專利名稱：制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法
技術領域：
本發明涉及一種通過共同培養無菌松樹芽苗和松口蘑菌(Tricholoma matsutake)制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法。更具體地，本發明涉及通過將無菌的松樹芽苗與松口蘑分離菌菌絲體一起培養，而只用松口蘑菌選擇性感染松樹芽苗根部的方法。
背景技術：
松口蘑菌是屬于擔子菌亞綱(Basidiomycotina)傘菌目(Agaricales)白蘑科(Tricholomataceae)的真菌，其天然生長于包括赤松(Pinus densiflora)、偃松(Pinus pumila)、歐洲云杉(Piceaabies)和魚鱗云杉(Picea jezoensis)的針葉林中。特別地，在韓國，已知該真菌只生長于松樹林中。在韓國和日本，松口蘑菌是最受歡迎的食用菌之一，特別是在韓國東部沿海地區，其是主要的經濟來源。該真菌發出獨特的香味，該香味的芳香成分包括1-辛烯-3-醇、2-辛醇、1-辛烯和4-甲基肉桂酸。寄生于活樹根部的食用真菌松口蘑，主要寄生在松樹(例如，赤松)的細根上，與樹共生并形成外生菌根。然而，還沒有該外生菌根的真菌形成體外的子實體的報道。韓國的一個研究小組試圖通過將松樹芽苗移植到松口蘑真菌的蘑菇圈周圍的土壤中這種傳統方法來產生體外由其感染的松樹，但是結果并不令人滿意。(TS Kim，GH Ga，H Park，YC Park，GH Yoon和GY Lee，1999，體外培養松口蘑和其產量的提高(In vitro cultivation of T.matsutake and increase of itsproduction yield)，韓國森林研究協會出版(Publications published bythe Korean Forest Research Institute)Vol.15313-16)。茨城地方林業中心(Ibaraki Prefectural Forestry Center)報道了在赤松的芽苗上成功形成松口蘑真菌外生菌根(Akiyoshi Yamada，Ken Maeda和Masatake Ohmasa，1999，體外松口蘑分離菌在赤松芽苗上的外生菌根的形成(Ectomycorrhizal formation of Tricholoma matsutake isolateson seedling of Pinus densiflora in vitro，真菌科學(Mycoscience)40455-463)。
由于該真菌是活樹的根部寄生菌，所以體外很難形成松口蘑真菌的子實體(蘑菇)。鑒于此，傳統上培養松口蘑為簡單控制影響松口蘑發育的環境因素，例如，濕度、光強度、溫度等。即，通過一系列野外作業包括灌溉、移走落葉和用杯狀物覆蓋蘑菇，獲得適于松口蘑發育的環境。這種培養方法可以顯著提高蘑菇產量，但是其應用只限于松口蘑天然存在的地方。更具體地，這種培養蘑菇方法的例子包括如下首先，將培養的松口蘑菌絲體播撒于存在松口蘑的田地中，接著，新形成的菌絲體移植入土壤中；第二，從松口蘑菌的子實體收集孢子并播撒于存在松口蘑的田地中；第三，將含有活的松口蘑菌絲體的土壤播撒于沒有生長松口蘑的地方的田地中。通過上述方法移植的松口蘑真菌沒有長成真菌菌落是由于其菌絲體生長速率比細菌和其它絲狀真菌低，由于雨或土壤狀況導致松口蘑真菌丟失而松樹根部卻沒有感染該真菌。
另外，松口蘑可以通過將松樹芽苗種植于松口蘑蘑菇圈周圍的土壤中來培養，所述蘑菇圈天然形成于松樹周圍。使芽苗生長幾年，然后將得到的松樹移植到沒有生長松口蘑的田地中。然而，這種方法使種植的松樹芽苗在感染松口蘑菌之前，感染并生長了天然存在于該田地中的許多其它相似真菌。而且，鑒定生長的真菌需要復雜的實驗技術。因此，沒有高產量地獲得感染松口蘑菌的松樹。

發明內容
基于松口蘑菌絲體滲入松樹根部并且該真菌與松樹共生的事實，本發明人通過將無菌松樹芽苗與松口蘑分離菌體外共同培養，選擇性感染松樹根部。
因此，本發明的一個目的是提供一種制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法。
