唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體及其構(gòu)建方法。所述唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體是通過(guò)將小鼠腮腺蛋白啟動(dòng)子上游調(diào)控區(qū)序列和可視化篩選neo-EGFP融合雙標(biāo)記整合到piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)和Lox-Cre酶系統(tǒng)中構(gòu)建得到，該轉(zhuǎn)基因載體可使目的蛋白在特定組織表達(dá)，實(shí)現(xiàn)大片段的高效整合效率；且該載體還具有便于篩選的綠色熒光標(biāo)記和真核細(xì)胞篩選的新霉素抗性基因，使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定更簡(jiǎn)單、直接、準(zhǔn)確；本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體是一種唾液腺特異表達(dá)高效整合通用載體，可用于轉(zhuǎn)基因小鼠和豬等動(dòng)物方面轉(zhuǎn)基因應(yīng)用。本發(fā)明首次克隆FVB小鼠上游調(diào)控區(qū)，克隆方法簡(jiǎn)單高效，有效克服了大片段載體構(gòu)建難度。
【專利說(shuō)明】唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種唾液腺組織特異性的高效整合轉(zhuǎn)基因載體及其構(gòu)建方法，本發(fā)明還涉及小鼠腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)的PCR擴(kuò)增片段及其克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)載體構(gòu)建主要借助基因工程限制性內(nèi)切酶、T4連接酶以及PCR技術(shù)把目的片段連接到相應(yīng)的載體骨架上，然后經(jīng)過(guò)酶切鑒定，測(cè)序驗(yàn)證，完成載體構(gòu)建。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要有時(shí)需要連接多個(gè)片段，常因限制性酶切位點(diǎn)限制，使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)越來(lái)越困難，載體片段越來(lái)越大而導(dǎo)致T4連接酶效率低下，載體構(gòu)建難度大。因此，傳統(tǒng)載體構(gòu)建技術(shù)在大載體(12Kb以上)載體構(gòu)建方面很難成功。
[0003]腮腺蛋白是腮腺中表達(dá)豐度最高的蛋白。腮腺蛋白基因定位在小鼠2號(hào)染色體上，在基因組中該基因以單拷貝形式存在，且主要在腮腺特異表達(dá)，還有研究顯示其在唾液腺的頜下腺和舌下腺也有低表達(dá)。研究顯示該基因主要是由腮腺蛋白基因的上游調(diào)控區(qū)(11.5Kb)和下游序列(約2.5~3kb)(即腮腺蛋白啟動(dòng)子PSP)調(diào)控的，但其調(diào)控基因僅在唾液腺中調(diào)控表達(dá)，在全身其他組織器官不表達(dá)。唾液腺表達(dá)外源蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物原理就是借助腮腺蛋白啟動(dòng)子可以把目的蛋白(酶或者藥物)在腮腺、舍下腺以及下頜下腺等唾液腺體經(jīng)表達(dá)后直接分泌到動(dòng)物唾液中，經(jīng)口腔進(jìn)入動(dòng)物消化道，來(lái)發(fā)揮其功能。
[0004]小鼠腮腺啟動(dòng)子(PSP)載體應(yīng)用方面最近的報(bào)道還是2001年，由加拿大的學(xué)者Serguei P.Golovan在制備環(huán)境友好動(dòng)物時(shí)應(yīng)用的,該載體結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單,僅用植酸酶基因代替原來(lái)腮腺蛋白基因，沒(méi)有篩選標(biāo)記和熒光標(biāo)記，整合效率也比較低，且整合進(jìn)基因組多已頭尾串聯(lián)形式，這種整合模式在基因組內(nèi)，更容易被沉默和丟失，因?yàn)闆](méi)有篩選標(biāo)記，該載體只適合原核注射或者ICS`I (胞漿注射)方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，動(dòng)物中經(jīng)濟(jì)價(jià)值較大是豬，但豬受精卵不透明，看不到原核。且豬早期胚胎收集難度大，技術(shù)難題大。其載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0005]2006年由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)伊海芳構(gòu)建2個(gè)豬腮腺蛋白啟動(dòng)子(PSP)載體，除了載體骨架，這兩個(gè)載體都采用豬PSP部分上游調(diào)控區(qū)序列(IOkb)連接植酸酶基因，其差異在其后面加尾信號(hào):一個(gè)是bGH-pA ;另一個(gè)是豬腮腺蛋白PSP下游的Poly-PA。這兩個(gè)載體都帶一個(gè)藥物篩選基因neo。雖然這兩個(gè)載體可以進(jìn)行藥物篩選，但沒(méi)有可視標(biāo)記，對(duì)篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞很難確認(rèn)，仍是傳統(tǒng)載體，其整合模式與Serguei P.Golovan構(gòu)建小鼠腿腺蛋白載體類似。但豬腮腺蛋白啟動(dòng)子由于其研究還不夠透徹，目前分析，在其上游IOKb調(diào)控區(qū)內(nèi)，調(diào)控元件不全，可能在其它區(qū)域還存在其它增強(qiáng)子區(qū)，導(dǎo)致其下游蛋白酶基因表達(dá)量低。2個(gè)豬腮腺蛋白啟動(dòng)子(PSP)載體結(jié)構(gòu)如圖2所示。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體及其構(gòu)建方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:
[0008]一種唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0009](I)、分別以質(zhì)粒 pcDNA3.1 (+)和 pT2AL200R175_CAGGS_EGFP 為模板，SEQ ID NO: 5和SEQ ID N0:6、及SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8為引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，獲得帶有若干重疊序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5-3 μ L混合后作為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，純化得到neo-EGFP融合基因；用EcoR I和Xba I雙酶切pcDNA3.1 (+)和neo-EGFP融合基因，純化回收酶切產(chǎn)物，連接，構(gòu)建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP載體；
