芒大麥育種方面的研究尚未見報道。多年來，我們一直致力于牧草和作物育種、栽培及草地綜合治理的研究，現已建立了一整套短芒大麥組織培養再生體系；建立了細胞懸浮培養再生植株體系；建立了一整套短芒大麥突變體誘變體系；獲得了一批有價值的短芒大麥突變體材料。在前郭縣草原站進行田間試驗，得到27份耐鹽堿材料，在大連、河北昌黎、海南島、中國農業科學院抗逆室等地種植，進行抗逆性試驗，統計分析各材料的生物學性狀，結合脯氨酸含量測定、電導率測試、同工酶分析、耐鹽穩定性檢測等，綜合鑒定結果表明，短芒大麥在pH11.0、含鹽量1.2％的鹽堿地上均能良好生長，并正在進行大面積種植和推廣應用中。短芒大麥新品種已被中國科學院植物研究所正式納入聯合申請國家高新技術研究發展計劃，并被中國農業科學院品種資源所長期保存。應用現代生物技術選育耐鹽堿短芒大麥新品種的研究，屬國內外研究的先進水平。
我國在耐鹽堿牧草品種的選育方面已取得一些成績，如羊草和堿茅等，但羊草抗旱性強，耐鹽堿能力差，堿茅耐旱性差，耐鹽堿能力強，生產能力低，每個品種都存在一定的不足。

發明內容
耐鹽堿短芒大麥品種的選育主要解決了現有牧草品種的耐鹽堿性能和抗旱能力的問題，使兩方面抗逆性能同時在一個牧草品種中體現出來，即抗旱、耐鹽堿，同時具有耐寒、耐瘠等優點。
1.根據植物細胞全能性的理論，以現代生物工程技術手段(包括植物組織培養、物理和化學誘變)對離體培養的短芒大麥幼穗、幼胚、成熟胚等的愈傷組織和懸浮細胞系進行突變體誘導和分化。
2.在鹽堿的環境條件下，依據短芒大麥的育種目標，對離體培養所獲得的再生植株的愈傷組織，進行農藝性狀篩選和分子生物學鑒定，選育可用于短芒大麥育種或牧草生產的新材料或新品系。
3.常規育種，結合常規育種方法，選育出耐鹽堿性更強的短芒大麥新品種。
短芒大麥為多年生疏叢型禾草，具短根莖，須根稠密，疏叢狀，直立或基部膝曲狀，株高70～90cm。葉片線形綠色或常綠色，長7～18cm，寬3～7mm，上面粗糙，背面光滑，葉鞘短于節間。穗狀花序，四棱形，綠色或成熟時帶紫色，穗長7.0～8.6cm，每節生有小穗3枚，有柄，穎呈針形，外稃無芒，中間小穗無柄，外稃頂端漸尖成短芒，內稃與外稃等長，穎果長約3mm，頂端有毛。播種當年發育慢，大部處于營養狀態，僅個別抽穗開花，但不能結籽成熟，第二年抽穗開花，種子成熟。生育期110～130d，結實率46.67％。種子成熟一致，結實性好，但易落粒，應注意收獲期。
分蘗力和生殖力均較強，達40～70個，穩產、高產，品質較好，粗蛋白含量達10.68％，干草產量10564.3kg/hm2，產籽量600～800kg/hm2，在生活第1年比對照增產43.3％，第2年增產77.0％，第3年增產102.2％，第3年短芒大麥的增產幅度顯著高于第1年，主要原因是短芒大麥新品種耐鹽堿能力強和越冬率高，越冬后對照區斷壟缺苗嚴重，而短芒大麥新品種很少有斷壟缺苗現象。適應性較強，抗旱、耐寒、耐瘠和耐鹽堿，適宜在濕潤的平原生長，在下濕地、灘地生長良好，在湖畔堿濕地和鹽堿地當含鹽量不超過1.2％、pH值11.0時也能生長，在北方可安全過冬，耐踐踏，適宜放牧。在吉林，遼寧，黑龍江，內蒙，河北，山東，陜西，寧夏，甘肅，新疆，四川等地均可種植。
短芒大麥營養價值高，開花期含水分13.24％，粗蛋白質15.30％，粗脂肪3.43％，粗纖維26.20％，無氮浸出物37.44％，粗灰分6.42％。葉柔軟，適口性好，消化率高，各種家畜喜食，是適于放牧的優良牧草，亦可調制干草，調制干草以在抽穗期刈割為宜。
