專利名稱：增加商業(yè)化轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的dna構(gòu)建體和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)和植物基因工程領(lǐng)域。采用植物基因工程方法創(chuàng)建新的DNA構(gòu)建體，其包含異源遺傳元件，當(dāng)它在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時提供了有用的表型。更具體地講，本發(fā)明包含DNA構(gòu)建體和它的使用方法，從而讓更多從植物細(xì)胞培養(yǎng)物再生的轉(zhuǎn)基因植物能成功作為商業(yè)化植物的候選。
背景技術(shù)：
土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法涉及將植物細(xì)胞和組織暴露于含特定DNA質(zhì)粒的土壤桿菌細(xì)胞懸浮液。具體構(gòu)建這些DNA質(zhì)粒以包含將在植物細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因(美國專利第5,034,322號)。最通常地，一個或多個轉(zhuǎn)基因為正向選擇標(biāo)記基因，允許植物細(xì)胞在正向選擇化合物存在時生長，例如抗生素或除草劑。進(jìn)一步操作這些細(xì)胞，再生為完整的能育植物。
通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將轉(zhuǎn)基因?qū)胫参锏姆椒ɡ谜狭宿D(zhuǎn)基因遺傳元件的T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)，將那些遺傳元件轉(zhuǎn)移到植物的基因組中。將轉(zhuǎn)基因構(gòu)建在DNA質(zhì)粒載體中，并通常界定在土壤桿菌Ti質(zhì)粒右邊緣DNA區(qū)域(RB)和左邊緣DNA區(qū)域(LB)之間。在土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過程中，DNA質(zhì)粒的左右邊緣區(qū)域被VirD2核酸內(nèi)切酶切開，接著T-DNA區(qū)域插入到植物基因組中。T-DNA整合到植物基因組通常始于RB，并延伸到T-DNA的末端LB處。但是，有時候核酸內(nèi)切酶不能同等切割兩端。當(dāng)發(fā)生這種情況時，插入植物基因組的T-DNA常常含有部分或全部的質(zhì)粒載體DNA。這種現(xiàn)象被稱為邊界通讀。通常優(yōu)選的是只讓位于左緣和右緣區(qū)(T-DNA)之間的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到植物基因組當(dāng)中而不攜帶任何相鄰的質(zhì)粒載體DNA(載體骨架)。載體骨架DNA包含有各種質(zhì)粒維持遺傳元件，例如復(fù)制起點(diǎn)、細(xì)菌選擇標(biāo)記基因和其它由于規(guī)定不希望出現(xiàn)在商業(yè)化農(nóng)作物產(chǎn)品中的DNA片斷。
大量的資源被用于篩查轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的基因組中是否存在載體骨架DNA。方法如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和DNA印跡分析最常用于鑒定外源載體骨架DNA。這些方法耗時且大規(guī)模的篩查昂貴。載體骨架DNA可通過左邊界通讀整合，或者可不依賴T-DNA整合到植物基因組中(Kononov等，Plant J.11，945-957，1997)。被發(fā)現(xiàn)含有載體骨架DNA的轉(zhuǎn)基因植物不能商業(yè)化。從沒有商業(yè)潛力的植物細(xì)胞培養(yǎng)物再生轉(zhuǎn)基因植物浪費(fèi)了大量努力。能大大降低載體骨架DNA在轉(zhuǎn)基因植物基因組中出現(xiàn)的DNA構(gòu)建體和方法將是非常有用的。如果更少的轉(zhuǎn)基因植物不含載體骨架DNA，就可以生產(chǎn)更少。因此，只需要較少的實(shí)驗以確證是否含有骨架DNA。
Hanson等人(美國專利第6,521,458號)描述了在載體骨架中含有致死基因的DNA構(gòu)建體，表達(dá)時殺死植物細(xì)胞。不過，控制在細(xì)菌和植物細(xì)胞中致死基因產(chǎn)物的表達(dá)是棘手的。致死基因的表達(dá)必須受各種遺傳元件控制，以防在細(xì)菌和非靶向植物細(xì)胞和組織中表達(dá)。在骨架中將非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因用于植物細(xì)胞較使用致死基因是實(shí)質(zhì)性的改善。非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因可提供可視的方式以辨別正在表達(dá)非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因產(chǎn)物的植物細(xì)胞和組織，植物細(xì)胞和植物的選擇更為可控，而且含有非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因的植物細(xì)胞是可被救活的。為此目的所使用的基因可以是任何影響植物細(xì)胞分裂、莖干伸長或是產(chǎn)生多效性莖干或是葉片表型的基因。
可記分標(biāo)記基因例如β-葡萄糖苷酶(GUS)(Kononov等，Plant J.11，945-957，1997)可提供檢測骨架DNA存在的方式，但是不能提供選出含有載體骨架DNA的細(xì)胞的方式，并且測定方法具有組織破壞性。條件致死的負(fù)性選擇標(biāo)記基因也可用于骨架DNA中。其它條件致死基因產(chǎn)物的代表性實(shí)例包括將硫黃嘌呤轉(zhuǎn)變成毒性硫黃嘌呤單磷酸的大腸桿菌(E.coli)鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Besnard等，Mol.Cell.Biol.74139-4141，1987)；將磷酸化無活性化合物如絲裂霉素磷酸酯和阿霉素磷酸酯轉(zhuǎn)變成毒性去磷酸化化合物的堿性磷酸酶；將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變成毒性化合物5-氟尿嘧啶的真菌(如尖鐮孢(Fusariumoxysporum))或細(xì)菌的胞嘧啶脫氨酶(codA)(Mullen，PNAS 8933，1992)；從對-N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸上切下谷氨酸，從而生成毒性苯甲酸氮芥的羧肽酶G2；將阿霉素和美法侖的苯氧基乙酰胺衍生物轉(zhuǎn)化成毒性化合物的青霉素-V酰胺酶(一般參見Vrudhula等，J.of Med.Chem.36(7)919-923，1993；Kern等，Canc.Immun.Immunother.31(4)202-206，1990)；以及膦酸單酯水解酶，pehA(美國專利第5,254,801號)。然而，為了生成對含有骨架DNA的細(xì)胞能產(chǎn)生致死效應(yīng)的毒性產(chǎn)物，必須添加外源性底物。本發(fā)明不需要向培養(yǎng)基中添加額外的底物，也不需要用條件致死基因產(chǎn)物所需的底物外源處理植物培養(yǎng)細(xì)胞。
植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因和激素生物合成途徑基因可以作為植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因，并用于生產(chǎn)不含標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物的方法(美國專利第6,326,192號)。可是，如果此植物要進(jìn)一步發(fā)展為所述的商業(yè)化植物，就必須除去這些基因。本文闡述的基因以及組合物在本發(fā)明中用作載體骨架DNA的非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因。
代謝內(nèi)源性植物細(xì)胞底物的基因產(chǎn)物可用作本發(fā)明的代謝干擾基因。例如，sacB基因編碼蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)用蔗糖作底物合成中性多聚果糖(果聚糖)，經(jīng)證實(shí)存在于多種細(xì)菌中例如芽孢桿菌(Bacillus spp.)、歐文氏菌(Erwinia spp.)等。旨在增加抗旱性或滲土強(qiáng)度(sink strength)而表達(dá)sacB基因的轉(zhuǎn)基因植物曾報道于煙草、馬鈴薯、甜菜、玉米和黑麥草(Ebskamp等，Bio/Technol.12，272-275，1994；van der Meer等，Plant Cell，6，561-570，1994；Caimi等，PlantPhysiol.110，355-363，1996；Rober等，Planta.199，528-536，1996；Ye等，Plant Cell Rep，20205-212，2001)。然而，當(dāng)液泡靶向的受CaMV35S啟動子驅(qū)動的sacB基因重復(fù)轉(zhuǎn)化進(jìn)入煙草和黑麥草的時候，只恢復(fù)了有發(fā)育障礙的植物(Ye等，2001)。在玉米中，表達(dá)sacB的玉米粒干擾了顆粒充填并造成種子萎縮，其發(fā)芽率非常低(Caimi等，1996)。在馬鈴薯中，sacB基因在塊莖中的表達(dá)致使塊莖變小(Rober等，1996)。這些結(jié)果揭示，sacB的表達(dá)嚴(yán)重抑制了植物細(xì)胞和組織的發(fā)育。
其它編碼代謝干擾酶的基因，例如編碼酵母轉(zhuǎn)化酶、酵母海藻糖-6-磷酸合酶的基因也可以以相同方式使用。據(jù)報道，在煙草和擬南芥(Arabidopsis)中表達(dá)酵母轉(zhuǎn)化酶(Suc2，Carlson等，Nucleic AcidsRes.11(6)，1943-1954，1983)嚴(yán)重抑制莖干伸長和根發(fā)育(Sonnewald等，Plant J.195-106，1991)，而在煙草中組成型表達(dá)酵母海藻糖-6-磷酸合酶(TPS1，Bell等，Eur.J.Biochem.209(3)，951-959(1992))出現(xiàn)生長障礙和披針狀葉(Romero等，Planta 201293-297，1997)。代謝干擾基因，例如編碼蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)化酶或海藻糖-6-磷酸合酶的多核苷酸作為非致死負(fù)性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因用于本發(fā)明。
本發(fā)明將非致死負(fù)性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因整合到DNA質(zhì)粒的載體骨架DNA上，用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。設(shè)計轉(zhuǎn)基因以在含有DNA質(zhì)粒載體骨架DNA的植物細(xì)胞中表達(dá)非致死基因產(chǎn)物。這些非致死負(fù)性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物涉及到植物激素生物合成途徑、植物激素底物的轉(zhuǎn)變、植物激素降解或者是代謝干擾。利用這樣的DNA質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞可以提高商業(yè)化植物的產(chǎn)量。
發(fā)明概述本發(fā)明包括包含了土壤桿菌Ti質(zhì)粒第一邊緣區(qū)的DNA質(zhì)粒，該邊緣區(qū)和至少一種轉(zhuǎn)基因相連接，轉(zhuǎn)基因可以是選擇性標(biāo)記基因和其它農(nóng)藝學(xué)目的基因，它們連接到土壤桿菌Ti質(zhì)粒的第二邊緣區(qū)，再連接到載體骨架DNA，后者包含有非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因。非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因包括植物激素生物合成途徑基因或代謝干擾基因。植物激素生物合成途徑基因的過度表達(dá)提供植物激素的表達(dá)增加，或者將植物激素底物轉(zhuǎn)化成無功能的激素類似物，或者將植物激素的底物導(dǎo)向另一種生物合成途徑。非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因還可以包括減少內(nèi)源性激素量的植物激素降解基因。非致死負(fù)性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因還可以包括按反義方向排列的植物激素生物合成基因或其部分，通過轉(zhuǎn)錄后基因抑制減少內(nèi)源性植物激素的量。非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因還可以包括代謝干擾基因，當(dāng)它在植物細(xì)胞中過度表達(dá)時提供了異常表型。這種異常表型優(yōu)選為生長減緩表型或者是莖干或葉的畸型。
DNA質(zhì)粒還包括植物表達(dá)盒，其包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動子。這些植物表達(dá)盒提供了植物正向選擇標(biāo)記基因、農(nóng)藝學(xué)目的基因和非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因。
非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因包括在DNA質(zhì)粒上的植物激素生物合成途徑基因，選自以下基因赤霉酸(GA)途徑基因、細(xì)胞分裂素途徑基因、植物生長素途徑基因、乙烯途徑基因和脫落酸途徑基因。
本發(fā)明的DNA質(zhì)粒包含非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因，該基因可以將GA途徑的底物轉(zhuǎn)化為無GA活性的化合物。例如，這類轉(zhuǎn)基因編碼的酶包括八氫番茄紅素合酶、GA20氧化酶或GA2β，3β-羥化酶。DNA質(zhì)粒可以含有GA降解酶，如GA 2-氧化酶。
本發(fā)明的DNA質(zhì)粒包含非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因，該基因編碼細(xì)胞分裂素生物合成途徑中的酶，例如異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)。
本發(fā)明的DNA質(zhì)粒包含非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因，該基因編碼植物生長素生物合成途徑中的酶，例如植物IAA合酶基因或土壤桿菌腫瘤基因iaaM、iaaH、rolABC或者其它從各種土壤桿菌種中分離的腫瘤或根毛基因。
本發(fā)明的DNA質(zhì)粒包含非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因，該基因編碼乙烯生物合成途徑中的酶。例如編碼ACC合酶的基因。DNA質(zhì)粒也可以包含編碼乙烯降解酶的基因，例如ACC脫氨酶。本發(fā)明的DNA質(zhì)粒也可以含有編碼乙烯受體的基因。本發(fā)明的DNA質(zhì)粒也可以含有編碼植物激素信號蛋白的轉(zhuǎn)基因。
