專利名稱：堿性纖維素酶變異體的制作方法
技術領域：
本發明涉及可摻入到洗滌劑等中的纖維素酶變異體。
近來遺傳工程的發展使大規模地生產洗滌劑酶成為可能，并可將其應用于堿性纖維素酶的生產。目前已克隆了大量的堿性纖維素酶基因，并確定了其核苷酸序列。而且，已引入了酶產生菌的誘變和育種技術、或所述酶編碼基因的誘變技術。
然而，它們在工業規模生產上的產率未能達到令人滿意的水平，因此仍然需要能高效生產的堿性纖維素酶。
因此，本發明的目的是提供能在堿性范圍有效發揮作用的堿性纖維素酶，并且由于其具有高效分泌能力或具有增強的特異活性可迅速大量地生產。
本發明的一方面提供，通過用另一種氨基酸取代在具有與SEQ.ID.NO1中所示的氨基酸序列表現出至少90％同源性的氨基酸序列的纖維素酶的下述位置、或其相應位置上的氨基酸殘基而獲得的堿性纖維素酶變異體，所述的氨基酸殘基位置為SEQ ID NO1中的(a)第10位，(b)第16位，(c)第22位，(d)第33位，(e)第39位，(f)第76位，(g)第109位，(h)第242位，(i)第263位，(j)第308位，(k)第462位，(l)第466位，(m)第468位，(n)第552位，(O)第564位，或(p)第608位；以及編碼該堿性纖維素酶變異體的基因。
本發明的另一方面提供包含上述基因的載體，和含有所述載體的轉化體。
本發明的又一方面提供摻入了上述堿性纖維素酶變異體的洗滌劑組合物。
具有與SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列表現出至少90％同源的氨基酸序列、作為親本堿性纖維素酶的堿性纖維素酶包含具有SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列的堿性纖維素酶，和具有與上述序列表現出至少90％同源性的氨基酸序列的堿性纖維素酶。它們可以是野生型的堿性纖維素酶也可以是野生型的變異體。優選的，其具有經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或凝膠過濾測定的86,000±2,000的分子量，當以羧甲基纖維素作為底物時最佳的pH值為7.5到9.5；最適溫度為40到50℃；除羧甲基纖維素外可順利地降解地衣淀粉；在pH9、50℃條件下溫育10min能保持足夠的穩定。特別優選的是具有下述性質的纖維素酶，該纖維素酶分子量為86,000±2,000(通過SDS-PAGE或Sephacryl S200柱凝膠過濾)；最佳反應pH8.6到9.0；最適反應溫度50℃；和羧甲基纖維素一樣順利地降解地衣淀粉；在50℃、pH9、存在5mM氯化鈣的條件下處理10min后的剩余活性為95％或更高(估計在30℃條件下處理10min后的剩余活性為100％)。
＂具有SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列的堿性纖維素酶＂的例子包括 Egl-237(來自芽孢桿菌種的菌株KSM-5237(FERM BP-7875)，Hakamada，et al.，Biosci Biotechnol.Biochem.，64，2281-2289，2000]。＂具有與SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列表現出至少90％同源性的氨基酸序列的堿性纖維素酶＂的例子包括，具有與SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列優選至少95％、更優選至少98％同源的氨基酸序列的堿性纖維素酶。特定的例子包括來自芽孢桿菌種的菌株1139(Egl-1139)(Fukumori，et al.，J.Gen.Microbiol.，132，2329-2335)(91.4％同源性)的堿性纖維素酶，來自芽孢桿菌種的菌株KSM-64(Egl-64)(Sumitomo，et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，56，872-877，1992)(同源性91.9％)堿性纖維素酶和來自芽孢桿菌種的菌株KSM-N131(Egl-N131b)(日本專利申請No.2000-47237)(同源性95.0％)。