上述目的通過如下方法實現將松口蘑菌KBFERI 20T05接種于滅菌的培養容器中，所述松口蘑菌分離自液體培養于PDB培養基(馬鈴薯葡萄糖液體培養基(Potato Dextrose Broth)，Difco)的天然存在的松口蘑的子實體；將珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼(sphagnum peatmoss)的土壤混合物及K-液體培養基放置于接種的真菌上；將松樹子在無菌狀態下發芽產生的無菌芽苗種植入混合土壤中；然后將松樹芽苗與松口蘑菌一起培養以在松樹芽苗的細根上形成外生菌根。


從下列詳細描述并結合所附附圖將更清楚理解本發明的上述和其它目的、特征、和其它優點。其中圖1為顯示松口蘑真菌KBFERI 20T05液體培養結果的照片，所述松口蘑真菌KBFERI 20T05分離自天然存在的松口蘑；圖2為在無菌下發芽的松樹芽苗的照片；圖3為插入紙杯的培養容器的照片；圖4為顯示用于共同培養無菌松樹芽苗和松口蘑分離菌的感染培養基的組合物的照片；圖5為被松口蘑分離菌菌絲體感染的幼松樹的照片；圖6為根部形成外生菌根的松樹的細根照片，其中在立體顯微鏡下觀察細根；圖7為滲入松樹芽苗細根的松口蘑菌絲體的照片，其中在光學顯微鏡下觀察菌絲體；圖8為滲入松樹芽苗細根的松口蘑菌絲體的照片，其中在熒光顯微鏡下觀察菌絲體；和圖9為當根部具有菌絲體的松樹的一根細根培養于PDA培養基上時，松口蘑菌絲體生長于PDA固體培養基上的照片。
具體實施例方式
本發明涉及通過將松樹芽苗和松口蘑菌的子實體共同培養來制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法，該方法包括如下步驟制備能夠含有感染培養基的培養容器；將松口蘑菌KBFERT 20T05的子實體接種到培養容器中；制備用于松樹芽苗生長的混合土壤和K-液體培養基以提供感染培養基；將松樹芽苗種植到該感染培養基中。
具體地講，本發明提供了通過共同培養無菌松樹芽苗和松口蘑菌制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法，該方法包括以下步驟將真菌菌絲體以0.01-0.02mg干重/mL無菌水的量接種于滅菌的培養容器底部，該真菌菌絲體通過將液體培養于PDB培養基的松口蘑菌的子實體粉碎獲得；將珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼以80∶1-2的比率混合并將得到的混合土壤放置于接種的真菌菌絲體上；制備K-液體培養基，調整培養基的pH至5.5-5.6并將K-液體培養基平分至混合土壤上，所述K-液體培養基為每升水中含有1.65g NH4NO3，0.2g KNO3，0.002g CaCl2·2H2O，0.02g KCl，0.2g KH2PO4，0.9g MgSO4·7H2O，0.2g (NH4)2HPO4，0.5g NH4-Tar，0.5mlFe-Cit，0.031g H3BO3，0.01516g MnSO3·4H2O，0.0086g ZnSO4·7H2O，0.00083g KI，0.00025g Na2MoO4·2H2O，100μg鹽酸硫胺，1.0g麥芽提取物，0.5g酵母提取物，0.3g酪蛋白和3.0g葡萄糖；在無菌條件下，使松樹子發芽至3cm長，將得到的無菌芽苗種植到含有混合土壤和K-液體培養基的感染培養基上，并用蓋子覆蓋培養容器；將松樹芽苗和松口蘑菌在10-40,000勒克斯(lux)光強度下于15-25℃共同培養24小時。
以下將更詳細描述本發明的方法。
步驟1含有感染培養基的培養容器的制備和滅菌首先，制備用于共同培養松樹芽苗和松口蘑菌的含有感染培養基的培養容器，并在1.2個大氣壓下，121℃高壓滅菌20分鐘。培養容器應該由在滅菌過程中不改變和熔化的材料制成，并且在共同培養過程中，也不受微生物感染的攻擊。