秋季深翻土地，播種前再耕耙一次。春、夏、秋皆可播種，如有灌溉條件或春墑較好，可行春播，否則可在夏季或秋季雨后播種。播種量每畝1.5～2.0公斤，播種深度3～4cm。一般條播，行距15～30cm，播后鎮壓。當小苗長出3～4片真葉時，進行中耕除草2～3次。刈割宜在抽穗期進行，留茬宜稍高，一般7～9厘米，以利再生和越冬。有灌溉條件的地區，分別在分蘗期、拔節期和刈割后各灌溉1次，增產效果明顯。穗易折斷，落粒性強，采種田宜在60～70％種子成熟時采收。在生長的第二年，每畝追施氮肥10～15公斤。
短芒大麥(Hordeum brevisublatum)是解放軍軍需大學植物基因工程研究中心運用生物工程育種技術，對離體培養的野大麥幼穗、幼胚和成熟胚等的愈傷組織和懸浮細胞系進行突變體誘導和分化，并結合常規育種方法培育而成的多年生耐鹽堿優良牧草品種，在含鹽量0.8-1.2％、pH值9.5-11.0的鹽堿土上均生長良好，其耐鹽堿能力超過羊草，抗旱性強，比堿茅耐旱，同時具有耐寒、耐瘠等優點。分蘗力和生殖力均較強，穩產、高產、品質較好，粗蛋白含量達15.30％，干草產量10564.3kg/hm2，產籽量600-800kg/hm2，是治理鹽堿化草地最理想的草種。


圖1為本發明的選育技術路線圖具體實施方式
實施例(一)植物組織培養、誘導及分化1、愈傷組織的誘導和培養(1)幼穗愈傷組織的誘導選取未出旗葉的幼穗，用70％的酒精棉球擦3次，然后在無菌條件下，用鑷子取出幼穗。選擇長3.0～6.0cm左右的幼穗，將其剪成5mm左右的小塊，接種于誘導培養基上，一瓶中放入8～10塊，置于25±1℃，黑暗條件下培養，誘導愈傷組織。
幼穗的誘導培養基MS+2.4-D1.5mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％。
(2)幼胚愈傷組織的誘導取受粉后12～15天左右的麥穗，用鑷子取出幼胚放于70％的酒精中漂洗40秒鐘，然后移入0.1％的氯化汞溶液中浸洗15分鐘，再用無菌水沖洗5次。用鑷子或解剖刀損傷幼胚后，接種于誘導培養基中，置于25±1℃，黑暗條件下培養，誘導愈傷組織。
幼胚的誘導培養基MS+2.4-D1.5mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％。
(3)成熟胚愈傷組織的誘導取當年成熟的種子，用解剖刀切下胚，室溫下浸泡三到五小時，在70％的酒精中滅菌1分鐘，再在0.1％的氯化汞溶液中漂洗20分鐘，然后用無菌水沖洗5次，用解剖刀將胚損傷后，置于25±1℃，黑暗條件下誘導愈傷組織。
待愈傷組織形成后，每個月繼代培養1次。繼代時，選取色澤新鮮，白色或淡黃色的、質地緊密的且表面具有顆粒狀結構的胚性愈傷組織進行培養，培養溫度25±1℃，光照強度100Lux，每天人工光照10小時。
成熟胚的誘導培養基MS+2.4-D4.0mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％。
2、懸浮細胞系的建立選取淡黃色、顆粒狀、易碎的胚性愈傷組織來建立懸浮細胞系。取3～5g新鮮的胚性愈傷組織、放入裝有20ml培養液的、容量為100ml的三角瓶中，置入旋轉式搖床上，在轉速為120轉/分鐘，溫度為25±1℃的散射光條件下，振蕩培養。
根據懸浮培養物的生長狀態，來調整繼代周期和稀釋比例。最初，每隔5天換1次新鮮培養液。換液時，先將三角瓶靜置1分鐘，小心吸出上層培養液，然后加入等量的新鮮培養液。換液時，還應注意去掉褐化死亡的愈傷組織塊。
待懸浮培養液變得比較渾濁，較大的愈傷組織塊分散成2mm以下的細胞團塊后，以1份懸浮培養物1份新鮮培養液的比例稀釋，進行繼代培養1次。隨著細胞生長速度的加快，適當增加稀釋比例。