氨基酸序列的同源性可以利用程序，如最大值匹配或搜索GENETYX-WIN同源性(Software Development Co.)來計算。
具有SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列的親本堿性纖維素酶的(a)到(p)位氨基酸殘基是(a)第10位的亮氨酸，(b)第16位的異亮氨酸，(c)第22位的絲氨酸，(d)第33位的天冬酰胺，(e)第39位的苯丙氨酸，(f)第76位的異亮氨酸，(g)第109位的甲硫氨酸，(h)第242位的谷氨酰胺，(i)第263位的苯丙氨酸，(j)第308位的蘇氨酸，(k)第462位的天冬酰胺，(l)第466位的賴氨酸，(m)第468位的纈氨酸，(n)第552位的異亮氨酸，(o)第564位的異亮氨酸，和(p)第608位的絲氨酸。
在具有與SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的親本堿性纖維素酶中，相應于上述的SEQ.ID.NO1(a)到(p)位的氨基酸殘基優選的是(a)第10位的亮氨酸，(e)第39位的苯丙氨酸，(f)第76位的異亮氨酸，(h)第242位的谷氨酰胺，(i)第263位的苯丙氨酸，(k)第462位的天冬酰胺，(l)第466位的賴氨酸，(m)第468位的纈氨酸和(n)第552位的異亮氨酸，其中，除上述的氨基酸殘基外，具有(b)第16位的異亮氨酸和(c)第22位的絲氨酸的親本堿性纖維素酶是更優選的，除這些氨基酸殘基外具有，(d)第33位的天冬酰胺，(g)第109位的甲硫氨酸，(j)第308位的蘇氨酸，(o)第564位的異亮氨酸，和(p)第608位的絲氨酸的那些是更優選的。
因此，具有與SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的親本堿性纖維素酶優選具有上述酶學性質，和/或具有與SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列優選至少95％，更優選至少98％同源的氨基酸序列，而且具有相應于上述SEQ.ID.NO1中(a)到(p)位的氨基酸殘基。特別優選的是具有上述酶學性質，具有與SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列優選地至少95％，更優選至少98％同源的氨基酸序列，而且具有相應于上述SEQ.ID.NO1中(a)到(p)位的氨基酸殘基的纖維素酶。
當將具有SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列的纖維素酶用作親本堿性纖維素酶時，本發明的堿性纖維素酶變異體具有在(a)到(p)中任意位置發生取代的氨基酸序列，而將具有與SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的纖維素酶(除SEQ ID NO1所示的堿性纖維素酶之外)用作親本堿性纖維素酶時，位于相應于上述SEQ.ID.NO1中(a)到(p)位的任意一個位置的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基所取代。
對于另一種氨基酸，谷氨酰胺，丙氨酸，脯氨酸或甲硫氨酸，尤其是谷氨酰胺優選位于位置(a)，天冬酰胺或精氨酸，尤其是天冬酰胺優選位于位置(b)，脯氨酸優選位于位置(c)，組氨酸優選位于位置(d)，丙氨酸，蘇氨酸或酪氨酸，尤其是丙氨酸優選位于位置(e)，組氨酸，甲硫氨酸，纈氨酸，蘇氨酸或丙氨酸，尤其是組氨酸優選位于位置(f)，異亮氨酸，亮氨酸，絲氨酸或纈氨酸，尤其是異亮氨酸優選位于位置(g)，丙氨酸，苯丙氨酸，纈氨酸，絲氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，酪氨酸，蘇氨酸，甲硫氨酸或甘氨酸，尤其是丙氨酸，苯丙氨酸或絲氨酸優選位于位置(h)，異亮氨酸，亮氨酸，脯氨酸或纈氨酸，尤其是異亮氨酸優選位于位置(i)，丙氨酸，絲氨酸，甘氨酸或纈氨酸，尤其是丙氨酸優選位于位置(j)，蘇氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或精氨酸，尤其是蘇氨酸優選位于位置(k)，亮氨酸，丙氨酸或絲氨酸，尤其是亮氨酸優選位于位置(l)，丙氨酸，天冬氨酸，甘氨酸或賴氨酸，尤其是丙氨酸優選位于位置(m)，甲硫氨酸優選位于位置(n)，纈氨酸，蘇氨酸或亮氨酸，尤其是纈氨酸優選位于位置(O)，異亮氨酸或精氨酸，尤其是異亮氨酸優選位于位置(p)。