另一方面，培養容器優選由生物可降解材料制備。然而，當將被松口蘑真菌感染的松樹以放置于生物可降解的培養容器中的形式種植于田地中時，這種材料需很長時間才生物降解。因此，優選制備同時考慮到共同培養和移植到田地因素的培養容器。在這點上，在本發明中，當進行共同培養時，使用的培養容器內部具有紙杯，當感染了真菌菌絲體的松樹芽苗移植到田地中時，丟棄紙杯。優選，參見圖3，可商購獲得的紙杯(相當小型的杯子)緊密插入培養容器的內部但不暴露于培養容器的上部分，并且培養容器用透明蓋子覆蓋。盡管滅菌和培養中，紙杯的外形可發生變化，但是由于紙杯在共同培養至移植到田地中的過程中，保持其內含物不改變，并且，幾乎不影響松樹芽苗和松口蘑菌絲體的生長，因而紙杯是有用的。更優選在高壓滅菌后，可以立即將培養容器在超凈臺上暴露于紫外光下進一步滅菌。
步驟2將液體培養的松口蘑菌KBFERI 20T05接種于感染培養基中獲自天然存在的松口蘑的松口蘑菌KBFERI 20T05均勻分布地接種于步驟1制備的滅菌的培養容器的底部。
優選使用來自松口蘑蘑菇子實體的松口蘑分離菌作為接種體，其中已鑒定所述松口蘑分離菌與常規已知的松口蘑菌具有DNA序列同源性，而不使用常規已知或通過外觀或感官評價方式鑒定的松口蘑菌。因此，本發明應用的松口蘑菌KBFERI 20T05與常規已知松口蘑菌的Gene Bank登記的ITS區、5.8S整個區域和18S的一部分的DNA序列具有超過99％的同源性。該真菌KBFERI 20T05的DNA序列已在Gene Bank登記。松口蘑分離菌KBFERI 20T05培養于PDB培養基(Difco)中。得到的菌絲體團以K-液體培養基(pH 5.6)洗滌，以滅菌網孔過濾，并于K-液體培養基中利用Waring氏可高壓滅菌的攪拌器31L91粉碎為精細顆粒，所述培養基按照如下表1列出的組成制備。然后，將粉碎的菌絲體轉移至超凈臺，并且，在打開培養容器后，利用10ml玻璃吸液管均勻接種于滅菌的培養容器底部。接種的菌絲體生長成為多層菌落，這種生長形式增加了松樹芽苗的細根與松口蘑真菌的接觸。在這里，優選利用攪拌器將菌絲體團粉碎得非常精細。此外，由于在粉碎過程中產生的熱對松口蘑菌絲體的生長產生不利的影響，優選粉碎過程使用，例如，放置于冰箱中預冷的5℃以下的K-液體培養基進行。真菌菌絲體與5ml K-液體培養基以0.05-0.10mg干重的量接種。接種體的干重通過以下方法進行計算將5ml含有粉碎的真菌菌絲體的K-液體培養基放置于小的容器中，使之干燥，將得到物稱重并減去濾紙重量，然后重復上述方法20次，并將得到的重量值平均。接種量極大地影響松樹芽苗細根與松口蘑菌絲體的接觸。增加真菌菌絲體的接種量，將提高它們與松樹芽苗根部的接觸。然而，由于松口蘑真菌在較高濃度接種時，其菌絲體生長率較低，因此認為上述的接種量是合適的。
另一方面，為了提高松口蘑菌絲體與松樹芽苗細根的接觸，可以在培養容器的底部加入pH5.5-5.6的K-固體培養基。
所述K-固體培養基的組成列于如下表1。通常，植物體外培養的最佳pH值約為5.7-5.8，松口蘑真菌的最佳pH約為5.4。為了提供適于這兩種共同培養生物的環境，調整K-固體培養基的pH至5.5-5.6。另外，通常在液體培養基中松口蘑的真菌增殖速度慢，因此，為了提高松口蘑真菌的生長率，放置于培養容器底部的K-固體培養基含有高的碳源。為了在短時間內增加松口蘑菌生物團，并且完全消耗K-固體培養基中的高的碳源，將最少量的K-固體培養基等分至培養容器的底部，優選，厚度小于2cm，更優選，0.5mm。當使用高濃度的K-固體培養基時，松口蘑菌僅僅利用存在的高濃度的碳源繼續生長而不滲入松樹芽苗的細根中，結果在松樹根部不形成外生菌根。
表1

步驟3利用混合土壤和K-液體培養基制備感染培養基為了培養松樹芽苗，將珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼的混合物及K-液體培養基傾倒于步驟2中的接種的松口蘑菌絲體上，其中K-液體培養基用于防止松樹芽苗由于干燥而凋零。
感染培養基中使用的床土是珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼以80∶1-2比率的混合物。珍珠巖廣泛地用作床土。并且，由于珍珠巖幾乎不含有其它有機或無機化合物，其適于K-固體培養基或K-液體培養基的加入。泥炭蘚泥炭沼用于濕度控制。由于泥炭蘚泥炭沼的強酸性，其使用濃度非常低。當使用含有紙杯的培養容器時，在紙杯被放置于容器中滅菌后，混合土壤傾倒入按照上述步驟制備的接種了松口蘑菌絲體的培養容器中，并使其達到與紙杯同樣的高度，以防止將要傾倒于混合土壤的K-液體培養基進入培養容器與紙杯之間的空間，其中在超凈臺上加入土壤。
