專利名稱：用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的引物、試劑盒和方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體而言，本發明涉及用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的引物、用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的試劑盒、使用所述引物或試劑盒檢測啤酒大麥品種和/或純度的方法，以及所述引物或試劑盒在檢測啤酒大麥品種和/或純度中的應用。
背景技術：
大麥是僅次于水稻、小麥、玉米等糧食作物的第四大主產作物，根據其用途可分為啤酒大麥、飼用大麥、食用大麥三種類型。其中啤酒大麥是啤酒釀造的主要來源。目前我國啤酒大麥種植面積約1000萬畝，年產約150-200萬噸，優質啤酒大麥產量遠遠達不到市場需求，據統計1998-2007年我國從澳大利亞、加拿大、法國共計進口 1834. I萬噸啤酒大麥，年均進口量183萬噸。近年來，由于啤酒工業的迅猛發展，對啤酒大麥的需求不斷增大，同 時對其品質要求也隨之提高。啤酒大麥種質的優劣將直接影響麥芽和啤酒品質。因各地風土氣候和耕種習慣等原因，世界各地不同品系、不同產地的啤酒大麥各不相同，釀造出的啤酒質量也大相徑庭。啤酒大麥品種和/或純度是評判啤酒大麥質量的重要指標，準確鑒別啤酒大麥品種和/或純度是啤酒大麥原料質量控制的重要措施。目前，由于生產、經營、管理不規范，不合格種子甚至假種頻繁混入市場，對啤酒工業造成了一定損失，并損害了品種權擁有者的利益和廣大農民的經濟利益，破壞了良好的市場秩序。因此，建立一套完善的種質鑒定體系尤為重要。目前，傳統的鑒定手段多采用形態標記方法，如穗長、粒色、干粒重等，但該法易受環境及雜交過程個體變化影響，鑒定結果不可靠。在啤酒大麥種質鑒定方面尋求可靠的分子生物學技術成為一種趨勢。RAPD (隨機擴增多態DNA)技術作為一種DNA分子指紋技術，是利用合成的隨機引物基于整個基因組序列進行隨機PCR擴增，不同的基因組由于序列的差異導致PCR產物長度多態性，通過電泳檢測到的多態性特征對不同基因組進行區分，十分容易發現不同樣品之間的序列差異。因此，RAPD在物種鑒定中的優勢非常突出，不僅操作相對簡便，容易標準化，而且是從基因水平進行分析，不受外界條件的影響，分辨率高，可有效區分近緣品種。目前，國內外對于檢測啤酒大麥的品種和/或純度的RAPD方法研究較少，而且技術尚不夠成熟，尤其是對于啤酒大麥的純度檢測尚無直接根據擴增條帶進行半定量的先例。另外，傳統的啤酒大麥RAro檢測技術是通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳進行PCR產物的檢測，例如“侯永翠等，利用RAPD標記分析大麥種質資源的遺傳多樣性,《植物遺傳資源學報》2005,6 (2) 145 150”和“張大樂等，中國啤酒大麥品種RAPD標記的遺傳多樣性分析，《武漢植物學研究》2005，23(4) 305 309”中所揭示的，通過肉眼觀察分子量標準對應位置來判斷標記條帶的有無，容易受到電泳條件變化或操作誤差造成的條帶位置偏差的干擾，加上隨機擴增自身的非特異性，得到的圖譜往往在重現性上存在問題。另外，目前針對啤酒大麥之類的谷物純度的基因鑒別方法主要采用單粒法，操作繁瑣，需要投入大量人力物力。
因此，本領域需要一種快速、簡便以及可靠的啤酒大麥品種和/或純度的檢測方法。

發明內容
一方面，本發明提供了用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的引物，所述引物的核苷酸序列為SEQ ID No. 1-5所示。 本發明所述引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No. I(Opp14) :5，CCAGCCGAAC3，；SEQ ID No. 2 (BA8) :5，GTCCACACGG3，；SEQ ID No. 3 (BAlO) :5，CTGCTGGGAC3，；SEQ ID No. 4(BA152) :5，TTATCGCCCC3，;以及SEQ ID No. 5(BA187) :5，TCCGATGCTG3，。