為了提高懸浮培養物的分散度和均質性，用孔徑500μm的尼龍網過濾懸浮培養物，去掉較大的細胞團塊，同時縮短繼代周期，每3天繼代培養1次，進行強化培養。
當建立均質、分散的胚性懸浮系后，以1∶4稀釋比例繼代培養，每7天繼代1次，保持懸浮系。
懸浮細胞系的誘導、繼代培養基MS無機鹽+CH1000mg/L+L-pro500mg/L+肌醇250mg/L+有機附加液+2.4-D2.0mg/L+Sucrose30mg/L有機附加液VB15mg/L+VB65mg/L+Gly2mh/L+煙酸5mg/L配成100x的貯備液。
3、懸浮細胞系的誘變處理及耐鹽愈傷組織的篩選選取三瓶生長狀態較好的懸浮細胞系，分別加入1.5％的甲基磺酸乙酯溶液，使其最終濃度為0.3％，然后放在旋轉搖床上分別培養(E1)0.5小時，(E2)1.5小時，(E3)2.5小時，處理完畢后，靜止2分鐘。倒掉上清液，然后用無菌水沖洗2次，再用懸浮培養液換洗2次最后將誘變處理后的懸浮細胞系置于原來的培養條件下培養3天。然后吸取該懸浮培養細胞，培養于篩選培養基上，進行耐鹽愈傷組織的篩選。
4、懸浮細胞系和耐鹽愈傷組織的分化(1)懸浮培養細胞的植株再生先將細胞團培養于MS+2.4-D2.0mg/L+CH500mg/L+Sucrose30g/L+Agar0.7％的固體培養基上，培養5周后，將其形成的白色愈傷組織轉入分化培養基，在25℃光照條件下培養，誘導分化。
懸浮細胞系的分化培養基MS+ZT0.5mg/L+KT1.0mg/L+Sucrose20mg/L+Agar0.7％。
(2)耐鹽愈傷組織的分化篩選出耐鹽愈傷組織，經繼代培養3次后，其中部分耐1.2％NaCl的愈傷組織轉入不同的分化培養基中，在25℃光照條件下誘導分化。將獲得再生植株漸次移入砂中、花盆中，然后再移栽于鹽堿地中，直接進行耐性檢測，當年成熟的種子，部分繼續播種，部分進行苗期的耐鹽性鑒定。
耐鹽愈傷組織的篩選、繼代培養基MS+2.4-D2.0mg/L+CH500mg/L+Sucrose30g/L+Agar0.7％再加入不同濃度的NaCl(0.4％、0.8％、1.2％)，分別用P1，P2，P3表示3個繼代培養基。
耐鹽愈傷組織的分化培養基aMS+NAA1.0mg/L+BA0.5mg/L+GA33.0mg/L+NaCl1.2％+Sucrose15mg/L+Agar0.7％。
bMS+IAA0.5mg/L+GA32.0mg/L+KT1.0mg/L+NaCl1.2％+Sucrose15mg/L+Agar0.7％。
以上所有培養基PH5.8-6.0，在121℃，15磅壓力下，滅菌18-20分鐘。
營養液是MS的液體形式。
注縮略語MSMurashige和Skoog培養基(1962)CH水解酪蛋白Sucrose蔗糖Agar瓊脂L-proL-脯氨酸Gly甘氨酸2.4-D2.4-二氯苯氧乙酸ZT玉米素KT激動素
NAAα-萘乙酸BA6-芐基嘌呤GA3赤霉素IAA吲哚乙酸5、種子的Co-60γ射線輻射處理取當年成熟的種子，分成4等分，分別用4個不同的誘變劑量對照(CK)，1萬勒克斯(第1組)、3萬勒克斯(第2組)、5萬勒克斯(第3組)的Co-60γ射線誘變處理，處理后的種子清洗后，分別播種于總含量為0.796％pH8.9的鹽堿地，進行耐鹽變異體的篩選。播種時，垅長3m，寬20cm，每條垅的播種量75g，于六月中旬播種，八月上旬對其出苗率進行統計。
(二)常規育種及篩選1、選擇優良單株，混合脫粒，下年混合種植通過觀測再生植株在鹽堿地上的生長發育狀況、產草量和耐鹽堿能力，從中選擇生長良好、產草量高和適應性強的優良單株，混合脫粒，下年進行混合種植。