另一方面，具有如上表1所示組成的K-液體培養基在1.2個大氣壓，于121℃高壓滅菌20分鐘，并冷卻。然后，在超凈臺上將100ml K-液體培養基傾倒于混合土壤上。這些加入的少量的K-液體培養基可以防止在培養過程中干燥，因此，防止松樹芽苗的凋零。
步驟4無菌松樹芽苗的準備并將其種植到感染培養基在無菌條件下，使松樹子發芽，將得到的松樹芽苗種植到步驟3中制備的含有混合土壤和K-液體培養基的感染培養基中，并使根面向下，子葉面向上。然后，用蓋子覆蓋培養容器。
另一方面，為了獲得松樹芽苗，將松樹子在70％乙醇中浸泡10-60秒消毒，然后用0.5-3％(最佳2％)的次氯酸鈉處理1-7分鐘，再用無菌水洗滌3-4次。當用次氯酸鈉處理更長時間時，松樹子的發芽率降低。因此，用次氯酸鈉處理芽苗約5分鐘是合適的。當在無菌條件下剝離種皮后，將消毒的種子種植于固體培養基中并在15-28℃培養，(最佳溫度23-26℃，通常種子發芽溫度24℃)，所述固體培養基利用營養液體培養基(Nutrient Broth，Scharlau)和瓊脂(8g/L)制備并在滅菌的一次性培養皿中變硬。選擇3cm長沒有被微生物污染的發芽種子。超過3cm長的芽苗容易倒下或凋零。將選擇的松樹芽苗種植于步驟3中準備的培養容器中，該容器中含有接種了松口蘑菌絲體的感染培養基。這里，將芽苗種植入混合土壤約2cm深，小于1cm高，并且使根面向下，子葉面向上。
步驟5制備感染松口蘑菌的幼松樹的培養步驟為了制備細根被松口蘑菌感染的幼松樹，將步驟4中種植于培養容器中的松樹芽苗在10-40,000lux光強度下于15-25℃共同培養24小時。
通常在15-25℃下進行松口蘑菌進入松樹芽苗細根的感染。已知根癌農桿菌(Agrobacterium tumefacience)作為將外源基因整合入植物染色體的載體，感染植物的最佳溫度為20℃。在這點上，本發明的感染松口蘑菌過程在20℃進行。最重要的因素，光強度，在10-40,000lux范圍內。自然光約為20,000lux，但是由于包括培養容器的透射率低和照明設備過熱等重大問題，難以人工維持這樣的自然光強度。因此，本發明應用三個波長的熒光燈。感染過程在裝有4個或多個熒光燈的培養箱中進行，并使培養容器維持在超過8,000lux光強度下，以維持供應對于植物生長必需的碳源。由于松口蘑菌試圖獲得碳源，這些培養條件自發誘導松口蘑菌的感染機制。
步驟6對于在松樹芽苗細根上的菌根形成的評價在共培養松樹芽苗和松口蘑菌絲體后，評價在松樹芽苗的細根上形成的菌根的香味，并且在立體顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下觀察滲入松樹芽苗的細根的真菌菌絲體狀態。
發現，在培養后70天內，松樹芽苗感染了松口蘑菌絲體。還發現在松樹芽苗細根上形成的菌根發出與松口蘑蘑菇相同的香味。并且，在立體顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下，發現菌絲體滲入細根中。在無菌下切除形成的菌根的一部分，種植于MMN(改進的Melin-Norkron)培養基上，然后培養。發現在培養基上形成的菌絲體具有與松口蘑蘑菇相同的形態和香味。
將參考下列實施例并結合附圖更詳細地解釋本發明。然而，提供下列實施例只是為了闡述本發明，并不用于限定本發明。