本發(fā)明的DNA質(zhì)粒包含非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因，該基因是代謝干擾基因。例如，代謝干擾基因包括但不限于編碼蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶的sacB基因、編碼酵母轉(zhuǎn)化酶的Suc2基因或編碼酵母海藻糖-6-磷酸合酶的TPS1基因。代謝干擾基因還包括構(gòu)建為按轉(zhuǎn)錄后基因抑制機(jī)制發(fā)揮功能的基因。
將本發(fā)明DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入土壤桿菌細(xì)胞中，用于轉(zhuǎn)移包含在質(zhì)粒中的植物轉(zhuǎn)基因的方法。土壤桿菌細(xì)胞包含DNA質(zhì)粒，其包含土壤桿菌Ti質(zhì)粒第一邊緣區(qū)，連接到至少一種農(nóng)藝學(xué)目的轉(zhuǎn)基因，再連接到土壤桿菌Ti質(zhì)粒的第二邊緣區(qū)，再連接到非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因，再連接到載體骨架DNA。
本發(fā)明提供了增強(qiáng)選擇商業(yè)化轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括步驟a)使用在T-DNA中包含正向選擇標(biāo)記基因且在質(zhì)粒骨架中包含非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化多個植物細(xì)胞；b)在正向選擇化合物上選擇所述的植物細(xì)胞；c)將所述選擇的植物細(xì)胞再生為完整的植物；其中該植物減少了質(zhì)粒骨架DNA的出現(xiàn)，并且具有較低拷貝數(shù)的農(nóng)藝學(xué)目的轉(zhuǎn)基因。通過此方生產(chǎn)的植物為本發(fā)明的一個方面。
附圖簡述


圖1.本發(fā)明DNA質(zhì)粒圖解圖2.pMON80101的質(zhì)粒圖譜圖3.pMON77406的質(zhì)粒圖譜圖4.pLAGILBO1.0033的質(zhì)粒圖譜圖5.pLAGILBO1.0037的質(zhì)粒圖譜圖6.pMON69869的質(zhì)粒圖譜圖7.pMON75157的質(zhì)粒圖譜圖8.pMON75182的質(zhì)粒圖譜圖9.pLAGILBO1.0035的質(zhì)粒圖譜
圖10.pLAGILBO1.0038的質(zhì)粒圖譜
圖11.pMON75183的質(zhì)粒圖譜
圖12.pMON75181的質(zhì)粒圖譜
圖13.pMON42066的質(zhì)粒圖譜
圖14.非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因?qū)τ胮MON75181(crtB)和pMON75182(ipt)轉(zhuǎn)化的玉米植物的骨架頻率的效果
圖15.非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因?qū)τ胮MON75181(crtB)和pMON75182(ipt)轉(zhuǎn)化的玉米植物的插入拷貝數(shù)的效果
圖16.pMON73564的質(zhì)粒圖譜
圖17.pMON73565的質(zhì)粒圖譜
圖18.非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因?qū)τ胮MON73565(crtB+)轉(zhuǎn)化的玉米植物的骨架頻率的效果
圖19.非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因?qū)τ胮MON73565(crtB+)轉(zhuǎn)化的玉米植物的插入拷貝數(shù)的效果圖20.pMON67935的質(zhì)粒圖譜圖21.pMON67936的質(zhì)粒圖譜圖22.非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因?qū)τ胮MON67936(crtB+)轉(zhuǎn)化的玉米植物的骨架頻率的效果圖23.非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因?qū)τ胮MON67936(crtB+)轉(zhuǎn)化的玉米植物的插入拷貝數(shù)的效果圖24.pMON83912的質(zhì)粒圖譜圖25.pMON83908的質(zhì)粒圖譜圖26.pMON83907的質(zhì)粒圖譜發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于含有非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因盒的DNA質(zhì)粒，所述基因盒位于T-DNA外的質(zhì)粒區(qū)域中，并與質(zhì)粒維持DNA(載體骨架DNA)相連。當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中表達(dá)時，非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因含有的基因產(chǎn)物是非致死性的，但是干擾了正常轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生為完整的轉(zhuǎn)基因，植物包括莖干、葉和根。本發(fā)明提供了使用該DNA質(zhì)粒來增強(qiáng)選擇商業(yè)用途植物細(xì)胞的方法。再生為完整的能育轉(zhuǎn)基因植物的植物細(xì)胞增強(qiáng)了商業(yè)可行性，部分因為不存在載體骨架DNA，部分因為在植物基因組中減少了T-DNA的拷貝數(shù)。
本發(fā)明的多核酸分子編碼非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因產(chǎn)物的DNA分子，在本發(fā)明中鑒定為包含多核酸分子，當(dāng)其在植物中表達(dá)時對植物細(xì)胞是非致死的，但是干擾了植物細(xì)胞以正常速度再生為完整植物的能力，或與不含該多核酸分子的植物細(xì)胞或再生植物部分相比產(chǎn)生了異常表型。
本文使用的多核酸分子是指脫氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。DNA和RNA分子都是從核苷酸頭尾連接構(gòu)建而來，其中每一個核苷酸含有一個磷酸基、一個糖部分、一個嘌呤或嘧啶堿基。多核酸分子可以是單鏈或雙鏈的核苷酸聚合物，從5′端讀到3′端。多核酸也可以任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基，能夠允許被聚合酶正確連讀，并且不會改變該多核酸分子編碼的多肽的表達(dá)。
本發(fā)明的多核苷酸由核苷酸序列定義，本文使用的核苷酸序列是指線性排列的核苷酸形成多核酸分子的有義鏈和互補(bǔ)鏈的多核苷酸，無論是作為單鏈還是在雙鏈體中。本文使用的術(shù)語“編碼序列”和“結(jié)構(gòu)多核苷酸分子”是指當(dāng)置于合適的調(diào)節(jié)分子的控制之下時，通常通過mRNA，能翻譯成多肽的多核苷酸分子。編碼序列的邊界由5′-末端的翻譯起始密碼子和3′-末端的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可以包括，但不限于染色體DNA、cDNA和重組多核苷酸分子。在本發(fā)明中所使用的編碼非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因產(chǎn)物的多核苷酸的同系物、直向同源物(orthologs)或種內(nèi)同源物(paralogs)，可以在DNA數(shù)據(jù)庫中得到鑒定，并從源生物中分離得到。或者，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過化學(xué)合成可以設(shè)計并創(chuàng)造出編碼非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因產(chǎn)物的人工DNA分子。DNA引物和探針通常是合成的DNA分子。此外，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法合成DNA引物分子，使用DNA引物可以制造全長編碼序列或其片段。
本發(fā)明的多核酸分子可以和其它非天然的或“異源”序列以各種方式組合。“異源”序列是指任何未被發(fā)現(xiàn)天然地與提供本發(fā)明基因產(chǎn)物的核苷酸序列連接的序列，例如包括來源于相同植物的核苷酸序列非天然連接在一起的組合，或來源于不同物種的兩種序列的組合。本文使用的術(shù)語“有效連接”或“連接”，涉及調(diào)控和結(jié)構(gòu)多核苷酸分子的物理和功能排列，這種排列導(dǎo)致有效連接的結(jié)構(gòu)多核苷酸分子的調(diào)控表達(dá)。
DNA構(gòu)建體或轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是指從本發(fā)明多核苷酸分子或其翻譯物得來的有義RNA、反義RNA或蛋白的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積聚。“有義”RNA是指包括mRNA的RNA轉(zhuǎn)錄物，因此能被細(xì)胞翻譯為多肽或蛋白。“反義RNA”是指與靶原始轉(zhuǎn)錄物或mRNA全部或部分互補(bǔ)的RNA轉(zhuǎn)錄物，當(dāng)它在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中表達(dá)時干擾了靶基因的表達(dá)(美國專利第5,107,065號)。反義RNA的互補(bǔ)性可以針對具體基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，例如在5′非編碼序列、3′非翻譯序列、內(nèi)含子或編碼序列。“RNA轉(zhuǎn)錄物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物與DNA序列的拷貝完全互補(bǔ)時，可以被認(rèn)為是原始轉(zhuǎn)錄物或原始轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄后加工得來的RNA序列，被稱為成熟RNA。本發(fā)明的多核苷酸分子可包含與宿主靶多核苷酸互補(bǔ)的反義序列。本發(fā)明的多核苷酸分子也可能包含一個雙鏈RNA產(chǎn)物，當(dāng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)時提供了對靶宿主基因的轉(zhuǎn)錄后基因抑制。
在植物細(xì)胞中通過反向RNA調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因抑制公開于美國專利5,107,065和美國專利5,759,829。在植物細(xì)胞中通過正向RNA調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因抑制公開于美國專利5,283,184和美國專利5,231,020。在植物中由雙鏈RNA通過RNA干擾(RNAi)抑制基因的轉(zhuǎn)錄后基因抑制公開于國際公開WO 99/53050，在分開的轉(zhuǎn)錄單位或單個轉(zhuǎn)錄單位中使用包含靶基因正向和反向元件的重組DNA構(gòu)建體。也參見國際公開WO 99/49029、美國專利申請公開2003/0175965 A1(Lowe等)、美國專利申請10/465,800和美國專利6,506,559。另一個用于RNA干擾基因抑制的DNA構(gòu)建體包含以反向啟動子為邊界的單向基因元件，公開于美國專利申請公開2003/0061626 A1和美國專利6,326,193。也參見美國專利申請系列號10/393,347，公開了在轉(zhuǎn)基因植物中同時表達(dá)一個或多個重組基因而同時抑制一個或多個天然基因的構(gòu)建體和方法。也參見美國專利6,448,473，公開了在植物中使用的多基因表達(dá)載體。所有上述的專利、申請和國際公開公開了在植物中用于轉(zhuǎn)錄后基因抑制的材料和方法，其通過引用結(jié)合到本文中。
在植物中轉(zhuǎn)錄后基因抑制的優(yōu)選方法是使用穩(wěn)定的(如具有末端發(fā)夾結(jié)構(gòu))正向或反向轉(zhuǎn)錄RNA。影響轉(zhuǎn)錄后基因抑制的優(yōu)選DNA構(gòu)建體被轉(zhuǎn)錄為反向RNA片段，所述RNA片段與要抑制的靶基因具有同源性，其中反義RNA片段在3′端后連接有一段連續(xù)、互補(bǔ)的更短的正向RNA片段。在植物中自我穩(wěn)定的反義RNA寡核苷酸的用途公開于國際公開94/01550。也參見國際公開98/05770，其中反義RNA被聚(CG)核苷酸的發(fā)夾形成重復(fù)所穩(wěn)定。也參見美國專利申請公開2002/00488l4 A1，其中有義或反義RNA被poly(T)-poly(A)尾所穩(wěn)定。也參見美國專利申請公開2003/0018993 A1，其中有義或反義RNA被NOS基因后的反向重復(fù)序列所穩(wěn)定。也參見美國專利申請公開2003/0036197 A1(Classman等)，其中與靶基因具有同源性的RNA被兩個互補(bǔ)RNA區(qū)域穩(wěn)定。
本發(fā)明的植物細(xì)胞非致死負(fù)性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因包含了編碼多肽和酶的多核苷酸，所述多肽和酶涉及植物激素。可以操縱植物激素，包括赤霉素、細(xì)胞分裂素、植物生長素、乙烯和脫落酸，用來影響植物細(xì)胞再生為完整的植物。
使用赤霉酸(GA)生物合成途徑底物但不會導(dǎo)致產(chǎn)生生物活性GA的酶，其過度表達(dá)用于在植物細(xì)胞中減少可用于GA生物合成的底物數(shù)量。在美國專利公開2002005309和WO0009722中闡述了GA途徑以及酶和底物的描述，包括GA 20-氧化酶(美國專利6,455,675)、GA2β，3β-羥化酶和八氫番茄紅素合酶。八氫番茄紅素合酶是與生產(chǎn)維生素A有關(guān)的酶(美國專利5,656,472、US20020051998、US20020092039、美國專利6,429,356，通過引用結(jié)合到本文中)。已經(jīng)從細(xì)菌和植物來源中分離到編碼八氫番茄紅素合酶的DNA(美國專利5,429,939，通過引用結(jié)合到本文中)。草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)八氫番茄紅素合酶基因(crtB，美國專利6,429,356)對于生產(chǎn)類胡蘿卜素色素和在本發(fā)明中減少植物細(xì)胞再生特別有用。Fray等(植物雜志8693-701，1995)展示了在轉(zhuǎn)基因番茄中果實(shí)八氫番茄紅素合酶基因的組成型表達(dá)，通過使來源于赤霉素途徑的代謝產(chǎn)物改向，導(dǎo)致了植株矮小。在含有載體骨架DNA的植物中，本發(fā)明中所使用的八氫番茄紅素合酶可以將來源于赤霉酸生物合成途徑的底物焦磷酸 牛兒基 牛兒酯(GGPP)轉(zhuǎn)移到類胡蘿卜素生物合成途徑。這個轉(zhuǎn)換結(jié)果導(dǎo)致可用于GA生產(chǎn)的底物數(shù)量減少。從植物細(xì)胞組織培養(yǎng)再生植物期間植物細(xì)胞中GA的減少延遲了莖干形成。此外，因為類胡蘿卜素色素的過量產(chǎn)生，培養(yǎng)基中植物愈傷組織是橙色的。本發(fā)明提供了在載體骨架中含有八氫番茄紅素合酶基因的DNA構(gòu)建體，當(dāng)在植物中過度表達(dá)時，降低了植物細(xì)胞再生為完整植物的速度，因此提供了相對不含有載體骨架的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的可選擇優(yōu)勢。包括GGPP合酶的其它GA生物合成途徑酶(美國專利6,410,356)也可用于本發(fā)明。例如從菜豆、擬南芥、大豆、玉米和棉花(美國專利6,670,527和美國專利申請公開US20020053095，通過引用結(jié)合到本文中)中分離到的GA 2-氧化酶基因序列可以用來降低GA的水平，并在植物組織培養(yǎng)物中延遲莖干伸長。通過降低生物活性的赤霉素的水平，實(shí)現(xiàn)GA 2-氧化酶基因產(chǎn)物的功能。2-氧化酶對生物活性的GA如GA1和GA4的羥基化作用使其失活，而生物合成前體如GA9和GA20的羥基化作用，對于GA生物合成酶而言產(chǎn)生了非優(yōu)選的底物。2-氧化酶蛋白的過度表達(dá)因此能夠用來直接失活GA或通過影響底物水平間接下調(diào)內(nèi)源性生物活性GA的水平，由此延遲了莖干的再生。本發(fā)明提供了含有本文描述的GA相關(guān)酶的DNA構(gòu)建體，其中植物表達(dá)盒含有編碼這些GA相關(guān)酶的多核酸，出現(xiàn)在載體骨架DNA上。