“在其相應位置的氨基酸殘基”可利用已知的算法，例如，Lipman-Pearson方法比較氨基酸序列而鑒定，給出每一堿性纖維素酶氨基酸序列中的多個相似區的最大相似值。以此種方式(圖.1)對比所述纖維素酶的氨基酸序列，無論所述氨基酸序列中存在插入或缺失都可以確定每一纖維素酶序列中同源氨基酸殘基的位置。推測同源的位置存在于三維結構的同一位點，其對有關靶纖維素酶的特定功能起類似的作用。
對于另一種具有與SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的堿性纖維素酶，相應于SEQ.ID.NO1所示的堿性纖維素酶(Egl-237)的下述位置以及這些位置上的氨基酸殘基的特定例子如下所述，所述的位置是(a)第10位，(b)1第16位，(c)第22位，(d)第33位，(e)第39位，(f)第76位，(g)第109位，(h)第242位，(i)第263位，(j)第308位，(k)第462位，(l)第466位，(m)第468(n)第552位，(o)第564和(p)第608位。
表1

在酶活性或酶學特性沒有任何改變的前提下，這些氨基酸殘基可在兩個或更多個位置上同時發生取代。下面描述的是在兩個或更多的位置上同時發生取代的情況下的優選的特定實例。氨基酸用三字母表示＂+＂表示在一個位置發生取代后另一位置發生另一次取代，＂/″表示此處所示的任意氨基酸均可使用。
優選的雙取代的例子包括Leu10(Gln/Ala/Pro/Met)+Ile16(Asn/Arg)，Ile16(Asn/Arg)+Ser22Pro，Leu10(Gln/Ala/Pro/Met)+Ser22Pro，Asn33His+Phe39(Thr/Tyr/Ala)，Leu10(Gln/Ala/Pro/Met)+Gln242(Ser/Ala/Phe/Val/Asp/Glu/Gly)，Ile16(Arg/Asn)+Ser22Pro，Ser22Pro+Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)，Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)+Phe263(Ile/Leu/Pro/Val)，Leu10(Gln/Ala/Pro/Met+Thr308(Ala/Ser/Gly/Val)，Ile16(Asn/Arg)+Asn462(Thr/Leu/Phe/Arg)，Ser22Pro+Val468(Ala/Asp/Gly/Lys)，Asn33His+Ile552Met，Asn33His+Ile564(Val/Thr/Leu)，和Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)+Ser608(Ile/Arg)，其中Leu10Gln+Ser22Pro，Asn33His+Phe39Ala，Ser22Pro+Gln242Ala，Ser22Pro+Gln242Phe，和Ser22Pro+Gln242Ser是特別優選的。
優選的三重取代的例子包括Leu10(Gln/Ala/Pro/Met)+Ser22Pro+Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)，Ile16(Asn/Arg)+Ser22Pro+Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)，和Ile76(His/Met/Val/Thr/Ala)+Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)+Lys466(Leu/Ala/Ser)，其中Leu10Gln+Ser22Pro+Gln242Ala，Ile16Asn+Ser22Pro+Gln242Ser，和Ile16Asn+Ser22Pro+Gln242Phe是特別優選的。