實施例1使用用于金針菇的培養容器制備感染松口蘑菌的幼松樹為了獲得如圖4所示的感染松口蘑菌的幼松樹，將滅菌的K-固體培養基傾倒于滅菌的培養容器中并使之變硬，該K-固體培養基通常用于培養金針菇(Flammulina velutipes)蘑菇。用濾紙覆蓋K-固體培養基后，將菌絲體與5ml無菌水以0.075mg干重接種于濾紙上，該菌絲體來自液體培養的松口蘑菌KBFERI 20T05的子實體，將80∶1.5比率的珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼的混合物加到接種的真菌菌絲體上并將pH 5.6的K-液體培養基加入土壤中，以此形成感染培養基。然后，將從無菌下發芽松樹子獲得的芽苗種植到含有混合土壤和K-液體培養基的感染培養基上，并用蓋子覆蓋培養容器，然后在25,000lux光強度下，于20℃將松樹芽苗和松口蘑真菌共同培養24小時。評價在松樹芽苗的細根上形成的外生菌根的香味，并且在立體顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下研究它們滲入根部的狀態。
這里，加入的K-固體培養基的深度小于5.0mm。使用的濾紙為Adantec公司生產的N05B。加入的混合土壤的深度小于5mm。
另外，用達到感染培養基高度的鋁箔將含有感染培養基的培養容器的外部包圍，以防止光透過而保護松口蘑菌絲體和松樹芽苗的根部。
結果，發現松樹芽苗細根上形成的外生菌根具有與松口蘑蘑菇相同的香味，并且在立體顯微鏡下形成菌絲體膜。在光學顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下，在細根上觀察到菌絲體的細胞間滲透。另外，在共同培養后70天內，發現真菌菌絲體感染了松樹芽苗。當在無菌下切除外生菌根的細根的一部分并種植于MMN(改進的Melin-Norkron)培養基上時，真菌菌絲體顯示松口蘑真菌的特征性菌絲體生長(附圖未顯示)，并且新形成的蘑菇發出與天然存在的松口蘑蘑菇相同的香味。
制備例1來自液體培養的松口蘑接種體的制備本發明中用作接種體的松口蘑真菌分離自天然存在的恰好在其菌蓋打開前的松口蘑蘑菇，該松口蘑蘑菇是從位于韓國的慶尚北道(Gyeongsangbuk-do)慶州市(Gyeongju-si)Namsan-dong的10公頃(ha)的Doyoo森林采集的。在采集后8小時內，將采集的蘑菇中的菌蓋和菌褶之間的部分切成0.5mm大小的塊，并且種植到按照如下表2所示的組成的pH 5.5的MMN培養基上。然后，在松口蘑生長的最佳生長溫度，23±0.5℃，在PDA培養基上進一步培養分離的菌絲體60天。松口蘑真菌成功地分離自約98％的培養的菌絲體。發現分離的菌絲體與已知的松口蘑真菌的ITS序列，整個5.8S rRNA和部分18S的DNA序列具有超過99％同源性。鑒定的rDNA序列于2001年4月3日在Gene Bank登記，指定登記號AF367417。在本發明中，分離的松口蘑真菌命名為“KBFERI20T05”。這里，作為松口蘑接種體，可以應用來自天然存在的松口蘑蘑菇的菌絲體，其與松口蘑的已知ITS序列和整個5.8S和18S的DNA序列具有超過99％同源性。
為了獲得制備本發明感染松口蘑菌的幼松樹的接種體的菌絲體團，將分離自天然存在的松口蘑蘑菇子實體的松口蘑菌KBFERI 20T05培養于PDA培養基中(按照表2列出的組成除去瓊脂后制備)。得到的真菌菌絲體團用pH5.0的無菌水洗滌，然后利用Waring氏可高壓滅菌的攪拌器31L91于無菌水中粉碎為精細顆粒。利用10ml玻璃吸液管將粉碎的真菌菌絲體均勻接種于培養容器中放置于K-固體培養基上的濾紙上。
表2

制備例2利用混合土壤和K-液體培養基制備感染培養基應用珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼作為培養松樹芽苗的床土。以80∶1.5比率混合后，將它們在容器中滅菌。在超凈臺上，滅菌的混合土壤傾倒至接種了松口蘑菌絲體的培養容器中至合適的高度。
按照如上表1所示的組成制備K-液體培養基。在高溫下高壓滅菌后，在超凈臺上將100ml K-液體培養基傾倒至混合土壤上。
制備例3在無菌條件下使松樹子發芽并種植它們以制備松樹芽苗將松樹子在70％乙醇中浸泡60秒消毒，然后用2％次氯酸鈉處理4分鐘，再用無菌水洗滌3次。在無菌條件下剝離種皮后，將消毒種子種植于固體培養基上并在24℃培養，所述固體培養基利用營養液體培養基(Scharlau)和瓊脂(8g/L)制備并在滅菌的一次性培養皿中變硬。選擇3cm長沒有被微生物污染的發芽種子并種植于制備例2中制備的培養容器中的感染培養基中。