2、第二次選擇優良單株，混合脫粒，下年混合種植將上一年混合脫粒的種子，進行混合種植，從中選擇生長良好、產草量高和適應性強的優良單株，混合脫粒，下年進行混合種植。
3、繼續選擇優良單株，混合脫粒，下年混合種植將上一年混合脫粒的種子，進行混合種植，從中選擇生長良好、產草量高和適應性強的優良單株，混合脫粒，下年進行混合種植。
4、如此連選5代，直到混合群體符合標準將上一年混合脫粒的種子，進行混合種植，如此連選5代生長良好、產草量高和適應性強的優良單株，混合脫粒，直到混合群體符合標準。
權利要求
1.耐鹽堿短芒大麥品種的育種方法，其特征是a)根據植物細胞全能性的理論，以現代生物工程技術手段(包括植物組織培養、物理和化學誘變)對離體培養的短芒大麥幼穗、幼胚、成熟胚等的愈傷組織和懸浮細胞系進行突變體誘導和分化；b)在鹽堿的環境條件下，依據短芒大麥的育種目標，對離體培養所獲得的再生植株的愈傷組織，進行農藝性狀篩選和分子生物學鑒定，選育可用于短芒大麥育種或牧草生產的新材料或新品系；c)常規育種，結合常規育種方法，選育出耐鹽堿性更強的短芒大麥新品種。
2.根據權利要求1所述的育種方法，其特征是植物組織培養對離體培養的短芒大麥幼穗、幼胚、成熟胚的愈傷組織和懸浮細胞系進行突變體誘導和分化，其步驟為(一)植物組織培養、誘導及分化1、愈傷組織的誘導和培養(1)幼穗愈傷組織的誘導選取未出旗葉的幼穗，用70％的酒精棉球擦3次，然后在無菌條件下，用鑷子取出幼穗；選擇長3.0～6.0cm左右的幼穗，將其剪成5mm左右的小塊，接種于誘導培養基上，一瓶中放入8～10塊，置于25±1℃，黑暗條件下培養，誘導愈傷組織；幼穗的誘導培養基MS+2.4-D1.5mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％；(2)幼胚愈傷組織的誘導取受粉后12～15天左右的麥穗，用鑷子取出幼胚放于70％的酒精中漂洗40秒鐘，然后移入0.1％的氯化汞溶液中浸洗15分鐘，再用無菌水沖洗5次；用鑷子或解剖刀損傷幼胚后，接種于誘導培養基中，置于25±1℃，黑暗條件下培養，誘導愈傷組織；幼胚的誘導培養基MS+2.4-D1.5mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％；(3)成熟胚愈傷組織的誘導取當年成熟的種子，用解剖刀切下胚，室溫下浸泡三到五小時，在70％的酒精中滅菌1分鐘，再在0.1％的氯化汞溶液中漂洗20分鐘，然后用無菌水沖洗5次，用解剖刀將胚損傷后，置于25±1℃，黑暗條件下誘導愈傷組織；待愈傷組織形成后，每個月繼代培養1次；繼代時，選取色澤新鮮，白色或淡黃色的、質地緊密的且表面具有顆粒狀結構的胚性愈傷組織進行培養，培養溫度25±1℃，光照強度100Lux，每天人工光照10小時；成熟胚的誘導培養基MS+2.4-D4.0mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％；
2.懸浮細胞系的建立選取淡黃色、顆粒狀、易碎的胚性愈傷組織來建立懸浮細胞系；取3～5g新鮮的胚性愈傷組織、放入裝有20ml培養液的、容量為100ml的三角瓶中，置入旋轉式搖床上，在轉速為120轉/分鐘，溫度為25±1℃的散射光條件下，振蕩培養；根據懸浮培養物的生長狀態，來調整繼代周期和稀釋比例；最初，每隔5天換1次新鮮培養液；換液時，先將三角瓶靜置1分鐘，小心吸出上層培養液，然后加入等量的新鮮培養液；換液時，還應注意去掉褐化死亡的愈傷組織塊；待懸浮培養液變得比較渾濁，較大的愈傷組織塊分散成2mm以下的細