優選的四重取代的例子包括Lue10(Gln/Ala/Pro/Met)+Ser22Pro+Ile76(His/Met/Val/Thr/Ala)+Lys466(Leu/Ala/Ser)，Leu10(Gln/Ala/Pro/Met)+Ile16(Asn/Arg)+Ile76(His/Met/Val/Thr/Ala)+Lys466(Leu/Ala/Ser)，和Ile16(Asn/Arg)+Met109(Ile/Leu/Ser/Val)+Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)+Ile564(Val/Thr/Leu)，其中Leu10Gln+Ser22Pro+Ile76His+Lys466Leu and Leu10Gln+Ser22Pro+Gln242Ala+Lys466Leu，和Leu10Gln+Ser22Pro+Gln242Ser+Lys466Leu是特別優選的。
優選的五重取代的例子包括Leu10(Gln/Ala/Pro/Met)+Ile16(Asn/Arg)+Ser22Pro+Ile76(His/Met/Val/Thr/Ala)+Lys466(Leu/Ala/Ser)，和Ile16(Asn/Arg)+Gln242(Ala/Ser/Phe/Val/Ile/Gly/Glu/Asp/Thr/Leu/Met/Tyr)+Thr308(Ala/Ser/Gly/Val)+Ile552Met+Ser608(Ile/Arg)，其中Leu10Gln+Ile16Asn+Ile76His+Gln242ser+Lys466Leu 和Leul0Gln+Ile16Asn+Ile76His+Gln242Ala+Lys466Leu是特別優選的。
本發明的堿性蛋白酶變異體可在較上述更多的位置例如，6到16個位置同時發生取代。
除了那些通過用另一氨基酸替代上述(a)到(p)位相應的任一位置的氨基酸而獲得的變異體外，本發明的堿性纖維素酶變異體還包括那些在氨基酸序列的其他位置具有一到幾個氨基酸缺失，替換或添加而產生的變異體，條件是其不喪失其堿性纖維素酶活性。
本發明的堿性纖維素酶變異體可通過下述的方法獲得。
明確地說，可通過對編碼所克隆的親本堿性纖維素酶(例如，具有SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列的堿性纖維素酶)的基因(SEQ.ID.NO2)進行取代(其被稱作＂突變＂)而獲得，用所得的突變基因轉化合適的宿主，培養所得的重組宿主，然后從培養液中收集目的酶。
可利用普通的重組DNA技術，例如，通過基因槍或PCR的方法從芽孢桿菌種的菌株KSM-S237的染色體DNA中克隆編碼親本堿性纖維素酶的基因。
有關編碼親本堿性纖維素酶的誘變，可以采用隨機誘變或定點突變。更具體地說，所述的誘變可以通過，例如“定點誘變系統Mutan-Super Express Km試劑盒＂(由Takara Bio生產)進行。所述基因的任意序列均可通過重組PCR(聚合酶鏈式反應)方法被另一基因中與上述任意序列相應的序列所替代(PCR protocols，Academic Press，NewYork，1990)。
利用所得的突變基因生產本發明的堿性纖維素酶變異體可通過下述方式進行，即將突變基因引入能使該酶穩定的表達DNA載體，然后用所得的重組載體轉化宿主細菌。
當用大腸桿菌作為宿主時，上述載體的例子包括pUC18，pBR322，和PHY300PLK(Yakult Honsha生產)，當用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作宿主時，所述載體的例子包括pUB110，pHSP64(Sumitomo，等，Biosci.Biotechnol，Biochem.，59，2172-2175，1995)和pHY300PLK。
對于宿主細菌的轉化，原生質體法，感受態細胞法或電穿孔法均可使用。作為宿主細胞，革蘭氏陽性細菌，如那些屬于芽孢桿菌種的細菌(枯草芽孢桿菌)，革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌，放線菌如鏈霉菌(Streptomyces)，酵母如啤酒糖酵母(Saccharomyces)，真菌如曲霉菌(Aspergillus)。
用含有能同化的碳源、氮源、金屬鹽和維生素的培養液在合適的條件下培養上述的轉化體。從培養液中分離所述的酶，再用常規的方法進行純化，然后冷凍干燥，噴霧干燥和/或結晶使所述的酶形成理想的形式。