另一方面，本發明提供了用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD試劑盒，所述試劑盒包含本發明所述的引物。根據一種優選的實施方式，本發明的所述試劑盒還包含使用說明書，所述使用說明書中記載的隨機PCR擴增反應條件是94°C, IOmin ；94°C lmin, 37°C lmin, 72°C 2min，45個循環；72°C 5min。根據一種優選的實施方式，本發明的所述試劑盒還包含用于提取樣品DNA的試劑和用于隨機PCR擴增反應的試劑。根據一種進一步優選的實施方式，所述試劑盒還包含標準品和陰性對照，所述標準品為啤酒大麥目標品系的DNA序列，所述陰性對照為無菌雙蒸水。再一方面，本發明提供了用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD方法，所述方法包括使用本發明所述的引物或試劑盒。根據一種實施方式，本發明用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD方法包括如下步驟；(I)提取啤酒大麥DNA模板；(2)分別使用本發明所述的引物對于所述步驟⑴獲得的啤酒大麥DNA模板進行隨機PCR擴增；(3)對所述步驟(2)隨機PCR擴增獲得的產物進行毛細管芯片電泳；(4)根據所述步驟(3)獲得的標志帶圖譜鑒定啤酒大麥的品種；和/或(5)對于所述步驟(3)獲得的標志帶圖譜繪制標準曲線，建立啤酒大麥純度檢測半定量模型，以判定啤酒大麥目標品種的純度。根據一種優選實施方式，其中，上述步驟(2)的隨機PCR擴增的條件被設定為94°C, IOmin ；94°C lmin,37°C lmin,72°C 2min，45 個循環；72°C 5min。根據一種優選實施方式，本發明用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD方法能夠鑒定選自下述的啤酒大麥品種甘啤3號、甘啤4號、懇啤2號、懇啤3號、Harningtan,Copeland、Metcalfe、Baudlin、Hamel in Λ Legacy、Kendall、Stirling、Gairdner Λ Estevel、Cervoise、Flagship、Arturio、Vlamingh 以及 Newdale。根據一種優選實施方式，其中，上述步驟(3)中毛細管芯片電泳釆用50_1000bp分子量標準品。又一方面，本發明提供了本發明所述的引物或試劑盒在檢測啤酒大麥品種和/或純度中的應用。本發明RAPD技術通過使用本發明人篩選的5條隨機寡核苷酸引物并利用毛細管芯片電泳對PCR產物高分辨、高靈敏度、穩定以及準確量化(分子量、相對量以及濃度)的優點，對初選得到的隨機擴增標志帶的重現性進行嚴格篩查，最終得到7條有意義的標志帶。結果證明，利用本發明建立的RAro檢測方法可以有效地進行啤酒大麥品種的鑒定，同時還通過標準曲線方法建立啤酒大麥純度快速檢測半定量模型，從而可對啤酒大麥樣品純度進行準確的半定量檢測。該半定量方法直接對混合樣品進行檢測，無需對大量的單粒種子分別進行鑒別，可以迅速判斷樣品的純度范圍，使得操作更為簡便。本發明的RAPD技術快速、簡便且可靠，具有良好的應用推廣前景。


·圖I顯示不同擴增酶反應體系對7個標志帶的靈敏度影響情況。這里使用的擴增酶反應體系包括Hotstar、Takara> Invitrogen。靈敏度表示為模板的10倍倍比系列稀釋倍數，倍數越高，說明靈敏度越高。橫坐標為標志帶，縱坐標為稀釋倍數。圖2是19號和I號組合(圖2A)、14號和3號組合(圖2B)、11號和8號組合(圖2C)的啤酒大麥不同比例混合物(基于I號、14號以及8號的含量分別為90%、70%、50%、30%,10%,5%)的實驗結果。箭頭指示標志帶，標志帶的有或無可以對啤酒大麥品系進行鑒別，標志帶濃度或相對量可以作為未知樣品純度半定量檢測的參照。各電泳圖的橫坐標為電泳泳道，其對應的啤酒大麥種子重量比(基于I號、14號以及8號)分別為左列各小圖中的泳道1-4為90%，泳道5-8為70%，泳道9-12為50% ;右列各小圖中的泳道1_4為30%，泳道5-8為10%，泳道9-12為5%。