細(xì)胞分裂素生物合成途徑中轉(zhuǎn)基因酶的過度表達(dá)顯示出影響植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物中的細(xì)胞分裂素水平。例如異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)是用于細(xì)胞分裂素合成的酶，此基因(ipt)已從根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti質(zhì)粒中分離到(Barry等，Proc.Natl.Acad.Sci.814776-4780，1984)。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶使用5′-AMP和異戊烯二磷酸催化形成異戊烯基-腺苷-5′-單磷酸，為細(xì)胞分裂素生物合成的第一個中間體。IPT的過度表達(dá)使得在轉(zhuǎn)基因植物中細(xì)胞分裂素的水平提高(Medfor等，Plant Cell 1403-413，1989)。植物細(xì)胞中IPT的表達(dá)可以誘導(dǎo)從轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體或葉片平板再生生理學(xué)異常的莖干。這種表型可以作為標(biāo)記使用(Ebinuma等，Proc.Natl.Acad.Sci.942117-2121，1997)。CKI1(cytokinin-independent 1，不依賴細(xì)胞分裂素-1)基因的表達(dá)提供了相似的表型(Kakimoto，Science 274982-985，1996)。已描述了增加的細(xì)胞分裂素水平用作植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記，例如IPT的可誘導(dǎo)控制(美國專利6,452,068和美國專利6,326,192，兩者通過引用結(jié)合到本文中)、ESR-2(美國專利6,441,276，通過引用結(jié)合到本文中)和ESR1-A(美國專利6,407,312，通過引用結(jié)合到本文中)的可誘導(dǎo)控制。在本發(fā)明中，細(xì)胞分裂素生物合成相關(guān)的蛋白優(yōu)選為組成型表達(dá)。當(dāng)這些基因在本發(fā)明DNA質(zhì)粒構(gòu)建體中作為載體骨架元件使用時，在含有載體骨架的單子葉植物細(xì)胞中誘導(dǎo)異常非胚胎產(chǎn)生的愈傷組織形成。本發(fā)明的DNA質(zhì)粒尤其適用于單子葉植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化，盡管很少產(chǎn)生含有骨架DNA的胚芽。當(dāng)用來轉(zhuǎn)化雙子葉植物細(xì)胞時，含有嵌合體細(xì)胞分裂素生物合成基因的細(xì)胞產(chǎn)生異常芽，其不能產(chǎn)生豐富的根。此外，降解細(xì)胞分裂素的酶如細(xì)胞分裂素氧化酶(美國專利6,229,066，通過引用結(jié)合到本文中)，在本發(fā)明中可以用作含有載體骨架的植物細(xì)胞的非致死負(fù)性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因。
植物生長素如吲哚-3-乙酸(IAA)影響植物細(xì)胞的生長和發(fā)育，尤其是與其它植物激素聯(lián)合使用時。細(xì)胞分裂素/植物生長素濃度比例的改變導(dǎo)致增強(qiáng)了植物的生長，優(yōu)選發(fā)生在特定組織。例如，高細(xì)胞分裂素/植物生長素比例促進(jìn)了莖的生長，相反低細(xì)胞分裂素/植物生長素比例促進(jìn)了根的生長((Depicker等，(1983)Genetic Engineeringof Plants中，T.Kosunge，C.P.Meredith和A.Hollaender，eds.，PlenumPress，New York，154頁)。嘗試增加內(nèi)源性IAA的合成，包括利用植物遺傳工程使其含有細(xì)菌IAA生物合成基因。這些基因包括土壤桿菌IAA生物合成途徑基因iaaM、iaaH、rolABC或其它從土壤桿菌種中分離到的具有提供植物生長素分子功能的根瘤或毛根基因。
通常而言，經(jīng)由細(xì)菌酶表達(dá)高水平IAA的轉(zhuǎn)基因植物顯示出表型異常(Klee等，Genes Devel.186-96，1987；Schmulling等，EMBO J.72621-2629，1988)。這種轉(zhuǎn)基因植物展現(xiàn)出比正常植物更高的結(jié)合IAA和游離IAA水平，特別是當(dāng)細(xì)菌iaaM(色氨酸單加氧酶)和/或iaaH(吲哚乙酰胺水解酶)基因與強(qiáng)效異源啟動子連接時(Sitbon，F(xiàn).(1992)Transgenic Plants Overproducing IAA--A Model System To StudyRegulation of IAA Metabolism，Swedish University of Agricultural，Umea，Sweden)。玉米(Zea mays)中結(jié)合IAA的生物合成由UDP-葡萄糖吲哚-3-基乙酰基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶所催化(EC 2.4.1.121；也稱為IAA-葡萄糖合成酶，IAGlu合成酶，IAGlu轉(zhuǎn)移酶；美國專利第5,919,998號和第6,489,541號，通過引用結(jié)合到本文中)。此酶的過度表達(dá)導(dǎo)致在組織培養(yǎng)物中細(xì)胞的異常生長。本發(fā)明考慮了植物生長素生物合成基因在載體骨架中的用途，為含有DNA質(zhì)粒載體骨架DNA的植物細(xì)胞提供了可鑒別的表型。
現(xiàn)已經(jīng)確立了乙烯的生物合成，使用S-腺嘌呤甲硫氨酸(SAM)和1-氨基環(huán)丙烷-1-甲酸(ACC)作為中間體將甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為乙烯。從SAM產(chǎn)生ACC由ACC合酶催化。ACC合酶在成熟時的果實(shí)和逆境植物(stressed plant)中產(chǎn)生，由高分歧基因家族編碼(美國專利第5,723,766號，通過引用結(jié)合到本文中)。ACC向乙烯的轉(zhuǎn)化是由乙烯形成酶(EFE)所催化(Spanu等，EMBO J 1991，10，2007)。例如，如美國專利第5,886,164號(通過引用結(jié)合到本文中)所描述，分離了1-氨基環(huán)丙烷-1-甲酸合酶(ACS)和乙烯形成酶(EFE)基因。將ACC轉(zhuǎn)化為乙烯的ACC氧化酶在大多數(shù)組織中都是組成型表達(dá)(Yang等，Ann.Rev.Plant Physiol.1984，35，155)，但在果實(shí)成熟期間被誘導(dǎo)(Gray等，Cell 199 372，427)，ACC氧化酶或其同系物的DNA和蛋白組合物是有用的，如美國專利第6,043,409號中公開的，其通過引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體考慮了載體骨架中植物表達(dá)盒的存在，其在含有載體骨架DNA的植物細(xì)胞中提供乙烯生物合成酶的過度表達(dá)。ACC脫氨基酶通過將ACC轉(zhuǎn)化為α-丁酮酸和氨，代謝ACC(美國專利第5,702,933號，通過引用結(jié)合到本文中)。表達(dá)ACC脫氨基酶的轉(zhuǎn)化植物在它們的組織內(nèi)降低了乙烯的水平。與不含有不敏感受體的植物相比，用乙烯不敏感受體ETR-1修飾的轉(zhuǎn)化植物具有乙烯敏感度減弱的特征(美國專利第5,689,055號，通過引用結(jié)合到本文中)。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體考慮了載體骨架中植物表達(dá)盒的存在，其在含有載體骨架DNA的植物細(xì)胞中提供了乙烯降解酶或乙烯不敏感受體蛋白的過度表達(dá)。
植物激素脫落酸(ABA)被認(rèn)為在胚胎發(fā)生后期起作用，主要是在胚胎發(fā)生的成熟期抑制萌發(fā)(Abscisic AcidPhysiology andBiochemistry，W.J.Davies和H.G.Jones，eds.(OxfordBios ScientificPublishers Ltd.)，99-124頁，1991)。在擬南芥和玉米中鑒定了影響種子發(fā)育和ABA不敏感的突變。檢測到擬南芥ABA不敏感(abi3)突變和玉米胎萌(vp1)突變主要在胚胎發(fā)生后期(McCarty等，Plant Cell 1，523-532，1989，和Parcy等，Plant Cell 6，1567-1582，1994)。VP1基因和ABI3基因都被分離到，并且發(fā)現(xiàn)共享了保守區(qū)域(Giraudat，J.Current Opinion in Cell Biology 7232-238，1995，和McCarty，D.R.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Bio.4671-93，1995)。VP1基因顯示出具有轉(zhuǎn)錄激活因子的功能(McCarty等，Cell 66895-906，1991)。這就暗示ABI3具有相似的功能。美國專利第6,320,102號(通過引用結(jié)合到本文中)中描述了LEC1基因和相關(guān)的突變分子，即在胚胎發(fā)生后期導(dǎo)致與lec1或lec2相似缺陷的lec2、fus3-3和abi3-3。這些突變體對干燥不耐受，有時在母體萌發(fā)，具有活化的莖干頂端分生組織。Lec2和fus3-3突變體對ABA敏感，在它們的子葉上具有香毛簇(trichomes)，因此可以被歸類為多葉子葉型突變體。abi3-3突變體屬于不同類型的后期胚芽缺陷突變，對ABA不敏感，在子葉上不具有香毛簇。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體考慮載體骨架中植物表達(dá)盒的存在，其在含有載體骨架DNA的植物細(xì)胞中提供了ABA相關(guān)蛋白的過度表達(dá)，從而提供了辨別組織培養(yǎng)植物細(xì)胞中是否具有載體骨架的方法。
擬南芥中的Bas1基因編碼了細(xì)胞色素P450(CYP 72B1)，在油菜素類固醇的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或合成中起作用。Bas1基因在植物中的過度表達(dá)，形成了墨綠色、矮小的表型，模擬了具有低水平植物激素-油菜素內(nèi)酯的植物(美國專利公開US20020073446，通過引用結(jié)合到本文中)。此基因和其它相關(guān)的植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的產(chǎn)物可以用于本發(fā)明以提供含有載體骨架DNA片段的植物異常表型，該DNA片段中包含這些基因作為非致死負(fù)性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因。
代謝干擾基因包括編碼蛋白的編碼序列，所述蛋白對內(nèi)源性植物細(xì)胞底物具有催化活性，而對細(xì)胞是非致死性的。所述底物包括但不限于單糖、脂肪酸、氨基酸或核苷酸。因此，代謝干擾基因編碼了例如生物合成途徑酶、從途徑中轉(zhuǎn)移底物的酶、降解或失活途徑底物的酶或影響途徑酶表達(dá)的基因產(chǎn)物，這些基因包括反義RNA分子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子和阻遏物。更具體而言，代謝干擾蛋白的實(shí)例包括但不限于蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)化酶和海藻糖合酶。代謝干擾基因的表達(dá)改變了植物細(xì)胞內(nèi)底物的正常產(chǎn)生和分布。結(jié)果是減少了細(xì)胞的分裂、細(xì)胞的延伸或植物再生。代謝干擾基因可以包括與內(nèi)源植物細(xì)胞基因互補(bǔ)的反義序列或當(dāng)在植物細(xì)胞中表達(dá)時減少植物細(xì)胞分裂、細(xì)胞延伸或植物再生的轉(zhuǎn)錄物。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體考慮載體骨架中植物表達(dá)盒的存在，其在含有載體骨架DNA的植物細(xì)胞中提供了代謝干擾酶或反義RNA的過度表達(dá)，所述干擾酶或反義RNA的功能是作為代謝過程的阻遏分子。可以制備DNA構(gòu)建體以提供反義RNA，當(dāng)在植物細(xì)胞中表達(dá)時可以形成雙鏈RNA分子，并且此反義RNA提供了對宿主靶基因的轉(zhuǎn)錄后基因抑制。
基因通常是指涉及產(chǎn)生多肽的DNA片段。這種DNA片段包括獨(dú)立編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)以及編碼區(qū)域前面的(5＇非編碼DNA分子)和后面的(3′非編碼DNA分子)調(diào)控分子。“天然基因”是指在自然中發(fā)現(xiàn)的基因，本身就具有調(diào)控DNA序列。“嵌合基因”是指任何非天然的基因，包括在自然中未被發(fā)現(xiàn)在一起的異源調(diào)控和編碼序列。相應(yīng)地，嵌合基因可以包含不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或同一來源但排列方式不同于在自然中所發(fā)現(xiàn)的調(diào)控序列和編碼序列。“轉(zhuǎn)基因”為通過轉(zhuǎn)化方法引入基因組從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物的基因。轉(zhuǎn)基因也可以被構(gòu)建為產(chǎn)生不編碼多肽的基因產(chǎn)物，例如反義RNA。