通過上述方式獲得的本發明的堿性纖維素酶變異體在不喪失親本堿性纖維素酶特性的前提下分泌能力得到提高，并且比活性有所提高。
此處所用的術語“分泌能力提高＂是指在類似的條件下生產親本堿性纖維素酶和所述的堿性纖維素酶變異體(例如，在含有下述組分的培養基中(PSM培養基)于30℃下振蕩培養72小時，所述組分為3％(w/v)“PolypeptonS”(Nihon Pharmaceutical生產)，0.5％魚肉提取物(Wako Pure Chemicals生產)，0.05％酵母提取物，0.1％磷酸二氫鉀，0.02％7水合硫酸鎂，四環素(15μm/mL)和5％麥芽糖)，測定培養物上清液中的酶活性和蛋白含量，與親本堿性纖維素酶相比，所述的堿性纖維素酶變異體至少表現出預測的在酶活性和蛋白含量上的提高。例如可以得出其在酶活性或蛋白含量上有至少5％，理想的是至少10％，更理想的是至少20％的提高。
因為認為親本堿性纖維素酶與堿性纖維素酶變異體具有相同的酶活性和蛋白含量比，所以在沒有發現任何比活性改變時，可測定酶活性和蛋白含量中的任一項。
因此本發明的堿性纖維素酶變異體可用作摻入多種洗滌劑組合物的酶。
盡管只要所述的纖維素酶能夠表現其活性，對加入到洗滌劑組合物中的本發明的堿性纖維素酶變異體的量沒有特殊地限定，但優選地在洗滌劑組合物中的量是從0.0001到5wt.％，更優選從0.00005到2.5wt.％，更優選0.01到2wt.％。當所述的堿性纖維素酶變異體以顆粒的形式使用時，在顆粒中酶的含量優選地從0.01到50wt.％，更優選的是從0.05到25wt.％，更優選的是從0.1到20wt.％。
除上述的堿性纖維素酶(顆粒)外，本發明的洗滌劑組合物優選地包含表面活性劑和助洗劑。作為表面活性劑，陰離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑、兩性表面活性劑和陽離子型表面活性劑可單獨使用，也可以結合使用，但優選陰離子表面活性劑和非離子型表面活性劑。
優選的陰離子型表面活性劑包括C10-18乙醇硫酸鹽，C8-20烷氧基化的乙醇硫酸鹽，烷基苯磺酸鹽，烷基硫酸鹽，石蠟磺酸鹽，α-烯烴磺酸鹽，α-磺基脂肪酸鹽，α-磺基脂肪酸的烷基酯鹽，脂肪酸鹽。在本發明中，線性的烷基苯磺酸鹽具有C10-14，更優選C12-14，烷基直鏈是特別優選的。作為所述鹽的反離子，堿金屬鹽和胺是優選的，其中的鈉和/或鉀，一乙醇胺和二乙醇胺是特別優選的。
優選的非離子型表面活性劑包括聚氧化亞烷基烷基(C8-20)醚，烷基聚葡糖苷，聚氧化亞烷基烷基(C8-20)苯基醚，聚氧化亞烷基脫水山梨醇脂肪酸(C8-22)酯，聚氧化亞烷基乙二醇脂肪酸(C8-22)酯，和聚氧化乙烯聚氧化丙烯嵌段共聚物。其中特別優選的非離子型表面活性劑是聚氧化亞烷基烷基醚(HLB數(通過Griffin方法計算)從10.5到15.0，優選從11.0到14.5]，通過向C10-18乙醇中添加4到20摩爾的烯化氧，如環氧乙烷或環氧丙烷而獲得。
鑒于去垢性和可溶性，在洗滌劑組合物中的表面活性劑總量優選地從10到60wt.％，更優選15到50wt.％，更優選20到45wt.％。
陰離子型表面活性劑的量優選從1到60wt.％，更優選從1到50wt.％，更優選從3到40wt.％，特別是在粉狀的洗滌劑組合物中。
非離子型表面活性劑的量優選從0.5到45wt.％，更優選從1到35wt.％，更優選從3到25wt.％，特別是在粉狀的洗滌劑組合物中。
陰離子型表面活性劑和非離子型表面活性劑可以單獨使用，但混合使用更為優選。另外，兩性表面活性劑或陽離子表面活性劑可根據使用目的結合應用。
可應用助洗劑，助洗劑本身沒有去垢性，即使有也不顯著，但當其加入到洗滌劑組合物中后可顯著地增強洗滌劑的性能，具體說來，這種助洗劑可以改善作為洗滌劑組合物主要組分的表面活性劑的去垢性。所述的助洗劑需具有至少下述的一種作用，即多價金屬陽離子清除作用，污垢分散作用和堿緩沖作用。
所述的助洗劑的例子包括水溶性無機化合物，水不溶性無機化合物和有機化合物。
水溶性無機化合物的例子包括磷酸鹽(如，三聚磷酸鹽，焦磷酸鹽，偏磷酸鹽和磷酸三鈉)，硅酸鹽，碳酸鹽和硫酸鹽。當然硫酸鹽是優選的，這是因為它具有上述的三種活性。
水不溶性無機化合物的例子包括硅鋁酸鹽(如A型沸石，B型沸石，X型沸石，和無定形的硅鋁酸鹽)，和晶狀的硅酸鹽。當然顆粒大小為3μ或更小的A型沸石(更優選1μm或更小)是優選的。