[0010](2)、以質(zhì)粒 pPB-UbC-EGFP-neo 為模板，分別以 SEQ ID NO: 9 和 SEQ ID NO: 10、及 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 作為引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增得到 Not 1-5-PB-Not I，Xho 1-3-PB-Xho I，分別采用Not I和Xho I酶切后，連接在載體pPSPBGPneo-XynB上，得到載體 pPSPBGPneo-PB-XynB ；
[0011](3)、以步驟(1)得到的pcDNA-neo-T2A-EGFP載體為模板，用長(zhǎng)片段PCR體系，SEQID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 作為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增得到 infusion-CMV-neo-T2A_EGFP 片段，切膠純化；用Cla I和Bgl II雙酶切步驟⑵得到的載體pPSPBGPneo-PB-XynB，對(duì)目的片段切膠純化；將infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重組到pPSPBGPNeo-PB-XynB載體的兩個(gè)1xp 位點(diǎn)中間，得到 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 載體；
[0012](4)、以步驟(3)得到的 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 載體為模板，SEQ IDNO: 15和SEQ ID NO: 16作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到載體中的pPB-lox—neoEGFP—loxp片段，并添加AgeI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，純化，得到新載體骨架；
[0013](5)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調(diào)控區(qū)的PCR擴(kuò)增片段為模板，SEQ ID N0:17和SEQID勵(lì):18為引物，擴(kuò)增得到小鼠腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)的下游400%?片段，將400%?片段與新載體骨架pPB-lox-neoEGFP-`loxp中的重組序列進(jìn)行重組，得到中間載體I ;
[0014](6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調(diào)控區(qū)的PCR擴(kuò)增片段為模板，以SEQ ID N0:19和SEQ ID N0:20為引物，擴(kuò)增得到小鼠腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)的下游4706bp片段；將其重組到步驟(5)的中間載體I的StuI位點(diǎn)，即為中間載體2 ；
[0015](7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調(diào)控區(qū)的PCR擴(kuò)增片段為模板，以SEQ ID N0:21和SEQ ID NO: 22為引物，利用AgeI位點(diǎn)，擴(kuò)增得到小鼠腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)的下游3956bp片段；將其重組到步驟出)的中間載體2上，得到載體pPB-MusPSP-neo-EGFP，即為唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體。
[0016]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟(5)-(7)中的小鼠腮腺蛋白基因上游調(diào)控區(qū)的PCR擴(kuò)增片段的克隆方法為:以FVB小鼠基因組DNA為模板，SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2為引物，KOD-FX聚合酶進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增；以第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4為引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，即得。
[0017]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟(5)-(7)中第一次PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?94°C2min ；98°C 10s, 74 °C 13min, 5cycles ；98°C 10s, 72 °C 13min, 5cycles ；98°C 10s, 70 °C13min, 5cycles ；98°C 10s, 68°C 13min, 30cycles ；68°C 7min ;所述第二次 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?94°C 2min ；98°C 10s, 68°C 13min, 30cycles ；68°C 7min。
[0018]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(1)中所述第一次PCR的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 2min ；98°C 10s，68°C 50s，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;第二次 PCR 反應(yīng)程序:98°C 2min ；98°C 10s,68°C lmin40s，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0019]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2)中所述PCR的反應(yīng)程序?yàn)?94°C 30s ；55°C 30s, 35個(gè)循環(huán)；72°C 30s, 72°C 3min，30個(gè)循環(huán)；步驟(3)中所述PCR的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 2min ；98 °C 10s, 68 °C 4min，35個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;步驟(4)-(7)中所述PCR的反應(yīng)程序?yàn)?980C Imin ；98°C IOs ；60°C 5s ；72°C 2min; 35 個(gè)循環(huán)；72°C 2min。