縱坐標為分子量marker。圖3是19號和I號組合(圖3A)、14號和3號組合(圖3B)、11號和8號組合(圖3C)的啤酒大麥不同比例混合物(基于I號、14號以及8號的含量分別為90%、70%、50%、30%>10%>5% )的標志帶相對量標準曲線。橫坐標為標志帶相對量，縱坐標為純度。圖4是5個不同濃度水平的19號和I號混合樣品的半定量電泳結果。根據樣品標志帶與標準樣品標志帶著色的比較，可以對混合樣品的純度范圍(基于I號的含量來計)進行判斷。圖片左上角為混合樣品真實純度；箭頭指示標志帶；橫坐標為電泳泳道，縱坐標為分子量marker ;上方的90_5表示標準樣品濃度；橢圓標識混合樣品。
具體實施例方式本發明所使用的5條寡核苷酸引物是從隨機引物庫中針對19個品種的啤酒大麥(包含主要進口啤酒大麥品種)基因組篩選得到的，能夠鑒定13組啤酒大麥品種(甘啤3，甘啤 4,懇啤 2, Harningtan/KendalI, Copeland/Metcalfe/Newdale, Baudlin/Stirling,Hamelin, Legacy,Gairdnev,Estevel/Arturio, Cerroise,Flagship/Vlamingh,懇啤 3)。通過采用RAPD技術對引物擴增特異性、標志帶重現性、靈敏度、穩定性、純度檢測等進行了研究。在本發明的RAH)技術中，本發明采用毛細管芯片電泳對啤酒大麥樣品進行混合樣品檢測，建立了啤酒大麥純度檢測方法。同時，由于得到的特異性標志帶的相對量或濃度與啤酒大麥純度呈現良好線性關系，還通過標準曲線方法建立啤酒大麥純度快速檢測半定量模型，從而可對啤酒大麥樣品進行純度半定量檢測。下面通過實施例的方式對本發明作進一步的說明，但是本發明并不僅僅局限于以下實施例。儀器與試劑
所使用的主要檢測儀器如下微量移液器(10μ L、100 μ L、1000y L，Eppendorf，德國)、PCR 儀(EppendorfJI國)、高速臺式離心機(Picol7Thermo，德國)、高速粉碎機(IKA-WEARKE，德國)、毛細管芯片電泳儀(2100,美國 Angilent)。所使用的檢測主要試劑如下氯仿、異丙醇，分別購于北京六合通公司；DNA提取試劑盒,購自Nucleospin, MN ；Taqman聚合酶試劑中Hotstar購自德國Qiagen、Takara購自日本Takara、Invitrogen購自美國Invitrogen ;引物，由北京英俊生物科技有限公司合成；用于毛細管芯片電泳的DNAIOOOLabChip試劑盒購自美國Agilent公司。實施例I本實施例通過如下試驗對啤酒大麥品種和/或純度檢測引物的特異性、重現性、特征參數和靈敏度進行驗證。I、DNA模板提取(I)對19個啤酒大麥檢測樣品(包括甘啤3號、甘啤4號、懇啤2號、Harningtan、Copeland、Metcalfe、Baudlin、Hamelin、Legacy、Kendall、Stirling、GairdnerΛ Estevel、Cervoise、Flagship、Arturio、Vlamingh、懇啤 3 號、Newdale)進行 DNA 模板提取。具體地，分別稱取每一樣品的50g啤酒大麥種子，用研磨機磨成粉末，稱取lOOmg，使用DNA提取試劑盒提取DNA模板，用100 μ L雙蒸無菌水溶解，作為原液儲存于4°C備用。(2)將上述提取的啤酒大麥DNA模板原液用無菌水分別稀釋10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍，用于分析不同聚合酶體系的擴增靈敏度。(3)分別將I號(甘啤3號)和19號(Newdale)組合、14號(Cervoise)和3號(懇啤2號)組合、11號(Stirling)和8號(Hamelin)組合的啤酒大麥樣品按重量比90%、70%,50%,30%,10%,5%混合，分別稱取50g混合后的啤酒大麥種子，用研磨機磨成粉末，稱取lOOmg，使用DNA提取試劑盒提取DNA，用100 μ L雙蒸無菌水溶解，4°C儲存，用于進行啤酒大麥純度檢測定量模型的檢測。2、隨機擴增所用引物所使用的寡核苷酸引物序列示于SEQ ID No. 1_5。3、隨機擴增反應體系使用SEQ ID No. 1-5的5條隨機引物分別對19個啤酒大麥檢測樣品進行擴增。反應體系為10 X PCR 緩沖液 2. 5 μ L，dNTP (各 2. 5mmol/L) 2 μ L, TaqDNA 聚合酶 IU，DNA 模板5 μ L，弓 I物(10ymol/l)1.3yL,7jC 14 μ L。4、隨機擴增反應參數940C，IOmin ；94°C lmin, 37°C lmin, 72°C，2min, 45 個循環；72°C 5min。