有機化合物的例子包括羧酸鹽(如氨基羧酸鹽，羥基氨基羧酸鹽，羥基羧酸鹽，環羧酸鹽，順丁烯二酸衍生物，和草酸鹽)，和有機羧酸(鹽)聚合物(如丙烯酸聚合物或共聚物，聚羧酸鹽聚合物或共聚物，乙醛酸聚合物，和其多糖和鹽)。當然有機羧酸(鹽)的聚合物是優選的。
上述助洗劑中的鹽中，優選的反離子是堿金屬鹽和胺，其中鈉或鉀，一乙醇胺和二乙醇胺是特別優選的。
盡管上述的助洗劑可以單獨使用也可以結合使用，使用水溶性無機化合物是優選的，水溶性無機化合物和有機化合物相結合是更優選的，水溶性無機化合物，有機化合物和水不溶性無機化合物結合使用是更優選的。
鑒于洗滌劑的性能，所述助洗劑在所述洗滌劑組合物中的總量優選地從20到80wt.％，更優選從30到70wt.％，更優選從35到60wt.％。
在洗滌劑組合物中，作為助洗劑的水溶性無機化合物的含量，特別是在粉末狀的洗滌劑組合物中，優選的范圍是從10到50wt.％，更優選從15到45wt.％，更優選從20到40wt.％。
作為助洗劑的水不溶性無機化合物的含量，特別是在粉末狀的洗滌劑組合物中，優選的范圍是從5到50wt.％，更優選從10到45wt.％，更優選從15到40wt.％。
作為助洗劑的有機化合物的含量，特別是在粉末狀的洗滌劑組合物中，優選的范圍是從0.1到20wt.％，更優選從0.3to 15wt.％，更優選從0.5到10wt.％。
在本發明的洗滌劑組合物中，可摻入添加劑如漂白劑(過碳酸鹽，過硼酸鹽，漂白活化劑等)，抗再沉淀劑(羧甲基纖維素等)，軟化劑(二烷基型季銨鹽，粘土礦等)，還原劑(亞硫酸鹽等)，熒光增白劑(聯苯型，氨基二苯乙烯型等)，泡沫控制劑(硅氧烷等)和香料。
在本發明的洗滌劑組合物中，還可以加入除本發明的堿性纖維素酶之外的多種酶。所述酶的例子包括，水解酶，氧化酶，還原酶，轉移酶，裂解酶，異構酶，連接酶和合成酶。其中，本發明之外的纖維素酶，蛋白酶，角蛋白酶，酯酶，cutinases，淀粉酶，脂肪酶，支鏈淀粉酶，果膠酶，甘露聚糖酶，葡糖苷酶，葡聚糖酶，膽固醇氧化酶，過氧化物酶，漆酶，是優選的。其中蛋白酶，纖維素酶，淀粉酶和脂酶是特別優選的。
本發明的洗滌劑組合物可利用通過上述方法獲得的本發明的堿性纖維素酶變異體，結合上述的洗滌劑組分通過常規方法制備。洗滌劑的形式可根據使用的目的進行選擇。其可以，例如，液體，粉末，顆粒，糊劑或固體形式提供。
如此獲得的本發明的洗滌劑組合物可用于洗衣店粉狀洗滌劑，洗衣店液體洗滌劑，自動洗盤劑或棉纖維修飾洗滌劑。
實施例實施例1堿性纖維素酶基因變異體的制備首先，在使所述堿性纖維素酶產量提高的情況下，為了獲得堿性纖維素酶變異體，在堿性纖維素酶基因區域通過Error-Prone PCR方法進行了隨機誘變，由此構建了變異體文庫。從所獲得的變異體中篩選能有效地改善堿性纖維素酶產量的變異體。通過核苷酸測序確定突變位點后，利用合適的引物在突變位點進行隨機誘變或定點誘變來構建多重突變的變異體。將來自芽孢桿菌種的菌株KSM-S237的堿性纖維素酶基因引入質粒pHY300PLK中作為模板DNA。
所用的隨機誘變混合引物是Ile16X(引物1，SEQ.ID.NO3，X表示另一種氨基酸)，Phe39X(引物2，SEQ.ID.NO4)，Ile76X(引物3，SEQ.ID.NO5)，Met109X(引物4，SEQ.ID.NO6)，Phe263X(引物5，SHQ.ID.NO7)，Thr308X(引物6，SEQ.ID No8)，Asn462X(引物7，SEQ.ID.NO9)，Lys466X(引物8，SEQ.ID.NO10)，Val468X(引物9，SEQ.ID.NO11)，Ile552X(引物10，SEQ.ID.NO.12)，Ile564X(引物11，SEQ.ID.NO13)和Ser608X(引物12，SEQ.ID.NO14)。