胞團塊后，以1份懸浮培養物1份新鮮培養液的比例稀釋，進行繼代培養1次；隨著細胞生長速度的加快，適當增加稀釋比例；為了提高懸浮培養物的分散度和均質性，用孔徑500μm的尼龍網過濾懸浮培養物，去掉較大的細胞團塊，同時縮短繼代周期，每3天繼代培養1次，進行強化培養；當建立均質、分散的胚性懸浮系后，以1∶4稀釋比例繼代培養，每7天繼代1次，保持懸浮系；懸浮細胞系的誘導、繼代培養基MS無機鹽+CH1000mg/L+L-pro500mg/L+肌醇250mg/L+有機附加液+2.4-D2.0mg/L+Sucrose30mg/L；有機附加液VB15mg/L+VB65mg/L+Gly2mh/L+煙酸5mg/L配成100x的貯備液；
3.懸浮細胞系的誘變處理及耐鹽愈傷組織的篩選選取三瓶生長狀態較好的懸浮細胞系，分別加入1.5％的甲基磺酸乙酯溶液，使其最終濃度為0.3％，然后放在旋轉搖床上分別培養(E1)0.5小時，(E2)1.5小時，(E3)2.5小時，處理完畢后，靜止2分鐘；倒掉上清液，然后用無菌水沖洗2次，再用懸浮培養液換洗2次最后將誘變處理后的懸浮細胞系置于原來的培養條件下培養3天；然后吸取該懸浮培養細胞，培養于篩選培養基上，進行耐鹽愈傷組織的篩選；
4.懸浮細胞系和耐鹽愈傷組織的分化(1)懸浮培養細胞的植株再生先將細胞團培養于MS+2.4-D2.0mg/L+CH500mg/L+Sucrose30g/L+Agar0.7％的固體培養基上，培養5周后，將其形成的白色愈傷組織轉入分化培養基，在25℃光照條件下培養，誘導分化；懸浮細胞系的分化培養基MS+ZT0.5mg/L+KT1.0mg/L+Sucrose20mg/L+Agar0.7％(2)耐鹽愈傷組織的分化篩選出耐鹽愈傷組織，經繼代培養3次后，其中部分耐1.2％NaCl的愈傷組織轉入不同的分化培養基中，在25℃光照條件下誘導分化；將獲得再生植株漸次移入砂中、花盆中，然后再移栽于鹽堿地中，直接進行耐性檢測，當年成熟的種子，部分繼續播種，部分進行苗期的耐鹽性鑒定；耐鹽愈傷組織的篩選、繼代培養基MS+2.4-D2.0mg/L+CH500mg/L+Sucrose30g/L+Agar0.7％再加入不同濃度的NaCl(0.4％、0.8％、1.2％)，分別用P1，P2，P3表示3個繼代培養基；耐鹽愈傷組織的分化培養基aMS+NAA1.0mg/L+BA0.5mg/L+GA33.0mg/L+NaCl1.2％+Sucrose15mg/L+Agar0.7％；bMS+IAA0.5mg/L+GA32.0mg/L+KT1.0mg/L+NaCl1.2％+Sucrose15mg/L+Agar0.7％；以上所有培養基PH5.8-6.0，在121℃，15磅壓力下，滅菌18-20分鐘；營養液是MS的液體形式。
全文摘要
本發明屬農業生物技術，本發明是運用生物工程育種技術，對離體培養的野大麥幼穗、幼胚和成熟胚等的愈傷組織和懸浮細胞系進行突變體誘導和分化，并結合常規育種方法培育而成的多年生耐鹽堿優良牧草品種，在含鹽量0.8－1.2％、pH值9.5－11.0的鹽堿土上均生長良好，其耐鹽堿能力超過羊草，抗旱性強，比堿茅耐旱，同時具有耐寒、耐瘠等優點。分蘗力和生殖力均較強，穩產、高產、品質較好，粗蛋白含量達15.30％，干草產量10564.3kg/hm
文檔編號A01H3/00GK1502226SQ02149020
公開日2004年6月9日 申請日期2002年11月20日 優先權日2002年11月20日
發明者李彥舫, 沈景林, 張亞蘭, 李喜文, 陸一鳴, 朱進, 程曉蕊, 楊柏明, 張成武, 楊松濤 申請人:中國人民解放軍軍需大學