專利名稱：一種人白細胞介素29的變異體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種畢赤酵母制備重組人白細胞介素四變異體的方法及其重組工程菌。屬于生物工程領域。
背景技術：
人白細胞介素^(interleukin 29，IL-29)是近年發現的一種新的細胞因子， 其結構和功能與I型干擾素(interferon，IFN)相似，因此又稱為IFN-λ 1 (Sh印pard P， Kindsvogel W, Xu W, et al. (2003)IL-28, IL_29and tneir class II cytokine receptor IL-28R. Nature Immunol. 4(1) :63-68 ；Kotenko SV,Gallagber G,Baurin W,et al. (2003) IFN-Xs mediate antiviral protection through a distinct class II cytoKine receptor complex. Nature Immunol.4 (1) :69-77)。人IL-四基因定位于19號染色體長臂(19ql3. 13)，包含5個外顯子，其基因結構與IL-IO家族成員的基因結構相似，但與I型干擾素的基因結構(只含一個外顯子) 有明顯差異(Onoguchi K, Yoneyama M, Takemura A, et al. (2007)Viral infections activate types I and III interferon genes through a common mechanism. J Biol Chem. 282 (10) :7576-7581)。IL-29 的 mRNA 全長 856bp，其開放讀碼框為 603bp,編碼的蛋白質肽鏈含200個氨基酸殘基，肽鏈氨基端的19個氨基酸殘基構成信號肽序列，因此，人 IL-29的成熟肽是含181個氨基酸殘基的多肽鏈。IL-四基因表達盒中啟動子的結構與I 型干擾素的非常相似，都包含與干擾素啟動子結合蛋白3、干擾素啟動子結合蛋白7的結合位點以及至少有ー個功能性的核因子κ B結合位點。人IL-四通過與細胞膜上的受體復合物結合，起始信號的轉導和發揮生物學作用。IL-四和IL-觀共用ー個由ILj8Rl和IL-10R2組成的異ニ聚體受體復合物，其中 IL-28R1為結合亞基，IL-10R2為輔助亞基。ILj8Rl是IL-四和IL-28的共用受體中所特有的結合亞基，對IL-29的細胞應答具有特異性，輔助亞基IL-10R2也是I型干擾素、 IL-10、IL-22和IL-26的受體組成部分，其在造血和非造血細胞中普遍表達，對IL-29的細胞應答無特異性(Witte K, Gruetz G, Volk HD, et al. (2009)Despite IFN-Iambda receptor expression, blooa immune cells, but not keratmocytes or melanocytes, have an impaired response to type III interferons implications for therapeutic applications of these cytokines. Genes Immun. 10(8) :702-714)。人IL-29與I型干擾素共享相同的Jak-STAT信號傳導途徑，激活相同的 Jak-STAT (janus kinase-signal transducer of transcription)信號轉導途徑，促進 ー組共同的基因表達。IL-四首先與其受體復合物形成II28R1-IL29-IL10R2三元絡合物，然后通過定位在細胞內的兩條受體鏈轉導信號，啟動信號級聯反應，使STAT1、STAT2、 STAT3、STAT4和STAT5的酪氨酸殘基磷酸化，然后促使ISGF3 (干擾素刺激基因幻進入細胞核與ISRE (干擾素刺激應答元件)相互作用，從而產生效應(Zhou Ζ, Hamming 0J, Ank N, et al. (2007)Tvpe III interferon (IFN) induces a type I IFN-Iike responsem a restricted subset of cells througn signaling pathways involving both the Jak-STAT pathway and the mitogen-activated protein kinases. J Virol. 