遺傳調(diào)控序列為基因的元件，當(dāng)作為轉(zhuǎn)基因連接時包括位于結(jié)構(gòu)多核苷酸序列上游(5′非編碼序列)、當(dāng)中或下游(3′非編碼序列)的多核苷酸分子，影響關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯。調(diào)控序列可以包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列(如美國專利第5,659,122號)、內(nèi)含子(如美國專利第5,424,412號)和多腺苷酸化識別序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可含有啟動子，能夠引起本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的過度表達(dá)，其中“過度表達(dá)”是指表達(dá)通常不存在于宿主細(xì)胞中的產(chǎn)物，或者存在于所述宿主細(xì)胞中的產(chǎn)物表達(dá)水平比編碼所述多肽的內(nèi)源性基因正常表達(dá)水平更高。能引起本發(fā)明轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物過度表達(dá)的啟動子通常為本領(lǐng)域所已知，如病毒啟動子(P-CaMV35S，美國專利第5,352,605號；P-FMV35S，美國專利第5,378,619號和第5,018,100號)、各種植物來源的啟動子如植物肌動蛋白啟動子(P-Os.Actl，美國專利第5,641,876號和第6,429,357號)。這些啟動子是通常在大多數(shù)植物組織中表達(dá)的組成型啟動子的實(shí)例。其它的組成型啟動子為植物分子生物學(xué)領(lǐng)域所知，并且用于本發(fā)明。
可以修改本發(fā)明DNA構(gòu)建體啟動子的表達(dá)水平或模式以增強(qiáng)它的表達(dá)。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將增強(qiáng)元件(例如CaMV35S啟動子的子域，Benfey等，EMBO J.91677-1684，1990)插入到基因的5′序列。在一個實(shí)施方案中，可以加入增強(qiáng)元件用來產(chǎn)生啟動子，此啟動子包含了本發(fā)明基因天然啟動子的時間和空間表達(dá)方式，但具有更高水平的表達(dá)量。相似地，通過使用特異活化或抑制基因表達(dá)的元件(例如，花粉特異性元件，Eyal等，1995 Plant Cell 7373-384)修飾啟動子的5′區(qū)域，可以實(shí)現(xiàn)啟動子的組織特異性表達(dá)。術(shù)語“啟動子序列”或“啟動子”是指一個多核苷酸分子，當(dāng)以順式與編碼多肽的結(jié)構(gòu)多核苷酸序列相連時，以指導(dǎo)一種或多種編碼多肽的mRNA分子表達(dá)的方式發(fā)揮功能。這種啟動子區(qū)域典型地被發(fā)現(xiàn)于三核苷酸ATG上游，位于多肽編碼區(qū)域起始位點(diǎn)。啟動子分子也可以包括DNA序列，從此序列開始轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)或核糖體RNA(rRNA)序列。轉(zhuǎn)錄包括合成代表DNA雙鏈中一條鏈的RNA鏈。轉(zhuǎn)錄終止反應(yīng)要求的DNA序列稱為3′轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。
優(yōu)選所選擇的具體啟動子應(yīng)該能夠引起足夠的表達(dá)，從而導(dǎo)致產(chǎn)生有效量的產(chǎn)物以引起所需的表型。除了已知的引起植物細(xì)胞中DNA轉(zhuǎn)錄的啟動子外，通過在植物cDNA庫中篩選能夠在靶組織中選擇性或優(yōu)先表達(dá)的基因，然后確定啟動子區(qū)域，可以鑒定用于本發(fā)明的其它啟動子。在植物組織培養(yǎng)以將植物細(xì)胞再生為植物的過程期間，表達(dá)相連的非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因產(chǎn)物的啟動子在本發(fā)明中尤其有用。
能夠在植物中用來表達(dá)轉(zhuǎn)基因的啟動子可以來源于編碼胚胎貯藏蛋白的基因，可以用于嵌合轉(zhuǎn)基因，所述編碼胚胎貯藏蛋白的基因包括來源于歐洲油菜(Brassica napus)的編碼2S貯藏蛋白的基因(Dasgupta等，Gene 133301-302，1993)；來源于擬南芥的2S種子貯藏蛋白基因家族；來源于歐洲油菜的編碼油質(zhì)蛋白20kD(千道爾頓)的基因(GenBank M63985)；來源于大豆的編碼油質(zhì)蛋白A(GenBankU09118)和油質(zhì)蛋白B(GenBank U09119)的基因；來源于擬南芥的編碼油質(zhì)蛋白的基因(GenBank Z17657)；來源于玉米的編碼油質(zhì)蛋白18kD的基因(GenBank J05212，Lee，Plant Mol.Biol.261981-1987，1994)和來源于大豆的編碼低分子量富硫蛋白的基因(Choi等，Mol.Gen.Genet.246266-268，1995)。來源于玉米醇溶蛋白編碼基因的啟動子(包括15kD、16kD、19kD、22kD、27kD和γ基因，Pedersen等，Cell 291015-1026，1982)可以用于嵌合轉(zhuǎn)基因。玉米醇溶蛋白是一類發(fā)現(xiàn)于玉米胚乳的貯藏蛋白。在種子組織中表達(dá)的啟動子本文中被稱為P-種子，除非另有定義。
公認(rèn)的是，已經(jīng)描述了另外的可利用啟動子，例如在美國專利第5,378,619號、第5,391,725號、第5,428,147號、第5,447,858號、第5,608,144號、第5,608,144號、第5,614,399號、第5,633,441號、第5,633,435號和第4,633,436號，所有這些專利整體結(jié)合到本文中。進(jìn)一步公認(rèn)的是，不能完全確定調(diào)節(jié)序列的確切邊界，并且不同長度的DNA片斷可以具有相同的啟動子活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以鑒定除本文所述之外的啟動子，所述啟動子在本發(fā)明中功能為提供植物細(xì)胞非致死負(fù)性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因多核苷酸分子的表達(dá)。
翻譯前導(dǎo)序列為位于基因啟動子序列和編碼序列之間的DNA遺傳元件。翻譯前導(dǎo)序列在完全加工mRNA中存在于翻譯起始序列上游。翻譯前導(dǎo)序列可以影響初級轉(zhuǎn)錄物加工為mRNA、mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例包括玉米和牽牛花熱休克蛋白前導(dǎo)序列(美國專利第5,362,865號，通引用結(jié)合到本文中)、植物病毒外殼蛋白前導(dǎo)序列、植物核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因前導(dǎo)序列和其它(Turner和Foster，molecular biotechnology 3225，1995)。
轉(zhuǎn)運(yùn)多肽通常是指多肽分子，當(dāng)與相關(guān)蛋白連接時，指導(dǎo)蛋白進(jìn)入特定的組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞部位或細(xì)胞器。實(shí)例包括但不限于葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、核導(dǎo)向信號和液泡信號。葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽在本發(fā)明中尤其有用，用于指導(dǎo)八氫番茄紅素合酶表達(dá)到葉綠體。葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)被改造為與N端蛋白融合，定向入植物葉綠體。許多葉綠體定位蛋白都從核基因表達(dá)為前體，并通過葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)定向到葉綠體，并在輸入步驟期間除去葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。葉綠體蛋白的實(shí)例包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS2，rubisco)的小亞基、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白氧化還原酶、集光復(fù)合體蛋白I和蛋白II以及硫氧還蛋白F。體內(nèi)和體外試驗證明，通過使蛋白與CTP融合，也可以將非葉綠體蛋白定向到葉綠體，而且CTP序列足夠?qū)⒌鞍锥ㄏ虻饺~綠體。合適葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，例如擬南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPSCTP(Kle等，Mol.Gen.Genet.210437-442，1987)和碧冬茄(Petuniahybrida)EPSPS CTP(della-Cioppa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 836873-6877，1986)的摻入，顯示出在轉(zhuǎn)基因植物中將異源蛋白定向到葉綠體。通過加入CTP(WO 9714807，美國專利第6,429,356號，通過引用結(jié)合到本文中)，可以將轉(zhuǎn)基因植物中的八氫番茄紅素合酶的表達(dá)定向到葉綠體。本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)，假如需要，可以制造各種嵌合構(gòu)建體，利用特殊CTP的功能將八氫番茄紅素合酶或其它非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因產(chǎn)物輸入植物葉綠體。
3′非翻譯序列或3′終止區(qū)是指位于結(jié)構(gòu)核苷酸序列下游的DNA序列，包括編碼多腺苷酸化和其它影響轉(zhuǎn)錄、mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)控信號的序列。多腺苷酸化信號在植物中的功能為致使多聚腺苷酸添加到mRNA前體的3′末端。多聚腺苷酸化序列可以來源于天然基因、各種植物基因或T-DNA。多聚腺苷酸化序列的一個實(shí)例為胭脂氨酸合酶3′序列(nos 3′；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804803-4807，1983)。Ingelbrecht等例證了不同3′非翻譯序列的用途(PlantCell 1671-680，1989)。
本文所使用的重組DNA技術(shù)中的實(shí)驗室操作為本領(lǐng)域中熟知的和常用的操作。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行克隆、DNA和RNA分離、擴(kuò)增和純化。包括DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等的酶反應(yīng)通常按照生產(chǎn)廠商的說明進(jìn)行。這些技術(shù)和其它各種技術(shù)通常依據(jù)Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(分子克隆一實(shí)驗室操作指南)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York(1989)進(jìn)行，本文稱為Sambrook等。
植物重組DNA構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化植物本發(fā)明的分離多核酸分子可以具體用于創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，其中過度表達(dá)了本發(fā)明的多肽。植物細(xì)胞中這些多肽的過度表達(dá)可以降低植物細(xì)胞再生為完整植物的速度，或產(chǎn)生不需要添加外源性底物即可容易通過眼睛辨別的表型。本發(fā)明的DNA質(zhì)粒可被轉(zhuǎn)化入轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物植物細(xì)胞。
轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物植物含有外源多核苷酸分子，插入農(nóng)作物植物細(xì)胞的基因組。農(nóng)作物植物細(xì)胞，包括但不限于進(jìn)一步組成以下部分的植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物、胚芽、分生組織部位、愈傷組織、葉、根、枝、配子體、孢子體、胚珠、花粉和小孢子、種子和果實(shí)。“外源”是指來源于植物外的被引入到植物中的多核苷酸分子。外源性多核苷酸分子可以具有天然出現(xiàn)的或非天然出現(xiàn)的核苷酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解，外源性多核苷酸分子可以是來源于不同物種的異源分子，所述物種不同于待引入多核苷酸分子的植物，或者多核苷酸可以來源于與待引入多核苷酸分子的植物相同的植物物種。當(dāng)外源性多核苷酸(轉(zhuǎn)基因)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時，可提供農(nóng)藝學(xué)重要的性狀。有農(nóng)藝學(xué)意義(GOI)的轉(zhuǎn)基因為農(nóng)作物提供了有益的農(nóng)藝學(xué)性狀，例如包括但不限于包括以下的遺傳元件除草劑抗性(美國專利第5,633,435號；美國專利第5,463,175號)、增加產(chǎn)量(美國專利第5,716,837號)、害蟲防治(美國專利第6,063,597號；美國專利第6,063,756號；美國專利第6,093,695號；美國專利第5,942,664號；美國專利第6,110,464號)、真菌病抗性(美國專利第5,516,671號；美國專利第5,773,696號；美國專利第6,121,436號；美國專利第6,316,407號和美國專利第6,506,962號)、病毒抗性(美國專利第5,304,730號和美國專利第6,013,864號)、線蟲抗性(美國專利第6,228,992號)、細(xì)菌病抗性(美國專利第5,516,671號)、淀粉生產(chǎn)(美國專利第5,750,876號和美國專利第6,476,295號、修飾油脂生產(chǎn)(美國專利第6,444,876號)、高油產(chǎn)量(美國專利第5,608,149號和美國專利第6,476,295號)、修飾脂肪酸內(nèi)含物(美國專利第6,537,750號)、高蛋白產(chǎn)量(美國專利第6,380,466號)、果實(shí)催熟(美國專利第5,512,466號)、增強(qiáng)的動物和人體營養(yǎng)(美國專利第5,985,605號和美國專利第6,171,640號)、生物多聚物(美國專利第5,958,745號和美國專利公開US20030028917)、環(huán)境應(yīng)激抗性(美國專利第6,072,103號)、藥用肽(美國專利第6,080,560號)、改進(jìn)的加工性狀(美國專利第6,476,295號)、改進(jìn)的可消化性(美國專利第6,531,648號)、低棉子糖(美國專利第6,166,292號)、工業(yè)酶生產(chǎn)(美國專利第5,543,576號)、改進(jìn)風(fēng)味(美國專利第6,011,199號)、固氮作用(美國專利第5,229,114號)、雜種生產(chǎn)(美國專利第5,689,041號)和生物燃料生產(chǎn)(美國專利第5,998,700號)，以上列舉的專利中描述的遺傳元件和轉(zhuǎn)基因通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明也提供植物重組DNA構(gòu)建體，用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備本發(fā)明的農(nóng)作物重組DNA構(gòu)建體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。這類技術(shù)描述于Sambrook等(1989)。通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或其它植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的方法，可以將通過上述方法創(chuàng)造的外源性多核苷酸分子轉(zhuǎn)入農(nóng)作物植物細(xì)胞。