用于引入定點突變的引物是，Leu10Gln(引物13，SEQ.ID.NO15)，Ser22Pro(引物14，SEQ.ID.NO16)，Asn33His(引物15，SEQ.ID.NO17)，Phe39Ala(引物16 SEQ.ID.NO18)，Met109Ile(引物17，SEQ.ID.NO19)，Gln242Ser(引物18，SEQ.ID NO20)，Gln242Ala(引物19，SEQ.ID.NO21)，Gln242Phe(引物20，SEQ.ID.NO22)，Gln242Val(引物21，SHQ.ID NO23)，Gln242Asp(引物22，SEQ.ID.NO24)或Gln242Glu(引物22，SEQ.ID.NO24)，Gln242Gly(引物23，SEQ.ID NO25)，Gln242Ile(引物20，SEQ.ID.NO22)，Gln242Thr(引物24，SEQ.ID.NO26)，Gln242Leu(引物25，SEQ.ID NO27)，Gln242Met(引物26，SEQ.ID.NO28)，Gln242Tyr(引物27，SEQ.ID.NO29)，Phe263Ile(引物28，SHQ.ID NO30)，Thr308Ala(引物29，SHQ.ID.NO31)和Ile552Met(引物30，SEQ.ID.NO32)。
具體地，將0.5μL(10ng)模板DNA質粒，20μL(1μM)引入突變的引物，20μL(1μM)反義引物，10μL×10PCR緩沖溶液，8μL10mM脫氧核苷三磷酸(dNTP)混合物，0.5μL(2.5單位)of＂Pyrobest DNA聚合酶＂(Takara生產)和39.5μL去離子水進行混合后，用＂Gene Amp PCR系統9700＂(Amesham-Pharmacia生產)進行PCR。所述的反應條件是94℃2min，接下來在94℃1min進行30個循環，56℃1min，72℃30sec，最后72℃1min。將所得的PCR產物經＂GFX PCR DNA和Gel Band純化試劑盒＂(Amesham-Pharmacia)純化后，向所述溶液中加入5.5μL×10磷酸化緩沖液和1μL(10單位)多核苷酸激酶，在37℃下溫育1小時(50μL)。將25μL磷酸化的PCR產物與2μL(20ng)模板質粒，10μL×10PCR緩沖液，8μL10mM dNTP混合物，1μL(5單位)的＂Pyrobest DNA聚合酶＂和54μL去離子水相混合，進行PCR。反應條件是94℃2min，接下來在94℃1min進行30個循環，60℃1min，72℃6min，最后在72℃下12min。
將所得的PCR純化(43.5μL)。然后加入5.5μL×10磷酸化緩沖液和1μL(10單位)多核苷酸激酶，在37℃下磷酸化1小時。乙醇沉淀所得的混合物。收集所得的DNA溶液(10μL)用連接試劑盒ver.2(Takara生產)在16℃下連接18小時，然后再用乙醇沉淀，由此收集DNA混合物。
實施例2用5μL由實施例1中獲得的DNA混合物，將所述的DNA引入枯草芽孢桿菌菌株ISW1214，參見Chang和Cohen(Mol.Gen.Gent.，168，111-115，1979)，由此獲得相應的轉化體。具體說來，將枯草芽孢桿菌菌株ISW1214在50mL LB培養基中于37℃下振蕩培養2小時(在600nm下的吸光值0.4)，室溫下離心分離(7000rpm 15min)收集細胞，懸浮于5mL SMMP
。向所得的懸浮液中加入500μL溶于SMMP溶液的溶菌酶溶液(30mg/mL)，將所得的溶液在37℃下溫育1小時。然后在室溫下離心分離(2800rpm，15min)收集原生質體，將其懸浮于5mL SMMP中制成原生質體溶液。向0.5mL原生質體溶液中加入10μL質粒溶液和1.5mL 40％(w/v)聚乙二醇(PEG8，000，Sigma)。緩慢地攪拌所得的混合物。在室溫下放置2min后，將所得的混合物與5mL SMMP溶液混合。在室溫下離心(2800rpm15min分離)，收集原生質體，再次懸浮于1mL SMMP溶液中。將所得的原生質體懸浮液在37℃振蕩90min(120rpm)，然后涂布到含四環素(15μg/mL，Sigma)的DM3再生瓊脂培養基中
在30℃下溫育72小時以得到轉化體。在DM3再生瓊脂培養板上形成的帶有暈圈的轉化體于30℃下在含有四環素(15μg/mL)的聚胨培養基中振蕩培養15小時。收集細胞，提取質粒并通過＂Micro Prep質粒純化試劑盒＂(Amesham-Pharmacia生產)純化。
實施例3核苷酸序列的確定用＂377DNA測序儀＂(Applied Biosystems生產)確定由實施例2獲得的質粒中插入的所述纖維素酶基因的核苷酸序列。