81 (14) 7749-7758)。因此，IL-四表現出ー些與I型干擾素相同的性質，如抗病毒、抗增殖、體內抗腫瘤以及免疫調節等生物學活性。研究發現，人體表達ILjSRl的細胞譜系較少，人體不同器官的ILjSRl表達水平有明顯差異。在胃腸道、呼吸系統、心臟和ー些腺體細胞的IL-28R1高水平表達，而大腦細胞表達水平最低(Katrin W,Ellen ff,Robert S，et al. (2010) IL-28A，IL-28B，and IL-29 Promising cytokines with type I interieron-like properties.しytokine & wowth Factor Reviews. 21 (4) :237-251)。這種受體分布的組織差異性，提示IL-四的生物學作用具有較獨特的細胞靶向性，即IL-四作用的靶細胞呈局限性，由此可避免IL-四對多種細胞產生廣泛的生物學效應，從而有效的降低毒性作用。已有研究表明，對IL-28B肽鏈中的氨基酸殘基進行誘變，可使IL-28B變異體的抗病毒活性發生顯著改變(Gad HH, Dellgren C，Hamming 0J, et al. (2009) Interferon{lambda}is functionally an interferon but structurally related to the interleukin-lOfamily. J. Biol. Chem. 284,20869-20875)。由于 IL-28B 與 IL-29 的同源性高達81%，而且兩者共用相同的受體，由此提示IL-四變異體具有潛在的臨床應用前景，有希望研制開發出臨床療效高而副作用比I型干擾素更小的新一代干擾素藥物。

發明內容
本發明的目的是提供ー種利用酵母表達重組人IL-四變異體(hILj9t)的制備方法及其酵母工程菌。本發明提供的技術方案如下(1)本發明的第一方面，提供ー種hIL-四變異體的重組真核表達載體，該載體是將pPIC9KM(源于hvitrogen公司，經本實驗室改造并已申請專利，申請號為 201110410391.0)與本發明所述的hIL-四變異體編碼基因(SEQ ID No :1)經過重組而獲得，該重組真核表達載體為pPIC9KM-hILj9t，如圖1所示；該重組載體表達的產物是肽鏈中有2個氨基酸殘基發生突變的hIL-四變異體(SEQ ID No 2)；而且，本發明將pPIC9KM 的α因子中的限制性內切酶》ιο I識別位點CTC GAG與蛋白酶Kex2的識別位點GAG AAA AGA (編碼產物為Glu-Lys-Arg)，通過PCR方法引入hIL-四變異體編碼基因(SEQ ID No 1)的氨基端，使該重組真核表達載體表達的hIL-四變異體(SEQ ID No:2)的肽鏈不會因引入限制性內切酶位點而增加額外的氨基酸殘基。(2)本發明的第二方面，提供一種表達人IL-四變異體的重組酵母工程菌GS115/ hILj9t，該工程菌是畢赤酵母GS115anvitrogen公司)被本發明所述的重組真核表達載體pPIC9KM-hIL-29t轉化而獲得，而且pPIC9KM中的信號肽基因序列與hIL-四變異體的編碼基因均已整合到該工程菌的基因組中，因此該工程菌可分泌性表達hIL-四變異體至培養液中。(3)本發明的第三方面，提供一種制備hIL-四變異體肽的方法，該方法包括以下步驟a)培養上述重組酵母工程菌，于培養液中添加0.5 (ν/ν)的甲醇為誘導劑，誘導重組酵母工程菌表達hIL-四變異體；b)離心培養液去除菌體和不溶物，收集培養液上清經過超濾濃縮和透析除鹽處理；c)除鹽后的培養上清用強陽離子交換層析柱分離純化培養液中的hIL-四變異體，收集含有hIL-四變異體的洗脫液；d)將含有hIL-四變異體的洗脫液用分子篩層析方法進ー步純化；e)用SDS-PAGE和Western blotting方法分析鑒定純化的hIL-四變異體。


圖1為重組真核表達質粒pPIC9KM-hIL_29t的構建圖譜圖2為人IL-四變異體編碼基因的PCR擴增結果圖3為重組真核表達質粒pPIC9KM-hIL_29t的雙酶切鑒定結果圖4為純化的重組hIL-四變異體的SDS-PAGE檢測結果