DNA構(gòu)建體通常為雙Ti質(zhì)粒邊緣DNA構(gòu)建體，具有Ti質(zhì)粒的右緣(RB或AGRtu.RB)和左緣(LB或AGRtu.LB)，Ti質(zhì)粒從根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)分離到，包含T-DNA(轉(zhuǎn)化DNA)，該T-DNA與土壤桿菌細(xì)胞提供的轉(zhuǎn)移分子一起允許T-DNA整合到植物細(xì)胞的基因組。DNA構(gòu)建體也含有載體骨架DNA片段，在細(xì)菌細(xì)胞中提供了復(fù)制功能和抗生素選擇性，例如大腸桿菌復(fù)制起始區(qū)如ori322，廣譜宿主性復(fù)制起始區(qū)如Ec.oriV或oriRi，和選擇標(biāo)記的編碼區(qū)如編碼Tn7氨基糖苷腺苷轉(zhuǎn)移酶(aadA)(賦予大觀霉素或鏈霉素抗性)的Spec/Strp，或慶大霉素(Gm，Gent)選擇標(biāo)記基因。對于植物轉(zhuǎn)化，宿主細(xì)菌菌株通常為根瘤土壤桿菌ABI、C58或LBA4404，不過其它植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域技術(shù)人員已知的菌株在本發(fā)明中也可發(fā)揮功能。本發(fā)明提供的DNA構(gòu)建體在載體骨架內(nèi)含有植物表達(dá)盒，當(dāng)在植物細(xì)胞中表達(dá)是，產(chǎn)生了非致死產(chǎn)物，優(yōu)選降低植物細(xì)胞再生為完整植物的效率，或產(chǎn)生具有異常表型的植物或植物部分。
本發(fā)明DNA構(gòu)建體的T-DNA典型地包含一個或多個有農(nóng)藝學(xué)意義的轉(zhuǎn)基因，以及賦予植物細(xì)胞選擇表型的正向選擇標(biāo)記。此標(biāo)記可以提供抗正向選擇化合物的抗性，例如抗生素抗性(如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素等)或除草劑抗性(例如包括但不限于草甘磷、草銨磷、磺酰脲類、咪唑啉酮類、溴苯腈、delapon、cyclohezanedione、原卟啉原氧化酶抑制劑和isoxasfiutole除草劑)。編碼有關(guān)除草劑耐受性蛋白的多核苷酸分子為本領(lǐng)域所已知，包括但不限于編碼以下酶的多核苷酸分子5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS，描述于美國專利號第5,627,061號，第5,633,435號，第6,040,497號；Padgette等，Herbicide Resistant Crops，Lewis Publishers，53-85，1996；和Penaloza-Vazquez等，Plant Cell Reports 14482-487，1995)；草甘磷抗性的aroA(美國專利第5,094,945號)；耐受溴草腈的溴草腈腈水解酶(Bxn)(美國專利第4,810,648號)；八氫番茄紅素去飽和酶(crtI，Misawa等，(1993)Plant J.4833-840，和(1994)Plant J.6481-489)；耐受氟草敏的乙酰羥酸合酶(AHAS，aka ALS，Sathasiivan等，Nucl.Acids Res.182188-2193，1990)；耐受草銨磷和雙丙氨磷的bar基因(DeBlock等，EMBO J.62513-2519，1987)。
除了選擇標(biāo)記，也可以希望使用報道基因。在一些情況中，報道基因可以單獨(dú)或與選擇標(biāo)記一起使用。報道基因為典型地不存在于受體生物或組織中的基因，典型地編碼導(dǎo)致某些表型變化或酶特性的蛋白。Wising等，Ann.Rev.Genetics，22，421(1988)中提供了這種基因的實(shí)例，其通過引用結(jié)合到本文中。優(yōu)選的報道基因包括大腸桿菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、來源于大腸桿菌Tn9的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、來源于生物發(fā)光水母維多利亞水母(Aequorea Victoria)的綠色熒光蛋白、來源于北美螢火蟲(Photinuspyralis)的熒光素酶基因。然后在將所述基因引入受體細(xì)胞后的合適時間，進(jìn)行檢測報告基因表達(dá)的測定。優(yōu)選這種測定需要使用編碼大腸桿菌uidA基因座β-葡萄糖苷酸酶的基因以鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，如Jefferson等(Biochem.Soc.Trans.15，17-19，1987)所描述，本文稱為GUS。
通過合適的土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法，可以將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體引入所需的植物宿主基因組。對于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，合適的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒構(gòu)建體包括來源于根瘤土壤桿菌Ti質(zhì)粒的構(gòu)建體，和例如由Herrera-Estrella等，(Nature 303209，1983)；Bevan，(Nucleic Acids Res.128711-8721，1984)；Klee等，(Bio-Technology 3637-642，1985)所公開的構(gòu)建體。通過根瘤土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來轉(zhuǎn)化植物的方法包括Fraley等，(Bio/Technology 3629-635，1985)和Rogers等，(Methods Enzymol.153253-277，1987)。通過使用經(jīng)過遺傳工程改造的屬于土壤桿菌屬的土壤細(xì)菌，可以完成根瘤土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。某些土壤桿菌菌種介導(dǎo)稱為“T-DNA”的特殊DNA的轉(zhuǎn)移，其可以經(jīng)過遺傳工程改造將任何需要的DNA片段攜帶入許多植物物種。構(gòu)成T-DNA介導(dǎo)發(fā)病機(jī)理的主要事件是誘導(dǎo)致病基因和T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移。這種過程為許多綜述的題目(Ream.Ann.Rev.Phytopathol.27583-618，1989；Howard and Citovsky，Bioassays，12103-108，1990；Kado，Crit.Rev.Plant Sci.101-32，1991；Winnans，Microbiol.Rev.5612-31，1992；Zambryski，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，43465-490，1992；Gelvin，In Transgenic Plants，S.D.Kung and R.Wu eds.，Academic Press，San Diego，49-87頁，1993；Binns和Howitz，In Bacterial Pathogenesis of Plants and Arimals(Dang，J.IL.，ed.).BerlinStringer Verlag，119-138頁，1994；Hooykaas和Beijersbergen，Ann.Rev.Pliytopathol.32157-179，1994；Lessl和Lanka，Cell 77321-324，1994；Zupan和Zambryski，Ann.Rev.Phytopathol.27，583-618，1995)。
植物細(xì)胞再生技術(shù)依賴于組織培養(yǎng)生長培養(yǎng)基中某些植物激素的操作，也典型地依賴于殺蟲劑和/或除草劑標(biāo)記，這些標(biāo)記與所需的核苷酸序列一起被引入。選擇具有合適方案的方法用于來源于以下的宿主豆科(Leguminoseae)(苜蓿、大豆、三葉草等)，傘形科(Umbelliferae)(胡蘿卜、芹菜、歐洲防風(fēng))，十字花科(Cruciferae)(卷心菜、蘿卜、canolal/油菜等)，葫蘆科(Cucurbitaceae)(甜瓜和黃瓜)，禾本科(Gramineae)(小麥、大麥、稻、玉米等)，茄科(Solanaceae)(馬鈴薯、煙草、番茄、胡椒)，各類花卉作物如向日葵，堅果樹如扁桃、腰果、核桃和美洲山核桃。例如參見Ammirato等，Handbook of PlantCell Culture-Crop Species；Macmillan Publ.Co.(1984)；Shimamoto等，Nature 338274-276(1989)；Fromm，UCLA Symposium on MolecularStrategies for Crop Improvement，April 16-22，1990；Keystone，CO(1990)；Vasil等，Bio/Technology 8429-434(1990)；Vasil等，Bio/Technology 10667-674(1992)；Hayashimoto，Plant Physiol.93857-863(1990)和Data等，Bio-technology 8736-740(1990)。這種再生技術(shù)通常描述于Klee等，Ann.Rev.Plant Phys.38467-486(1987)。在本發(fā)明實(shí)施過程中，通過將轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體引入植物基因組轉(zhuǎn)化植物的方法和組合物可以包括任何熟知和已證明的方法。例如，在美國專利第5,824,877號、第5,591,616號和第6,384,301號中闡述了土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，以上所有專利通過引用結(jié)合到本文中。
通過實(shí)施本發(fā)明可以制備的植物包括但不限于洋槐、苜蓿、蒔蘿(aneth)、蘋果、杏、朝鮮薊、芝麻菜(arugula)、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、黑莓、藍(lán)莓、花莖甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、卷心菜、蕓苔、美國香瓜(cantaloupe)、胡蘿卜、木薯、花椰菜、芹菜、櫻桃、芫荽、柑桔、金錢橘、咖啡、玉米、棉花、黃瓜、花旗松(Douglas fir)、茄子、菊苣、茅菜(escarole)、桉樹、茴香、無花果、森林樹、葫蘆、葡萄、葡萄柚、蜜露(honey dew)、豆薯、獼猴桃、萵苣、韭蔥(leeks)、檸檬、酸柚(lime)、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、堅果、燕麥、秋葵、洋蔥、橙、觀賞植物(ornamental plant)、木瓜、歐芹(parsley)、豌豆、桃樹、花生、梨、胡椒、柿、松樹、菠蘿、車前草、李子、石榴、白楊、馬鈴薯、西葫蘆、溫柏、輻射松木、苣萵(radicchio)、蘿卜、懸鉤子、稻、黑麥、高梁、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、香楓(sweetgum)、橘子、茶、煙草、番茄、草皮(turf)、葡萄樹、西瓜、小麥、山藥和翠玉瓜(zucchini)。
提供下面的實(shí)施例以更好的說明本發(fā)明的實(shí)施，并且不應(yīng)以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，可對本文所述的方法和基因進(jìn)行各種修飾、加入、置換、截短等，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1DNA質(zhì)粒本發(fā)明的DNA質(zhì)粒為含有T-DNA片段和載體骨架片段的DNA構(gòu)建體。T-DNA側(cè)面為土壤桿菌Ti質(zhì)粒邊緣區(qū)[右緣(RB)和左緣(LB)區(qū)]，且含有正向選擇標(biāo)記基因和有農(nóng)藝學(xué)意義的基因(GOI)。載體骨架片段含有非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因和質(zhì)粒維持元件。作為對照用于比較目的的DNA質(zhì)粒含有相同或相似T-DNA表達(dá)盒，但在載體骨架中不含有非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因。
圖1中圖解了本發(fā)明質(zhì)粒的基本設(shè)計。在此圖解中，RB和LB元件側(cè)面為T-DNA，這些邊緣元件可以用其它相似元件或有關(guān)DNA分子的片斷取代，這些片斷的功能是作為土壤桿菌致病基因所提供的核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。這些選擇標(biāo)記基因可以選自許多已知的提供植物抗正向選擇化合物的基因，正向選擇化合物例如抗生素如卡那霉素、潮霉素、慶大霉素，或除草劑如草甘磷、草銨磷、磺酰脲類、咪唑啉酮類、溴草腈、delapon、cyclohezanedione、原卟啉原氧化酶抑制劑和isoxasflutole除草劑。可以選擇有農(nóng)藝學(xué)意義的基因以提供任何數(shù)量的對植物有用的性狀。本發(fā)明在DNA構(gòu)建體中提供了有農(nóng)藝學(xué)意義的基因?qū)嵗ǖ幌抻诔輨┠褪苄曰颉⒗ハx抗性基因和增產(chǎn)基因。
尤其用于在單子葉植物細(xì)胞中表達(dá)的DNA構(gòu)建體含有crtB DNA編碼序列，所述編碼序列具有相連的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶亞單位葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽前導(dǎo)序列(SSU，TS-Ps.RbcS2，美國專利第6,429,356號的SEQ ID NO1，通過引用結(jié)合到本文中)，有效連接到強(qiáng)力組成型啟動子(P-CaMV.35Sen，美國專利第5,359,142號，具有重復(fù)增強(qiáng)子的CaMV 35S啟動子)、玉米Hsp70內(nèi)含子(I-Zm.DnaK，美國專利第5,593,874號)和從根瘤土壤桿菌胭脂氨酸合酶基因(T-AGRtu.nos 3′)分離到的3′終止區(qū)，如pMON80101(圖2)中所圖解，此表達(dá)盒位于載體骨架DNA片段中。pMON80101中，T-DNA含有的植物表達(dá)盒既為選擇標(biāo)記又為有農(nóng)藝學(xué)意義的基因(草甘磷耐受性)。這種表達(dá)盒包含了來源于水稻actin1(P-Os.Actl，美國專利第5,641,876號)的啟動子、前導(dǎo)序列和內(nèi)含子，與從擬南芥ShkF基因分離到的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP2)相連，再連接到來源于根瘤土壤桿菌的aroA-CP4編碼序列(美國專利第5,633,435號)，再連接到從根瘤土壤桿菌胭脂氨酸合酶基因分離到的3′終止區(qū)。