5、毛細管芯片電泳根據制造商的使用說明書進行操作，具體地，將DNA IOOOLabChip試劑盒中DNADye Concentrate 及 DNA Gel Matrix 試劑室溫放置 30min,潤旋振蕩 DNA Dye Concentrate試劑，取25μ DNA Dye Concentrate至DNAGel Matrix試劑中，混勻充分后,用離心過濾器過濾，1500g離心lOmin。將凝膠-染料混合物注入分離芯片中，將5 μ L marker加入各個樣品孔中。取PCR擴增產物各I μ L分別加入12個樣品孔中，將I μ L ladder加入指定的ladder孔中，最后將芯片潤旋混勾后放入Agilent 2100毛細管芯片電泳僅中進彳丁檢測。實驗結果分別示于表1-2和圖1-3。表I顯示使用SEQ ID No. 1-5的5條隨機引物擴增的7個標志帶對19個啤酒大麥品種的區分結果。P表示標志帶陽性，N表示標志帶陰性。通過這些標志帶的有或無，可以鑒定啤酒大麥的品系。“特異性” 一列中號表示該啤酒大麥品種可以和其他品種區分，數字表示和該品種成為一個組，與其他品種區分。如表I所示，19個啤酒大麥品種通 過5條隨機引物擴增的7個標志帶可以區分成13組(甘啤3,甘啤4,懇啤2,Harningtan/Kendall, Copeland/Metcalfe/Newdale, Baudlin/Stirling, Hamelin, Legacy, Gairdnev,Estevel/Arturio, Cerroise,Flagship/Vlamingh,懇啤 3)。每組品系具有特異的標志帶圖譜(分子指紋)。括號中的百分率表示11次獨立實驗出現的陽性率，同時體現該標志帶的重現性，對品系判別最關鍵的標志帶均為100%的陽性或0%的陰性，說明所選擇的標志帶具有很好的重現性。表2顯示5條隨機引物擴增的7個標志帶的分子量范圍和相對分子量限值，其中包括11次獨立實驗中每個標志帶分子量的平均值、標準偏差、相對標準偏差、上下限，和標志帶相對分子量的平均值、標準偏差、相對標準偏差、下限。根據標志帶的這些分子量和相對分子量下限，可以對標志帶的身份和有無進行判別。例如，對于0PP14的擴增產物，只有通過毛細管芯片電泳結果顯示分子量介于690bp和789bp之間和相對分子量大于3的條帶才是0PP14-A。通過對11次獨立實驗數據的統計分析，設置7條標志帶的分子量上下限和相對分子量下限，能夠準確對標志帶身份和結果進行判別，避免了傳統凝膠電泳因主要依靠肉眼鑒別條帶導致錯判和漏判，大大提高RAPD技術的可靠性和科學性。§
OOi
/
__ 表I:使用SEQ ID No. 1-5的隨機引物鑒定19種啤
標志帶
樣品序號品系名稱產地
0PP14-A0PP14-B BA8-A BAlO-A
I甘啤 3 號中國內蒙古P/N(60%) N(O)P(100%) P(100%)
_2__廿啤 4 號__中國廿肅N(O)__N(O)__P(IOO0Zo) P(100%) _
3__懇啤 2 號中國黑龍江P(100%)N(O)__N(O)__N(O)__
^4__Harningtan 加拿大P/N(70%) N(O)__P(100%) P100%)—
5Copeland加拿大N(O)N(10%) P(100%) N/P(55%)
6Metcalfe加拿大Ν(1 %)N(O)Ρ(10 %) N(O)
7Baudlin澳大利亞PNPP
8Hamclin澳大利亞PNPP _9__Legacy__加拿人N(O)__N(O)__N(O)__N(O)__
10Kendall加拿大P(100%)N(O)P(100%) P(100%)