具體實施例方式以下結合具體實施例，進ー步闡述本發明的操作方法，這些實施例僅用于詳細說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。下述實施例中，所有PCR引物的合成和DNA序列的測定均由上海生エ生物工程技術服務有限公司完成；所用的培養基如無特別說明均按畢赤酵母表達手冊anvitrogen公司)的配方進行配制。實施例一、人IL-四變異體編碼基因的克隆1.設計和合成PCR引物根據GenBank中的人IL-四基因序列和pPIC9KM載體的α因子信號肽序列，用 Oligo 7軟件設計ー對特異性引物如下上游引物5，-CTCGAGAAAAGAGGCCCTGTCCCCACTTCC-3，下游引物5，-GCGGCCGCTCAGGTGGACTCAGGGTGG-3’；在上游引物中加入了限制性內切酶Bio I識別位點(CTCGAG)和蛋白酶Kex2的識別位點(GAGAAAAGA，編碼產物為Glu-Lys-Arg)，下游引物中加入了 Not I位點(GCGGCCGC)， 擴增產物的大小約560bp。2.人IL-四變異體編碼基因的克隆用RNA提取試劑Trizol(BBI公司)按說明書操作，從健康中國人外周血單個核細胞(PBMC)提取細胞總RNA ；取提取的總RNA IyL作為模板，用反轉錄試劑盒(TaKaKa 公司)按說明書操作，經反轉錄擴增得到IL-四前體的cDNA ；反轉錄結束后，取反應液 5μ L作為模板，用上述特異性引物進行PCR擴增IL-四變異體的編碼基因，反應條件如下 940C 2min,94°C 30s — 58°C 30s — 72°C lmin,30 個循環，最后 72°C延伸 lOmin。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖2所示；用EZ-10柱式DNA回收試劑(BBI公司)回收純化約560bp的目的基因片段；將純化的目的基因片段于克隆載體pUCm-T(BBI公司)相連，構建為重組質粒并命名為pUCmj9t ；將重組質粒pUCm-29t轉化感受態大腸桿菌JM109， 接種于含IPTG和X-gaL的氨芐青霉素LB培養板，37°C培養16h，挑取陽性菌落接種液體LB培養基擴增，提取重組質粒進行測序，測序結果如SEQ ID No:l所示。測序結果經DNAMAN 軟件分析并與GenBank中的人IL-29的cDNA序列進行比對，結果顯示重組質粒pUCm_29t 中的目的基因有2個堿基發生變異，這2個發生變異的堿基分別是第91位堿基由T (胸腺嘧啶)突變為C (胞嘧啶)，由該堿基組成的三聯體密碼由TTC突變為CTC，該三聯體密碼編碼的第31位氨基酸殘基由苯丙氨酸(Wie)突變為亮氨酸(Leu)；第272位堿基由T(胸腺嘧啶)突變為C (胞嘧啶)，由該堿基組成的三聯體密碼由CTG突變為CCG，該三聯體密碼編碼的第91位氨基酸殘基由亮氨酸(Leu)突變為脯氨酸(Pro)，如SEQ ID No 2所示。實施例ニ、構建表達人IL-四變異體的重組真核表達載體取質粒pUCm_29t和載體pPIC9KM(源于hvitrogen公司，經本實驗室改造并已申請專利，申請號為:201110410391. 0)分別用限制性內切酶Xho I和Not I進行雙酶切，回收約560bp的目的基因片段和載體pPIC9KM的大片段，用T4DNA連接酶(BBI公司)于16°C 水浴連接16h，將連接產物轉化感受態大腸桿菌JM109，接種于含卡那霉素的LB培養板， 37°C培養過夜，挑取陽性菌落接種液體LB培養基擴增，提取重組真核表達質粒并命名為 pPIC9KM-hIL-29t ；用Xho I和Not I對重組真核表達質粒pPIC9KM_hIL_29t進行雙酶切鑒定，同時進行測序鑒定，雙酶切鑒定結果如圖3所示，酶切出的大片段和小片段分別與載體 pPIC9KM和目的基因的大小相符合，測序結果證實pPIC9KM-hIL-29t中的人IL-四變異體的編碼基因序列與pUCmj9t中的完全一致。實施例三、重組真核表達質粒轉化酵母GS115及其高拷貝重組工程菌的篩選提取經測序鑒定的pPIC9KM-hILj9t，用限制性內切酶Ml I酶切后，用0. 7%的瓊脂糖凝膠電泳分離并回收線性化的pPIC9KM-hIL-29t ；將線性化的pPIC9KM_hIL_29t與酵母GS115感受態細胞混合后，按照畢赤酵母表達手冊anvitrogen公司)的方法進行電轉化。將轉化產物涂布于不含His的MD培養板，30°C培養2 3天，挑選MD平板上生長旺盛的優勢菌落接種于含0. 