實施例4纖維素酶變異體產量的評估在含有3％(W/v)＂Polypepton S＂(Nihon Pharmaceutical生產)，0.5％魚肉抽提物(Wako Pure Chemicals)，0.05％酵母抽提物，0.1％磷酸二氫鉀，0.02％7水合硫酸鎂，四環素(15μl/mL)和5％麥芽糖的培養基(PSM培養基)中于37℃條件下培養72小時。
分析每一纖維素酶變異體培養物上清液中的活性。假定單位體積培養物中的重組的野生型纖維素酶的產量為100％，下述堿性纖維素酶變異體的產量分別為Leu10Gln是120％，Ile16Asn 139％，28Ser22Pro140％，Asn33His 105％，Phe39Ala 113％，Ile76His 112％，Met109Leu112％，Gln242Ser 125％，Phe263Ile 137％，Thr308Ala 102％，Asn462Thr116％，Lys466Leu 110％，Val468Ala 122％，Ile552Met 132％，Ile564Val113％，和Ser608Ile 110％。所述雙突變體的產量為Leu10Gln+Ser22Pro是117％，Asn33His+Phe39Ala 118％，Ser22Pro+Gln242Ala207％，Ser22Pro+Gln242Phe 196％，Ser22Pro+Gln242Val187％，Ser22Pro+Gln242Ser 175％，Ser22Pro+Gln242Ile174％，Ser22Pro+Gln242Gly 160％，Ser22Pro+ Gln242Glu158％，Ser22Pro+Gln242Asp 145％，Ser22Pro+Gln242Thr134％，Ser22Pro+Gln242Leu 128％，Ser22Pro+Gln242Met125％，Ser22Pro+Gln242Tyr是115％。三重變異體Leu10Gln+Ser22Pro+Gln242Ser的產量為162％，Ile16Asn+Ser22Pro+Gln242Ser為107％。四重變異體Leu10Gln+Ser22Pro+Ile76His+Lys466Leu的產量為113％，四重變異體Leu10Gln+Ile16Asn+Ile76His+Gln242Ser+Lys466Leu的產量為163％，從而表現出產量上的提高。
對結果的分析表明在大多數變異體中產量的提高是由于分泌的蛋白的量的提高。在242位發生取代的變異體表現出對作為底物的羧甲基纖維素酶(CMC)比活性提高。具體說來，假定野生型酶的比活性為100％，Gln242Ala的比活性為147％，Gln242Val 150％，Gln242Ser125％，Gln242Phe 128％，Gln242Asp 107％，Gln242Glu 106％，Gln242Gly105％，從而表現出相對比活性的提高。而且，在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8)中也表現出比活性提高。例如，Gln242Ala的比活性是150％，Gln242Ser 110％，Gln242Val 123％，Gln242Phe 110％，Gln242Asp108％，Gln242Glu 114％，從而表現出相對比活性的提高。通過＂蛋白分析試劑盒＂(Bio-Rad生產)以牛血清白蛋白作為標準蛋白測定了上述蛋白的含量。
<纖維素酶試驗(3，5-二硝基水楊酸(DNS)方法)>
向由0.2mL 0.5M甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0)，0.4mL2.5％(w/v)羧甲基纖維素(A01MCNippon Paper Industries)，和0.3mL去離子水組成的反應混合物中加入0.1mL經適當稀釋的酶溶液。在所得混合物于40℃溫育20min后，向其中加入1mL二硝基水楊酸試劑(0.5％二硝基水楊酸，30％羅謝爾鹽，1.6％氫氧化鈉)沸水浴5min使還原糖顯色。在冰水中淬滅后加入4mL去離子水，測定在535nm下的吸光值以確定還原糖的產量。以類似的方式進行空白實驗，只是在沸水浴中溫育即將開始前加入酶溶液。將在上述反應條件下1min內產生相當于1μmol葡萄糖的還原糖的蛋白量作為1個酶活性單位(1U)。
實施例5制備具有下述組分的由A-1顆粒，C-1顆粒和日本專利
發明者袴田佳宏, 澤田和久, 遠藤圭二, 児玉裕司, 和田恭尚, 四方資通, 小林徹 申請人:花王株式會社