crtB編碼序列編碼了八氫番茄紅素合酶(本發(fā)明的SEQ ID NO1，或其它編碼八氫番茄紅素合酶的DNA分子如美國專利第6,429,356號的SEQ ID NO1)，含有此crtB編碼序列的DNA構(gòu)建體被構(gòu)建為尤其用于在雙子葉植物細(xì)胞中表達(dá)，在pMON77406中有圖解(圖3)。P-CaMV.35Sen啟動子為強(qiáng)效組成型啟動子，指導(dǎo)crtB基因產(chǎn)物在植物細(xì)胞中表達(dá)。這種構(gòu)建體含有選擇標(biāo)記基因(P-FMV35S/L-Ph-Hsp70/CTP2-aroA-CP4/T-RbcS2-E9)表達(dá)盒，提供了草甘磷抗性EPSPS酶(aroA-CP4)的強(qiáng)效組成型表達(dá)。P-FMV啟動子(美國專利第5,378,619號)、從碧冬茄(Petunta hybrida)Hsp70基因(美國專利第5,362,865號)分離到的翻譯前導(dǎo)序列、從擬南芥EPSPS分離到的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP2)與aroA-CP4草甘磷抗性EPSPS編碼序列有效連接，并與豌豆核酮糖二磷酸加氧酶-羧化酶小亞基3′終止區(qū)連接，也被稱為E9。此外，也可以在T-DNA內(nèi)添加表達(dá)盒(有農(nóng)藝學(xué)意義的轉(zhuǎn)基因)，以為含有T-DNA的轉(zhuǎn)基因植物提供增強(qiáng)的農(nóng)藝學(xué)表型。
圖4中(pLAGILB01.0033)圖解的DNA構(gòu)建體含有提高產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因(P-Seed/I-Zm.DnaK-Hsp70/Cglut.CordapA/T-AGlttu.Tr7)和草甘磷選擇標(biāo)記基因。P-種子啟動子的功能是在種子組織中表達(dá)，其與玉米Hsp70內(nèi)含子連接。CordapA基因(棒桿菌(Corynebacterium)dapA，Bonnassie等，Nucleic Acids Res.186421，1990)編碼了DHDPS酶，此酶對賴氨酸的抑制作用不敏感。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)來源于根瘤土壤桿菌Tr7基因。crtB非致死負(fù)性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因位于載體骨架DNA。
圖5中(pLAGILB01.0037)圖解的DNA構(gòu)建體含有兩個昆蟲抗性轉(zhuǎn)基因，此轉(zhuǎn)基因的多核苷酸編碼Bt.EG11768蛋白(美國專利第6,242,241號)和Bt.cryIIAb蛋白(美國專利第6,489,542號)。crtB基因位于骨架DNA，由P-CaMV.35Sen啟動子驅(qū)動表達(dá)。
圖6中(pMON69869)圖解的DNA構(gòu)建體含有用于表達(dá)選擇標(biāo)記aroA:CP4的遺傳元件，此選擇標(biāo)記提供了草甘磷抗性，并且在載體骨架DNA中含有非致死負(fù)性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因和來源于根瘤土壤桿菌的編碼IPT酶多核苷酸(ipt或AGRtu.Ipt，SEQ ID NO2)。圖7中(pMON75157)圖解的DNA構(gòu)建體顯示了含有另外的遺傳元件的質(zhì)粒，所述遺傳元件用于表達(dá)AGRtu.ipt編碼序列。這種表達(dá)盒可以用在DNA質(zhì)粒載體骨架中，用于土壤桿菌介導(dǎo)的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
圖8中(pMON75182)圖解的DNA構(gòu)建體在T-DNA中含有可計分標(biāo)記基因(GUS)和正向選擇標(biāo)記基因(AGRtu.nptII的轉(zhuǎn)基因。在載體骨架DNA上含有AGRtu.ipt編碼序列。所述可計分標(biāo)記基因可用有農(nóng)藝學(xué)意義的轉(zhuǎn)基因(GOI)代替，以為農(nóng)作物提供有價值的農(nóng)藝學(xué)性狀。
圖9中(pLAGILB01.0035)圖解的DNA構(gòu)建體在T-DNA中含有提高產(chǎn)量轉(zhuǎn)基因(P-Seed/I-Zm.Dnak-Hsp70/Cglut.CordapA/T-AGRtu.Tr7)和草甘磷選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因。在載體骨架DNA中含有ipt表達(dá)盒(P-CaW.35Sen/I-Zm.DNAK/ipt/T-AGRtu.nos3′)。
圖10中(pLAGILB01.0038)圖解的DNA構(gòu)建物體含有2個昆蟲抗性轉(zhuǎn)基因，此轉(zhuǎn)基因的多核苷酸編碼了Bt.EG11768蛋白和Bt.cryIIAb蛋白。AGRtu.ipt基因位于骨架DNA，由P-CaMV.35Sen啟動子驅(qū)動表達(dá)。
圖11中(pMON75183)圖解的DNA構(gòu)建體在T-DNA中含有可計分標(biāo)記基因(GUS)的轉(zhuǎn)基因和正向選擇標(biāo)記基因(AGRtu.nptII)的轉(zhuǎn)基因。載體骨架DNA上含有codA編碼序列。codA提供了條件致死型選擇標(biāo)記。在植物再生期間，將愈傷組織轉(zhuǎn)入含有5-氟胞嘧啶的培養(yǎng)基中，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的植物細(xì)胞將被殺死，只留下不含有載體骨架DNA的植物細(xì)胞。可計分標(biāo)記基因可以用有農(nóng)藝學(xué)意義的轉(zhuǎn)基因代替，以為農(nóng)作物提供有價值的農(nóng)藝學(xué)性狀。
圖12中(pMON75181)圖解的DNA構(gòu)建體在T-DNA中含有可計分標(biāo)記基因(GUS)的轉(zhuǎn)基因和正向選擇標(biāo)記基因(AGRtu.nptII)的轉(zhuǎn)基因。該T-DNA含有同pMON75183一樣的表達(dá)盒。crtB非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因位于載體骨架DNA中。
圖13中(pMON42066)圖解的DNA構(gòu)建體在T-DNA中含有可計分標(biāo)記基因(GUS)轉(zhuǎn)基因和正向選擇標(biāo)記基因(AGRtu.nptII)的轉(zhuǎn)基因。該T-DNA中含有同pMON75183和pMON75181一樣的表達(dá)盒。在載體骨架DNA中沒有任何植物細(xì)胞非致死負(fù)性選擇標(biāo)記(沒有基因)。
圖16中(pMON73564)圖解的DNA構(gòu)建體在T-DNA中含有正向選擇標(biāo)記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉(zhuǎn)基因，并且含有包含啟動子和有關(guān)基因的表達(dá)盒。在載體骨架DNA中沒有任何植物細(xì)胞非致死負(fù)性選擇標(biāo)記(沒有基因)。
圖17中(pMON73565)圖解的DNA構(gòu)建體在T-DNA中含有正向選擇標(biāo)記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉(zhuǎn)基因，并且含有包含啟動子和有關(guān)基因的表達(dá)盒。crtB非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因位于載體骨架DNA。
圖20中(pMON67935)圖解的DNA構(gòu)建體在T-DNA中含有正向選擇標(biāo)記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉(zhuǎn)基因，并且含有包含啟動子和有關(guān)基因的表達(dá)盒。在載體骨架DNA中沒有任何植物細(xì)胞非致死負(fù)性選擇標(biāo)記(沒有基因)。
圖21中(pMON67936)圖解的DNA構(gòu)建體在T-DNA中含有正向選擇標(biāo)記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉(zhuǎn)基因，并且含有包含啟動子和有關(guān)基因的表達(dá)盒。crtB非致死負(fù)性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因位于載體骨架DNA。
圖24中(pMON83912)圖解的DNA構(gòu)建體在T-DNA中含有正向選擇標(biāo)記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉(zhuǎn)基因，并且含有包含GUS報道基因的表達(dá)盒。植物細(xì)胞表達(dá)盒位于載體骨架DNA，含有非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因，該基因編碼多花菜豆(Phaseolus coccmeus)赤霉素2-氧化酶(SEQ ID NO3)。
圖25中(pMON83908)圖解的DNA構(gòu)建體在T-DNA中含有正向選擇標(biāo)記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉(zhuǎn)基因，并且含有包含GUS報道基因的表達(dá)盒。植物細(xì)胞表達(dá)盒位于載體骨架DNA，含有非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因(CKX1，SEQ ID NO4)，該基因編碼細(xì)胞分裂素氧化酶(SEQ ID NO3)。
圖25中(pMON83907)圖解的DNA構(gòu)建體在T-DNA中含有正向選擇標(biāo)記基因(AGRtu.aroA-CP4)的轉(zhuǎn)基因，并且含有包含GUS報道基因的表達(dá)盒。植物細(xì)胞表達(dá)盒位于載體骨架DNA，含有非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因(sacB，SEQ ID NO5)，該基因編碼蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶。
可以以類似如上所述的方式構(gòu)建DNA構(gòu)建體，使在載體骨架上包含其它代謝干擾基因。這些干擾基因的實(shí)例包括但不限于編碼酵母轉(zhuǎn)化酶(SEQ ID NO6)和編碼酵母海藻糖-6-磷酸合酶(SEQ IDNO7)的多核苷酸。
實(shí)施例2農(nóng)作物轉(zhuǎn)化將本發(fā)明所描述的DNA構(gòu)建體(如pMON42066、pMON75181、pMON75182和pMON75183)轉(zhuǎn)化入無害的土壤桿菌菌株中。例如通過三親交配法(Ditta等，Proc.Natl.Acad.Sci.777347-7351，1980)，或通過電穿孔法，將DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)入土壤桿菌。土壤桿菌的液體培養(yǎng)物從甘油保藏物或新鮮劃線平板開始，并在pH7.0、含有適當(dāng)抗生素的LB液體培養(yǎng)中，26℃-28℃振蕩(大約150rpm)培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長中期。將土壤桿菌細(xì)胞重懸浮于接種培養(yǎng)基，并調(diào)整OD660至約為1。
使用本領(lǐng)域已知的各種方法，通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，進(jìn)行玉米細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和細(xì)胞再生為完整的能育植物。例如，使表面已滅菌的玉米種子發(fā)芽，并將幼苗切成碎片。將每一個具有傷口表面的苗碎片向下置于半固體愈傷組織誘導(dǎo)MSW57培養(yǎng)基，每個平皿中放置10-16個碎片，置于28℃光Percival培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(16小時光周期)。2-4星期后，將有胚胎產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)入新鮮MSW57培養(yǎng)基中，28℃黑暗下培養(yǎng)2-3星期。
在培養(yǎng)皿(100mm×25mm)中選擇先前再次培養(yǎng)了6-8天的愈傷組織碎片。每一個平皿含有300-500個愈傷組織碎片。每1ml土壤桿菌懸浮液(該土壤桿菌含有本發(fā)明的DNA質(zhì)粒)中加入1μl F-68(Pluronic F-68溶液10％ Sigma-Aldrich，St Louis，MO)，然后將足夠的此懸浮液覆蓋所述組織。室溫下培養(yǎng)5-20分鐘。用頂端精密的移液管除去土壤桿菌懸浮液。傾倒愈傷組織碎片于培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿底部有3片無菌濾紙(Whatman#1，直徑為8.5或9cm)，在頂部有2片濾紙。倒置幾次，對它們進(jìn)行簡單印跡。將愈傷組織碎片(每60-100個)轉(zhuǎn)入無水或無培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，此平皿帶有1片濾紙，用石蠟?zāi)っ芊馄矫蟆Ｔ诤诎抵?3℃培養(yǎng)平皿2-3天。
通過將2片氈(2cm×2cm平方)置于各個培養(yǎng)皿中，制備培養(yǎng)平板，每個培養(yǎng)平板中含有23-25ml MSW57/C500/P100(羧芐青霉素500mg/L，巴龍霉素100mg/L)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成參見表1。將愈傷組織轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)平板。在轉(zhuǎn)移的時候，將愈傷組織分成小碎片(2-3mm)，每個培養(yǎng)平板可以含有16-25個愈傷組織碎片。黑暗中27℃下培養(yǎng)平板大約2星期。去除選擇培養(yǎng)基，然后加入18-20ml新鮮培養(yǎng)基。黑暗中27℃下培養(yǎng)平板大約2星期。去除選擇培養(yǎng)基，用18-20ml MS/6BA/C250/P100培養(yǎng)基代替(將轉(zhuǎn)化的組織轉(zhuǎn)入含有25mg/L-1000mg/L 5-氟胞嘧啶的培養(yǎng)基中，所述組織用包含codA基因的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化)。將平板移至光培養(yǎng)箱(16小時光周期，27℃)培養(yǎng)5-7天，然后將生長組織移至MSOD/C250/P100固體培養(yǎng)基。在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約2星期。愈傷組織將再生為有根或無根的綠色莖干。這些莖干應(yīng)當(dāng)看起來健康，并且容易與一些小莖干區(qū)別。將健康的莖干轉(zhuǎn)入用3g/l Phytagar固化的MSOD/C250/P100培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)移時，除去附著在莖干的根區(qū)域的愈傷組織。培養(yǎng)擴(kuò)大莖干和根，然后轉(zhuǎn)入土壤。
表1.培養(yǎng)基組成MSW57