5mg/mL G418的YPD平板，30°C培養2 3天，挑選生長旺盛的優勢菌落接種于含lmg/mL G418的YPD平板，30°C培養2 3天，如此重復培養并依次増加 G418濃度至％ig/mL，從含％ig/mL G418的YPD平板篩選得到高拷貝整合的畢赤酵母重組エ 程菌 GS115/hIL-29t。實施例四、人IL-四變異體的誘導表達、純化及分析將重組工程菌GS115/hIL-29t接種BMGY培養基，于30°C、250rpm/min條件下振蕩培養至菌液0D600為2 3吋，轉換為BMMY培養基繼續培養，每隔24h加入終濃度為1 % 的甲醇誘導表達，連續培養96h，離心收集培養上清，先用SDS-PAGE檢測培養上清中hIL-四變異體的表達情況，然后用羊抗人IL-四多克隆抗體(R&D公司)進行Western blotting 鑒定表達的hIL-四變異體。將培養上清先用截流分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再用 SP-Sepharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G-75凝膠過濾層析純化，純化產物經 SDS-PAGE檢測和Wfestern blotting鑒定，SDS-PAGE結果顯示純化的重組hIL-四變異體為單ー蛋白條帶，其分子量為20kDa，如圖4所示；Western blotting結果顯示單一反應條
市ο
權利要求
1.一種人白細胞介素四變異體的重組真核表達載體，其特征在干，所述的重組真核表達載體中插入了人白細胞介素四變異體的編碼基因。
2.如權利要求1所述的重組真核表達載體中的人白細胞介素四變異體的編碼基因，其 DNA的核苷酸序列對應于序列表中的SEQ ID NO :1，該序列中第91位堿基由T (胸腺嘧啶) 突變為C(胞嘧啶)，由該堿基組成的三聯體密碼由TTC突變為CTC ；該序列中第272位堿基由T(胸腺嘧啶)突變為C(胞嘧啶)，由該堿基組成的三聯體密碼由CTG突變為CCG。
3.如權利要求1所述的重組真核表達載體中的人白細胞介素四變異體的編碼基因， 其編碼產物的氨基酸序列對應于序列表中的SEQ ID NO :2，該序列中第31位氨基酸殘基由苯丙氨酸(Wie)突變為亮氨酸(Leu)、第91位氨基酸殘基由亮氨酸(Leu)突變為脯氨酸 (Pro)。
4.ー種重組畢赤酵母工程菌，其特征在干，所述的重組畢赤酵母的染色體中整合有權利要求1所述的人白細胞介素四變異體的編碼基因，并且分泌表達重組人白細胞介素四變異體至培養液中。
5.一種制備重組人白細胞介素四變異體的方法，其特征在干，包括步驟(1)用適當的培養液，培養權利要求4所述的重組畢赤酵母工程菌；(2)在培養液中添加適當的誘導劑，誘導重組畢赤酵母工程菌分泌表達重組人白細胞介素四變異體；(3)從培養液中分離純化出重組畢赤酵母分泌表達的重組人白細胞介素四變異體。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在干，步驟(1)所用的培養液為BMGY培養液和 BMMY培養液；步驟(2)所用的誘導劑為甲醇，添加甲醇的終濃度為培養液體積的0. 5 1%; 步驟(3)所用的分離純化方法為先用強陽離子型離子交換層析分離培養液中的重組人白細胞介素四變異體，再用凝膠過濾層析得到純化的重組人白細胞介素四變異體。
全文摘要
本發明提供了一種重組人白細胞介素29(hIL-29)變異體的制備方法及表達重組hIL-29變異體的畢赤酵母工程菌。本發明的具體制備方法包括以下步驟1)人工合成引物；2)從健康人外周血單個核細胞經反轉錄PCR得到hIL-29變異體的編碼基因；3)構建含有hIL-29變異體編碼基因的重組真核表達載體，融合于畢赤酵母表達調控元件獲得重組畢赤酵母工程菌；4)培養重組畢赤酵母工程菌，于培養液添加甲醇誘導畢赤酵母工程菌表達重組hIL-29變異體；5)采用離子交換層析和分子篩層析從培養液上清純化重組hIL-29變異體。本發明構建的重組畢赤酵母工程菌可進行高密度培養并且分泌型表達重組hIL-29變異體，適用于工業化制備重組人白細胞介素29變異體。
文檔編號C12N1/19GK102559737SQ201110413170
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月13日 優先權日2011年12月13日
發明者于明磊, 吳靜, 鄔敏辰, 郁心, 鄭海軍, 陸源, 陳偉 申請人:江南大學