如圖2所示，選擇的沒有被微生物污染的松樹芽苗種植于感染培養基中。
實施例2利用含有紙杯的培養容器制備感染松口蘑菌的幼松樹如圖3所示，為了制備感染松口蘑菌的幼松樹，將滅菌的K-固體培養基傾倒入滅菌的含有紙杯的培養容器中。來自松口蘑菌KBFERI 20T05子實體的菌絲體按照如制備例1相同的方法制備。所述菌絲體與5ml無菌水以0.075mg干重接種至紙杯的底部。將按照制備例2相同方法制備的混合土壤和100ml K-液體培養基傾倒至接種的真菌菌絲體上，由此制備感染培養基。然后，將按照制備例3相同方法制備的松樹芽苗種植到感染培養基上，并且用蓋子覆蓋培養容器，然后，在25,000lux光強度下于培養箱中20℃培養24小時。該培養箱裝有4個或多個三個波長的熒光燈。評價在松樹芽苗的細根上形成的外生菌根的香味，并且在立體顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下研究它們滲入根部的狀態。
作為松樹芽苗和松口蘑真菌共同培養的結果，發現在松樹芽苗的細根上形成的外生菌根與松口蘑蘑菇具有相同的香味，并且在立體顯微鏡下形成菌絲體膜。在光學顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下，在細根上觀察到菌絲體的細胞間滲透。另外，在共同培養后70天內，松樹芽苗感染了松口蘑菌絲體。當在無菌下切除外生菌根的細根的一部分并種植于MMN(改進的Melin-Norkron)培養基中時，真菌菌絲體顯示松口蘑真菌的特征性菌絲體生長(附圖未顯示)，并且新形成的蘑菇發出與天然存在的松口蘑蘑菇相同的香味。
另一方面，當真菌菌絲體均勻接種于培養容器的紙杯的底部時，接種的菌絲體生長成為多層菌落，這種生長形式增加了松樹芽苗的細根與松口蘑真菌的接觸。
制備例4培養容器的制備如圖3所示，為了制備感染松口蘑菌的幼松樹，可商購獲得的紙杯(相當小型的杯子)緊密插入培養容器的內部但不暴露于容器的上部分，然后用透明蓋子覆蓋培養容器。然后，培養容器在1.2個大氣壓，121℃下高壓滅菌20分鐘，并冷卻。然后，將培養容器在超凈臺上暴露于紫外光下進一步滅菌。
實施例3在含有K-固體培養基的培養容器中，利用生長松口蘑蘑菇的田地土壤制備感染松口蘑菌的幼松樹為了在插入紙杯并含有K-固體培養基的培養容器(按照與實施例1相同的方法制備)中制備感染松口蘑菌的幼松樹，將來自松口蘑菌KBFERI20T05子實體的菌絲體(按照與制備例1相同的方法制備)與5ml無菌水以0.075mg干重的量接種于放置在紙杯底部的K-固體培養基上。將收集于生長松口蘑蘑菇的田地土壤(按照如下制備例6相同方法制備)和50ml K-液體培養基傾倒于接種了的真菌菌絲體上，由此制備感染培養基。然后，將按照制備例3相同方法制備的松樹芽苗種植于感染培養基上，并用蓋子覆蓋培養容器。然后在25,000lux光強度下于培養箱中20℃培養24小時。該培養箱裝有4個或多個三個波長的熒光燈。評價在松樹芽苗的細根上形成的外生菌根的香味，并且在立體顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下研究它們滲入根部的狀態。
作為松樹芽苗和松口蘑真菌共同培養的結果，發現在松樹芽苗的細根上形成的外生菌根與松口蘑蘑菇具有相同的香味，并且在立體顯微鏡下形成菌絲體膜。在光學顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下，在細根上觀察到菌絲體的細胞間滲透。另外，在共同培養后70天內，發現松樹芽苗感染了松口蘑菌絲體。當在無菌下切除外生菌根的細根的一部分并種植于MMN(改進的Melin-Norkron)培養基中時，真菌菌絲體顯示松口蘑真菌的特征性菌絲體生長(附圖未顯示)，并且新形成的蘑菇發出與天然存在的松口蘑蘑菇相同的香味。
制備例5制備含有K-固體培養基的培養容器如下方法制備用于共同培養松樹芽苗和松口蘑真菌的培養容器。如圖3所示，可商購獲得的紙杯(相當小型的杯子)緊密插入培養容器的內部但不暴露于培養容器的上部分，并且用透明蓋子覆蓋培養容器。然后，培養容器在1.2個大氣壓，121℃下高壓滅菌20分鐘，并冷卻。然后，將培養容器在超凈臺上暴露于紫外光下進一步滅菌。在超凈臺上，將按照表1列出的組成制備的K-固體培養基(pH5.6)傾倒入培養容器的紙杯中至厚度2cm，優選約0.5mm，并使之變硬。