_U__Stirling__澳大利亞P/N(80%) N(O)__P(100%) P(100%)—
12Gairdnev澳大利亞PNPP
權利要求
1.用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列為SEQ ID No. 1-5 所示。
2.用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求I所述的引物。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含使用說明書，所述使用說明書中記載的隨機PCR擴增反應條件是94°C, IOmin ;94°C lmin, 37 °C lmin,72 °C 2min，45 個循環；72°C 5min。
4.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含用于提取樣品DNA的試劑和用于隨機PCR擴增反應的試劑。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含標準品和陰性對照，所述標準品為啤酒大麥目標品系的DNA序列，所述陰性對照為無菌雙蒸水。
6.檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD方法，其特征在于，所述方法包括使用權利要求I所述的引物或權利要求2至5任一項所述的試劑盒。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟； (1)提取啤酒大麥DNA模板； (2)分別使用權利要求I所述的引物對于所述步驟(I)獲得的啤酒大麥DNA模板進行隨機PCR擴增； (3)對所述步驟(2)隨機PCR擴增獲得的產物進行毛細管芯片電泳； (4)根據所述步驟(3)獲得的標志帶圖譜鑒定啤酒大麥的品種；和/或 (5)對于所述步驟(3)獲得的標志帶圖譜繪制標準曲線，建立啤酒大麥純度檢測半定量模型，以判定啤酒大麥目標品種的純度。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)的隨機PCR擴增的條件被設定為94°C, IOmin ；94°C lmin，37°C lmin，72°C 2min，45 個循環；72°C 5min。
9.根據權利要求6至8任一項所述的方法，其特征在于，所述方法能夠鑒定選自下述的啤酒大麥品種甘啤3號、甘啤4號、懇啤2號、懇啤3號、Harningtan、Copeland、Metcalfe、Baudlin、Hamel in > Legacy > Kendall、Stirling、Gairdner > Estevel、Cervoise、Flagship、Arturio、Vlamingh 以及 Newdale。
10.權利要求I所述的引物或權利要求2至5任一項所述的試劑盒在檢測啤酒大麥品種和/或純度中的應用。
全文摘要
本發明涉及用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的引物，所述引物的核苷酸序列為SEQ ID No.1-5所示。本發明還涉及用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD檢測試劑盒，所述試劑盒包含本發明所述的引物。本發明還涉及用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD方法，所述方法包括使用本發明所述的引物或試劑盒。本發明還涉及本發明所述的引物或試劑盒在檢測啤酒大麥品種和/或純度中的應用。使用本發明的RAPD方法，能夠快速進行啤酒大麥品種和/或純度的檢測，且操作簡便，結果可靠。
文檔編號C12N15/11GK102952851SQ20111024272
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月23日 優先權日2011年8月23日
發明者吳亞君, 陳穎, 王斌, 韓建勛, 袁飛 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院