通過植物轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)領(lǐng)域已知的方法，可以轉(zhuǎn)化雙子葉植物細(xì)胞并再生為完整的植物。使用土壤桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)移本發(fā)明質(zhì)粒的T-DNA為本領(lǐng)域所熟知。例如棉花(美國專利第5,004,863號；美國專利第5,159,135號；美國專利第5,518,908號，通過引用結(jié)合到本文中)、大豆(美國專利第5,569,834號；美國專利第5,416,011號，通過引用結(jié)合到本文中)。
上述轉(zhuǎn)化和再生方法提供了載體骨架DNA出現(xiàn)大大減少的植物。此外，該植物還具有插入T-DNA的拷貝數(shù)降低的優(yōu)點(diǎn)。通過該方法生產(chǎn)的植物是本發(fā)明的一個方面。
實(shí)施例3骨架DNA和拷貝數(shù)的分子分析從用本發(fā)明DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的并由植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物再生的植物中分離組織樣品，從該組織樣品中抽提DNA。使用基于PCR的方法測定DNA，確定Ec.oriV DNA片斷是否存在，該Ec.oriV DNA片斷為載體骨架的指示。這種DNA靠近LB，其存在于從再生植物抽提的DNA中表明發(fā)生了超過了LB的載體序列轉(zhuǎn)移。可通過許多方法從植物組織中分離DNA，例如CTAB方法(Rogers等，Plant Mol.Biol.569-76，1985)或按照廠家說明書使用DEAeasyTM 96植物試劑盒(Cat.#69181，Qiagen Inc.，Valencia，CA)。Taqman(PE AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)被描述為檢測和定量DNA序列存在的方法，按照廠家提供的說明書完全可以理解。表2中列舉的DNA引物分子用于所描述的方法中，以鑒定來源于植物提取物的Ec.oriVDNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改變條件和裝置而提供相同的結(jié)果。
使用以下質(zhì)粒轉(zhuǎn)化玉米植物細(xì)胞對照DNA質(zhì)粒(pMON42066)、在載體中具有條件致死基因的DNA質(zhì)粒(pMON75183)、具有非致死選擇標(biāo)記基因的DNA質(zhì)粒(ipt，pMON75182)和具有非致死選擇標(biāo)記基因的DNA質(zhì)粒(crtB，pMON75181)，然后再生為完整的植物。分析完整植物是否存在Ec.oriV。
圖14顯示了此分析結(jié)果。35株使用對照質(zhì)粒(沒有基因，pMON42066)轉(zhuǎn)化后再生的植物中，大約有一半為Ec.oriV DNA陽性，且77株用條件致死基因質(zhì)粒(codA，pMON75183)轉(zhuǎn)化的植物中約35％為陽性。令人驚訝的是，非致死選擇標(biāo)記基因，ipt和crtB，按預(yù)期減少了具有Ec.oriV DNA的轉(zhuǎn)基因植物的出現(xiàn)。83株用pMON75182轉(zhuǎn)化的植物中只有5％含有Ec.oriV DNA，61株用pMON75181轉(zhuǎn)化的植物中只有8％含有Ec.oriV DNA。
這些結(jié)果證明，通過減少載體骨架的出現(xiàn)，本發(fā)明DNA質(zhì)粒帶來了實(shí)質(zhì)性益處。用常規(guī)DNA質(zhì)粒結(jié)構(gòu)(pMON42066)轉(zhuǎn)化的植物中接近一半將被清除。使用本發(fā)明DNA質(zhì)粒(pMON75182，pMON75181)轉(zhuǎn)化的植物中，被清除的少于10％。
表2Ec.OriV Endpoint Taqman測定-10uL反應(yīng)
條件MJ引擎
另一個商業(yè)化轉(zhuǎn)基因植物的重要因素是低插入復(fù)雜性的出現(xiàn)。這通常指的是低拷貝數(shù)。假如插入的拷貝數(shù)太高，很難選擇子代并成功繁殖轉(zhuǎn)基因性狀。理想的是，只有單拷貝的轉(zhuǎn)基因能存在于轉(zhuǎn)基因植物中。若干分子生物學(xué)領(lǐng)域已知的方法可以檢測拷貝數(shù)。DNA印跡分析是最常用的方法。使用Taqmant技術(shù)的方法也可以精確且可靠的檢測插入轉(zhuǎn)基因植物的T-DNA的拷貝數(shù)。表3中列舉的方法和DNA引物分子表明怎樣測定植物是否存在nptII編碼序列。含有nptII選擇標(biāo)記基因的表達(dá)盒存在于pMON42066、pMON75183和pMON75182中。通過Taqman方法對用這些DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物進(jìn)行拷貝數(shù)測定，結(jié)果顯示在
圖15中。骨架中沒有基因的質(zhì)粒(pMON42066)顯示，所測定的34株植物的平均拷貝數(shù)約為2，只有47％為單拷貝。條件致死選擇標(biāo)記(codA，pMON75183)質(zhì)粒顯示，測定的50株植物的平均拷貝數(shù)約為2，只有36％的植物為單拷貝。非致死選擇標(biāo)記基因(ipt，pMON75182)質(zhì)粒顯示，測定的27株植物的平均拷貝數(shù)為1.2，令人驚訝的是，85％的轉(zhuǎn)基因植物為單拷貝。結(jié)果表明本發(fā)明質(zhì)粒降低轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的價值。
表3.NPTII Taqman測定ABI 7900(384孔板)
條件MJ引擎
例如，使用前述的方法將DNA構(gòu)建體pMON73564和pMON73565轉(zhuǎn)化入玉米細(xì)胞。使用前述測定Ec.oriV DNA的條件測定所得的轉(zhuǎn)基因玉米植物是否存在骨架DNA。
圖18中顯示的結(jié)果表明，幾乎所有用pMON73565(crtB+，骨架中的非致死選擇標(biāo)記基因)轉(zhuǎn)化后再生的植物(N＝104)都沒有Ec.oriV。用對照構(gòu)建體pMON73564(crtB-，骨架中沒有標(biāo)記基因)轉(zhuǎn)化的植物(N＝115)中40％在它們的基因組中含有Ec.oriV DNA。測定相同組的植物的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示在
圖19中。這些結(jié)果表明，與用pMON73564構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物相比，實(shí)質(zhì)上更多的用pMON73565(crtB+構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的植物具有低拷貝數(shù)，且無骨架，該pMON73564在骨架中不含有非致死選擇標(biāo)記基因。這些結(jié)果證明，DNA構(gòu)建體中非致死選擇標(biāo)記基因的應(yīng)用提供了實(shí)質(zhì)上更多具有商業(yè)品質(zhì)的植物。
例如通過前述的轉(zhuǎn)化方法，使用DNA構(gòu)建體pMON67935和pMON67936轉(zhuǎn)化玉米細(xì)胞，從中收集的數(shù)據(jù)為載體骨架中含有的非致死選擇標(biāo)記基因的效用提供了另外的證據(jù)。使用前述檢測Ec.oriVDNA的條件測定所得的轉(zhuǎn)基因玉米植物是否存在骨架DNA。結(jié)果在圖22中顯示，表明用pMON67936(crtB+，在骨架中的非致死選擇標(biāo)記基因)轉(zhuǎn)化后再生的植物(N＝54)中超過90％不含有Ec.oriV。用對照構(gòu)建體pMON67935(crtB-，骨架中沒有標(biāo)記基因)轉(zhuǎn)化的植物(N＝84)中約40％在它們的基因組中有Ec.oriV DNA。測定相同組的植物的拷貝數(shù)，結(jié)果在圖23中顯示。這些結(jié)果表明，與用pMON67935構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物相比，實(shí)質(zhì)上更多的用pMON67936(crtB+構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的植物具有低拷貝數(shù)，且無骨架，該pMON67935在骨架中不含有非致死選擇標(biāo)記基因。這些結(jié)果證明，DNA構(gòu)建體中非致死選擇標(biāo)記基因的應(yīng)用實(shí)質(zhì)上提供了更多具有商業(yè)品質(zhì)的植物。
已經(jīng)闡明和描述了本發(fā)明的原則，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，可以在排列和細(xì)節(jié)上改變本發(fā)明而不背離這種原則。我們要求保護(hù)后附權(quán)利要求書的精神和范圍之內(nèi)的所有修改。
本說明書中引用的所有出版物和出版的專利文件都通過引用結(jié)合到本文中，其程度等同于具體和單獨(dú)地指出各出版物和專利申請通過引用結(jié)合到本文中。
序列表<110>Gilbertson，Larry AKrieger，Elysia KYe.XudongZhang，Wanggen<120>增加商業(yè)化轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的DNA構(gòu)建體和方法<130>38-21(52967)B<150>60/461,459<151>2003-04-09<160>16<210>1<211>930<212>DNA<213>草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)<400>1atgagccaac cgccgctgct tgaccacgcc acgcagacca tggccaacgg ctcgaaaagt 60tttgccaccg ctgcgaagct gttcgacccg gccacccgcc gtagcgtgct gatgctctac 120acctggtgcc gccactgcga tgacgtcatt gacgaccaga cccacggctt cgccagcgag 180gccgcggcgg aggaggaggc cacccagcgc ctggcccggc tgcgcacgct gaccctggcg 240gcgtttgaag gggccgagat gcaggacccg gccttcgctg cctttcagga ggtggcgctg 300acccacggta ttacgccccg catggcgctc gatcacctcg acggctttgc gatggacgtg 360gctcagaccc gctatgtcac ctttgaggat acgctgcgct actgctatca cgtggcgggc 420
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tgggtccgcc acttcggcgc cgccaagtgg aatcgcttcg tggagatgaa gaacaagtac 560gaccccaaga ggctgctctc ccccggccag gacatcttca actga 1605<210>5<211>1605<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>5atggcggtgg tttattacct gctgctggcc gggctgatcg cctgctctca tgcactagcg 60gcaggcacgc ctgcgctcgg agacgatcgc ggccgtccct ggccagcctc cctcgccgcg 120ctggccttgg acggcaagct ccggaccgac agcaacgcga cggcggcggc ctcgacggac 180ttcggcaaca tcacgtcggc gctcccggcg gcggtcctgt acccgtcgtc cacgggcgac 240ctggtggcgc tgctgagcgc ggccaactcc accccggggt ggccctacac catcgcgttc 300cgcggccgcg gccactccct catgggccag gccttcgccc ccggcggcgt cgtcgtcaac 360atggcgtccc tgggcgacgc cgccgcgccg ccgcgcatca acgtgtccgc ggacggccgc 420tacgtggacg ccggcggcga gcaggtgtgg atcgacgtgt tgcgcgcgtc gctggcgcgc 480ggcgtggcgc cgcgctcctg gaccgactac ctctacctca ccgtcggcgg cacgctgtcc 540aacgcaggca tcagcggcca ggcgttccgc cacggcccac agatatctaa cgtgctggag 600atggacgtta tcaccggtca tggggagatg gtgacgtgct ccaagcagct gaacgcggac 660ctgttcgacg ccgtcctggg cgggctgggg cagttcggag tgatcacccg ggcccggatc 720gcggtggagc cggcgccggc gcgggcgcgg tgggtgcggc tcgtgtacac cgacttcgcg 780
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atgacaaacg aaactagcga tagacctttg gtccacttca cacccaacaa gggctggatg 120aatgacccaa atgggttgtg gtacgatgaa aaagatgcca aatggcatct gtactttcaa 180tacaacccaa atgacaccgt atggggtacg ccattgtttt ggggccatgc tacttccgat 240gatttgacta attgggaaga tcaacccatt gctatcgctc ccaagcgtaa cgattcaggt 300gctttctctg gctccatggt ggttgattac aacaacacga gtgggttttt caatgatact 360attgatccaa gacaaagatg cgttgcgatt tggacttata acactcctga aagtgaagag 420caatacatta gctattctct tgatggtggt tacactttta ctgaatacca aaagaaccct 480gttttagctg ccaactccac tcaattcaga gatccaaagg tgttctggta tgaaccttct 540caaaaatgga ttatgacggc tgccaaatca caagactaca aaattgaaat ttactcctct 600gatgacttga agtcctggaa gctagaatct gcatttgcca acgaaggttt cttaggctac 660caatacgaat gtccaggttt gattgaagtc ccaactgagc aagatccttc caaatcttat 720tgggtcatgt ttatttctat caacccaggt gcacctgctg gcggttcctt caaccaatat 780tttgttggat ccttcaatgg tactcatttt gaagcgtttg acaatcaatc tagagtggta 840gattttggta aggactacta tgccttgcaa actttcttca acactgaccc aacctacggt 900tcagcattag gtattgcctg ggcttcaaac tgggagtaca gtgcctttgt cccaactaac 960ccatggagat catccatgtc tttggtccgc aagttttctt tgaacactga atatcaagct 1020aatccagaga ctgaattgat caatttgaaa gccgaaccaa tattgaacat tagtaatgct 1080ggtccctggt ctcgttttgc tactaacaca actctaacta aggccaattc ttacaatgtc 1140gatttgagca actcgactgg taccctagag tttgagttgg tttacgctgt taacaccaca 1200