制備例6利用生長松口蘑蘑菇的田地土壤和K-液體培養基制備感染培養基用于培養松樹芽苗的床土利用生長松口蘑蘑菇的田地土壤制備。土壤分別收集于三層土壤層表面土壤層，精細顆粒土壤層和粗糙顆粒土壤層，并將所述土壤加入制備例5中的紙杯中的K-固體培養基中，并保持其自然結構，即，將K-液體培養基、粗糙顆粒土壤、精細顆粒土壤和表面土壤依次加入紙杯中。然后，將按照表1列出的組成制備的K-液體培養基(pH5.6)在1.2個大氣壓，121℃下高壓滅菌20分鐘，并冷卻。然后，在超凈臺上，將50ml冷卻的K-液體培養基傾倒入土壤上。
實施例4利用含有K-固體培養基的培養容器中的混合土壤制備感染松口蘑菌的幼松樹為了在插入紙杯并含有K-固體培養基的培養容器(按照與實施例1相同的方法制備)中制備感染松口蘑菌的幼松樹，將來自松口蘑菌KBFERI20T05子實體的菌絲體(按照與制備例1相同的方法制備)與5ml無菌水以0.075mg干重的量接種于放置于紙杯底部的K-固體培養基上。將按照制備例2相同方法制備的混合土壤和100ml K-液體培養基傾倒于接種的真菌菌絲體上，由此制備感染培養基。然后，將按照制備例3相同方法制備的松樹芽苗種植于感染培養基上，并用蓋子覆蓋培養容器。然后在25,000lux光強度下于培養箱中20℃培養24小時。該培養箱裝有4個或多個三個波長的熒光燈。評價在松樹芽苗的細根上形成的外生菌根的香味，并且在立體顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下，研究它們滲入根部的狀態。
如圖5所示，發現松樹芽苗感染了松口蘑真菌。在松樹芽苗細根上形成的外生菌根具有與松口蘑蘑菇相同的香味。并且，如圖6所示，在立體顯微鏡下形成菌絲體膜。如圖7和圖8所示，在光學顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下，在線狀細根上觀察到菌絲體的細胞間滲透。另外，在共同培養后70天內，發現真菌菌絲體感染了松樹芽苗。
如圖9所示，當在無菌條件下切除外生菌根的細根的一部分并種植于MMN(改進的Melin-Norkron)培養基時，發現真菌菌絲體顯示松口蘑真菌的特征性菌絲體生長。
如實施例所描述，根據本發明制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法是有效的，其通過體外共同培養無菌松樹芽苗和真菌菌絲體，只用松口蘑真菌選擇性感染松樹根部。本發明的方法通過應用松口蘑分離菌，該松口蘑分離菌與常規已知松口蘑的ITS區，5.8S的整個區域和18S一部分具有DNA序列同源性，有利于為松口蘑接種體和感染了真菌的松樹芽苗提供客觀現實條件。另外，由于一旦移植入田地容易移去紙杯，本發明的方法為種植工作提供了方便，并且對松口蘑菌生根相對有效。進一步地，該方法使整年大規模生產感染松口蘑菌的松樹成為可能，其對于體外培養松口蘑蘑菇特別有用。
權利要求
1.一種制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法，該方法包括以下步驟將真菌菌絲體以0.01-0.02mg干重/mL無菌水的量接種于滅菌的培養容器的底部，所述真菌菌絲體通過將液體培養于PDB培養基的松口蘑子實體粉碎獲得；將珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼以80∶1-2的比率混合并且將得到的混合土壤放置于接種的真菌菌絲體上；制備K-液體培養基，調整培養基的pH至5.5-5.6并將K-液體培養基平分至混合土壤上，所述K-液體培養基為每升水中含有1.65g NH4NO3，0.2g KNO3，0.002g CaCl2·2H2O，0.02g KCl，0.2g KH2PO4，0.9g MgSO4·7H2O，0.2g(NH4)2HPO4，0.5g NH4-Tar，0.5ml Fe-Cit，0.031g H3BO3，0.01516g MnSO3·4H2O，0.0086g ZnSO4·7H2O，0.00083g KI，0.00025g Na2MoO4·2H2O，100μg鹽酸硫胺，1.0g麥芽提取物，0.5g酵母提取物，0.3g酪蛋白和3.0g葡萄糖；在無菌條件下，使松樹子發芽至3cm長，將得到的無菌芽苗種植于含有混合土壤和K-液體培養基的感染培養基上，并用蓋子覆蓋培養容器；并且將松樹芽苗和松口蘑菌絲體在10-40,000lux光強度下于15-25℃共同培養24小時。
2.如權利要求1所述的方法，其中在將粉碎液體培養于PDB培養基的松口蘑子實體獲得的真菌菌絲體接種于滅菌的培養容器的底部的步驟之前，該方法還包括制備K-固體培養基，調整K-固體培養基的pH至5.5-5.6并將K-固體培養基平分至培養容器中的步驟，所述K-固體培養基為每升蒸餾水含有1.65g NH4NO3，0.2g KNO3，0.002g CaCl2·2H2O，0.02g KCl，0.2g KH2PO4，0.9g MgSO4·7H2O，0.2g(NH4)2HPO4，0.5gNH4-Tar，0.5ml Fe-Cit，0.031g H3BO3，0.01516g MnSO3·4H2O，0.0086g ZnSO4·7H2O，0.00083g KI，0.00025g Na2MoO4·2H2O，100μg鹽酸硫胺，1.0g麥芽提取物，0.5g酵母提取物，0.3g酪蛋白，10.0g葡萄糖和2.0g植物凝膠。
3.如權利要求1所述的方法，其中紙杯緊緊插入所述容器中。
4.如權利要求2所述的方法，其中所述K-固體培養基以0.5mm至2cm的厚度平分到培養容器的底部。
5.一種感染松口蘑菌的幼松樹，該幼松樹的制備方法包括如下步驟將真菌菌絲體以0.01-0.02mg干重/mL無菌水的量接種于滅菌的培養容器的底部，所述真菌菌絲體通過將液體培養于PDB培養基的松口蘑子實體粉碎獲得；將珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼以80∶1-2的比率混合并且將得到的混合土壤放置于接種的真菌菌絲體上；制備K-液體培養基，調整培養基的pH至5.5-5.6并將K-液體培養基平分至混合土壤上，所述K-液體培養基為每升水中含有1.65g NH4NO3，0.2g KNO3，0.002g CaCl2·2H2O，0.02g KCl，0.2g KH2PO4，0.9g MgSO4·7H2O，0.2g(NH4)2HPO4，0.5g NH4-Tar，0.5ml Fe-Cit，0.031g H3BO3，0.01516g MnSO3·4H2O，0.0086g ZnSO4·7H2O，0.00083g KI，0.00025g Na2MoO4·2H2O，100μg鹽酸硫胺，1.0g麥芽提取物，0.5g酵母提取物，0.3g酪蛋白和3.0g葡萄糖；在無菌條件下，使松樹子發芽至3cm長，將得到的無菌芽苗種植于含有混合土壤和K-液體培養基的感染培養基上，并用蓋子覆蓋培養容器；并且將松樹芽苗和松口蘑菌絲體在10-40,000lux光強度下于15-25℃共同培養24小時。
全文摘要
本發明公開了一種通過共同培養無菌松樹芽苗和松口蘑分離菌，制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法，該方法包括以下步驟于PDB(馬鈴薯葡萄糖液體培養基，Difco)中液體培養天然存在的松口蘑蘑菇子實體并將分離自培養的子實體的松口蘑菌KBFERI 20T05接種；將珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼的混合土壤及K－液體培養基放置于接種的真菌上；將松樹子在無菌下發芽產生的無菌芽苗種植到混合土壤中，然后與松口蘑分離菌一起培養松樹芽苗以使在松樹芽苗的細根上形成外生菌根。本發明的方法通過應用與已知常規松口蘑菌具有DNA同源性的真菌作為接種體，有利于為真菌接種體提供客觀現實條件，并使整年大規模生產感染松口蘑菌的松樹成為可能。
文檔編號A01G1/04GK1494823SQ0315661
公開日2004年5月12日 申請日期2003年9月5日 優先權日2002年9月6日
發明者樸武昌, 沈相甲, 千于宰 申請人:慶尚北道知事