caaaccatat ccaaatccgt ctttgccgac ttatcacttt ggttcaaggg tttagaagat 1260cctgaagaat atttgagaat gggttttgaa gtcagtgctt cttccttctt tttggaccgt 1320ggtaactcta aggtcaagtt tgtcaaggag aacccatatt tcacaaacag aatgtctgtc 1380aacaaccaac cattcaagtc tgagaacgac ctaagttact ataaagtgta cggcctactg 1440gatcaaaaca tcttggaatt gtacttcaac gatggagatg tggtttctac aaatacctac 1500ttcatgacca ccggtaacgc tctaggatct gtgaacatga ccactggtgt cgataatttg 1560ttctacattg acaagttcca agtaagggaa gtaaaatag1599<210>7<211>1494<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevis iae)<400>7atgactacgg ataacgctaa ggcgcaactg acctcgtctt cagggggtaa cattattgtg 60gtgtccaaca ggcttcccgt gacaatcact aaaaacagca gtacgggaca gtacgagtac 120gcaatgtcgt ccggagggct ggtcacggcg ttggaagggt tgaagaagac gtacactttc 180aagtggttcg gatggcctgg gctagagatt cctgacgatg agatggatca ggtgaggaag 240gacttgctgg aaaagtttaa tgccgtaccc atcttcctga gcgatgaaat cgcagactta 300ctctacaact ggttcagtaa ttctattcta tggccgttat tccattacca tcctggtgag 360atcaatttcg acgagaatgc gtggttggca tacaacgagg caaaccagac gttcaccaac 420gagattgcta agactatgaa ccataacgat ttaatctggg tgcatgatta ccatttgatg 480
ttggttccgg aaatgttgag agtcaagatt cacgagaagc aactgcaaaa cgttaaggtc 540gggtggttcc tgcacacacc attcccttcg agtgaaattt acagaatctt acctgtcaga 600caagagattt tgaagggtgt tttgagttgt gatttagtcg ggttccactc atacgattat 660gcaagacatt tcttgtcttc cgtgcaaaga gtgcttaacg tgaacacatt gcctaatggg 720gtggaatacc agggcagatt cgttaacgta ggggccttcc ctatcggtat cgacgtggac 780aagttcaccg atgggttgaa aaaggaatcc gtacaaaaga gaatccaaca attgaaggaa 840actttcaagg gctgcaagat cttagttggt gtcgacaggc tggattacat caaaggtgtg 900cctcagaagt tgcacgccat ggaagtgttt ctgaacgagc atccagaatg gaggggcaag 960gttgttctgg tacaggttgc agtgccaagt cgtggagatg tggaagagta ccaatattta 1020agatctgtgg tcaatgagtt ggtcggtaga atcaacggtc agttcggtac tgtggaattc 1080gtccccatcc atttcatgca caagtctata ccatttgaag agctgatttc gttatatgct 1140gtgagcgatg tttgtttggt ctcgtccacc cgtgatggta tgaacttggt ttcctacgaa 1200tatattgctt gccaagaaga aaagaaaggt tccttaatcc tgagtgagtt cacaggtgcc 1260gcacaatcct tgaatggtgc tattattgta aatccttgga acaccgatga tctttctgat 1320gccatcaacg aggccttgac tttgcccgat gtaaagaaag aagttaactg ggaaaaactt 1380tacaaataca tctctaaata cacttctgcc ttctggggtg aaaatttcgt ccatgaatta 1440tacagtacat catcaagctc aacaagctcc tctgccacca aaaactgatg aacc 1494<210>8<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物分子<400>8aacgcctgat tttacgcgag 20<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物分子<400>9caataccgca gggcacttat c21<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>標(biāo)記DNA引物分子<400>10cccacagatg atgtggac18<210>11
<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物分子<400>11gcctgccgca gaccaa 16<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物分子<400>12caatgcagag ctcagcttca tc 22<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>標(biāo)記DNA引物分子<400>13tccagtacgt gcagtccctc ctccc25
<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物分子<400>14cacgacgggc gttccttgc 19<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物分子<400>15ggtggtcgaa tgggcaggta gc 22<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>標(biāo)記DNA引物分子<400>16actgaagcgg gaagggactg gct 2權(quán)利要求
1.一種DNA質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含T-DNA，所述T-DNA包含土壤桿菌(Agrobacterium)Ti質(zhì)粒第一邊界區(qū)，所述第一邊界區(qū)與至少一個轉(zhuǎn)基因相連，再與土壤桿菌Ti質(zhì)粒第二邊界區(qū)相連，并且植物表達(dá)盒位于所述DNA質(zhì)粒中T-DNA外，包含與載體骨架DNA相連的植物細(xì)胞非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因。
2.權(quán)利要求1的DNA質(zhì)粒，其中所述植物表達(dá)盒包含在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動子，所述啟動子有效連接到植物細(xì)胞非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因。
3.權(quán)利要求2的DNA質(zhì)粒，其中所述啟動子為組成型啟動子。
4.權(quán)利要求2的DNA質(zhì)粒，其中所述啟動子在植物再生期間在組織培養(yǎng)物中表達(dá)所述連接的非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因產(chǎn)物。
5.權(quán)利要求1的DNA質(zhì)粒，其中所述植物細(xì)胞非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因包括植物激素生物合成途徑基因。
6.權(quán)利要求1的DNA質(zhì)粒，其中所述植物細(xì)胞非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因包括植物激素降解基因。
7.權(quán)利要求1的DNA質(zhì)粒，其中所述植物細(xì)胞非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因包括植物激素生物合成途徑底物轉(zhuǎn)移基因。
8.權(quán)利要求1的DNA質(zhì)粒，其中所述植物細(xì)胞非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因包括植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。
9.權(quán)利要求1的DNA質(zhì)粒，其中所述植物細(xì)胞非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因包括代謝干擾基因。
10.權(quán)利要求1的DNA質(zhì)粒，其中所述轉(zhuǎn)基因為選自抗生素抗性和除草劑抗性的植物正向選擇標(biāo)記基因。
11.權(quán)利要求1的DNA質(zhì)粒，其中所述轉(zhuǎn)基因包括有農(nóng)藝學(xué)意義的轉(zhuǎn)基因。
12.權(quán)利要求5的DNA質(zhì)粒，其中所述植物激素生物合成途徑基因選自赤霉酸途徑基因、細(xì)胞分裂素途徑基因、植物生長素途徑基因、乙烯途徑基因和脫落酸途徑基因。
13.權(quán)利要求5的DNA質(zhì)粒，其中所述植物激素生物合成途徑基因或其部分表達(dá)與內(nèi)源植物細(xì)胞RNA互補(bǔ)的反義RNA，其中所述反義RNA被設(shè)計用于轉(zhuǎn)錄后基因抑制。
14.權(quán)利要求6的DNA質(zhì)粒，其中所述植物激素降解基因選自赤霉酸降解基因、細(xì)胞分裂素降解基因、植物生長素降解基因、乙烯降解基因和脫落酸降解基因。
15.權(quán)利要求7的DNA質(zhì)粒，其中所述植物激素生物合成途徑底物轉(zhuǎn)移基因選自赤霉酸途徑底物轉(zhuǎn)移基因、細(xì)胞分裂素途徑底物轉(zhuǎn)移基因、植物生長素途徑底物轉(zhuǎn)移基因、乙烯途徑底物轉(zhuǎn)移基因和脫落酸途徑底物轉(zhuǎn)移基團(tuán)。
16.權(quán)利要求8的DNA質(zhì)粒，其中所述植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因選自赤霉酸途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、細(xì)胞分裂素途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、植物生長素途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、乙烯途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因和脫落酸途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。
17.權(quán)利要求9的DNA質(zhì)粒，其中所述代謝干擾基因編碼選自以下的酶生物合成途徑酶、從生物合成途徑中轉(zhuǎn)移底物的酶、降解或滅活生物合成途徑底物的酶。
18.權(quán)利要求17的DNA質(zhì)粒，其中所述酶選自蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)化酶和海藻糖合酶。
19.權(quán)利要求9的DNA質(zhì)粒，其中所述代謝干擾基因表達(dá)與內(nèi)源植物細(xì)胞RNA互補(bǔ)的反義RNA，其中所述反義RNA被設(shè)計用于轉(zhuǎn)錄后基因抑制。
20.一種增強(qiáng)選擇不含有載體骨架DNA的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括以下步驟a)用權(quán)利要求1的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化多個植物細(xì)胞；b)在正向選擇化合物上選擇所述植物細(xì)胞；c)將所選植物細(xì)胞再生為植物。
21.一種通過權(quán)利要求20的方法產(chǎn)生的植物。
22.一種減少植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的方法，所述方法包括以下步驟a)用權(quán)利要求1的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化多個植物細(xì)胞；b)在正向選擇化合物上選擇所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；c)將所選植物細(xì)胞再生為植物。
23.一種通過權(quán)利要求22的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明將非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因整合到DNA質(zhì)粒的載體骨架DNA中，用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)基因被設(shè)計為在含有DNA質(zhì)粒載體骨架DNA的植物細(xì)胞中表達(dá)非致死基因產(chǎn)物。這些非致死負(fù)性選擇標(biāo)記基因的基因產(chǎn)物涉及植物激素生物合成途徑、植物激素底物轉(zhuǎn)移、植物激素降解、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或代謝干擾。用這些DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞增加了商業(yè)化植物的產(chǎn)生。
文檔編號A01H5/00GK1809639SQ200480015511
公開日2006年7月26日 申請日期2004年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月9日
發(fā)明者L·吉爾伯特森, E·克里格爾, W·張, X·葉 申請人:孟山都技術(shù)有限公司