[0020]本發(fā)明還提供了上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0022]1、本發(fā)明的唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體是通過(guò)將小鼠腮腺蛋白啟動(dòng)子(MusPSP)上游12.1kb的上游調(diào)控區(qū)序列和可視化篩選neo-EGFP融合雙標(biāo)記整合到piggyBac高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)和Lox-Cre酶系統(tǒng)中而構(gòu)建得到的,該轉(zhuǎn)基因載體可以實(shí)現(xiàn)目的蛋白在特定組織表達(dá)(具有在小鼠，豬等動(dòng)物腮腺特異表達(dá)的能力)，可在轉(zhuǎn)座酶輔助下實(shí)現(xiàn)大片段(IOkb以上)的高效整合效率；且該載體還具有便于篩選的綠色熒光標(biāo)記EGFP和真核細(xì)胞篩選的neo新霉素抗性基因，使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定更簡(jiǎn)單、直接、準(zhǔn)確；同時(shí)考慮公眾對(duì)篩選標(biāo)記安全擔(dān)憂，該標(biāo)記又可以借助loxP-cre酶系統(tǒng)一次性精確測(cè)定刪除。只需要把目的基因插入本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體中ASCI位點(diǎn)，就可以用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物小鼠和豬等動(dòng)物生產(chǎn)，具有簡(jiǎn)單，方便，安全的特點(diǎn)。
[0023]2、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體是一種唾液腺特異表達(dá)高效整合通用載體，可用于轉(zhuǎn)基因小鼠和豬等動(dòng)物方面轉(zhuǎn)基因應(yīng)用，既可以用于傳統(tǒng)的原核注射，胞漿注射，又可以用于體細(xì)胞克隆細(xì)胞系篩選等，與現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因平臺(tái)有很好的兼容性。
[0024]3、本發(fā)明通過(guò)4片段重組方法，即利用多對(duì)重疊引物對(duì)大片段序列擴(kuò)增，將其人為打斷后，利用擴(kuò)增片段產(chǎn)生的同源重組接頭，在重組酶輔助下，一段段重組在一起，首次克隆FVB小鼠上游調(diào)控區(qū)，并克隆到載體中，經(jīng)測(cè)序，該調(diào)控區(qū)不同于文獻(xiàn)報(bào)道的調(diào)控區(qū)。該克隆方法簡(jiǎn)單高效，在技術(shù)上有效克服了大片段載體(12Kb以上)構(gòu)建難度。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為Serguei P.Golovan構(gòu)建的轉(zhuǎn)植酸酶載體；
[0026]圖2為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)伊海芳(2006)構(gòu)建的兩個(gè)豬腮腺蛋白轉(zhuǎn)基因載體；
[0027]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1的pPB-MusPSP-neoEGFP載體的構(gòu)建示意圖；
[0028]圖4為實(shí)施例1中克隆得到的MusPSP的PCR圖譜，其中A為MusPSP上游調(diào)控區(qū)克隆(_11503bp ~+1390bp) ;B 為 MusPSP 上游調(diào)控區(qū)克隆(_11325bp ~+980bp)；
[0029]圖5為實(shí)施例1中Neo-T2A-EGFP的酶切鑒定電泳圖，其中1、2、3分別代表T2A-EGFP (765bp)，neo-T2A (835bp)，neo-T2A_EGFP (1600bp)；
[0030]圖6為實(shí)施例1中pcDNA-Neo-T2A-EGFP的酶切鑒定電泳圖，其中1、2代表pcDNA-Neo-T2A-EGFP的目的條帶1590bp，3代表1和2的質(zhì)粒對(duì)照；
[0031 ] 圖7為實(shí)施例1中pPSPBGPneo-PB- XynB載體的酶切鑒定電泳圖，其中M代表Marker2000 ; 1、2 為 pPSPBGPneo-PB-XynB 質(zhì)粒對(duì)照，3、4 分別代表該質(zhì)粒 Xho I 和 Not I 的酶切結(jié)果；
[0032]圖8為實(shí)施例1中pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB_XynB載體的酶切鑒定電泳圖，其中M 代表 DL DNA15000Marker ;泳帶 I 代表 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB_XynB 載體質(zhì)粒對(duì)照，2、3代表1的酶切結(jié)果，箭頭所指為目的條帶2935bp ；
[0033]圖9為實(shí)施例1中小鼠腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)(MusPSP)克隆的構(gòu)建示意圖；
[0034]圖10為實(shí)施例1中MusPSP調(diào)控區(qū)片段l(-3143bp~+865bp)克隆質(zhì)粒AscI，NotI酶切鑒定圖譜；其中帶1，2，3，4，5為不同克隆酶切鑒定，箭頭指示目的帶；
[0035]圖11為實(shí)施例1中MusPSP調(diào)控區(qū)片段2 (_7849bp~-3143) Agel、stul酶切鑒定圖譜；其中帶1，2，3為不同克隆株酶切鑒定；
[0036]圖12為實(shí)施例1中MusPSP調(diào)控區(qū)片段3 (_11805pb~_7849bp)AgeI酶切鑒定圖譜；其中帶1，2，3，4為不同克隆酶切鑒定；
[0037]圖13為實(shí)施例2中利用pPB-MusPSP-neoEGFP載體轉(zhuǎn)染PEF細(xì)胞篩選結(jié)果對(duì)比分析；上圖照片為40倍鏡下，分別在488nm波長(zhǎng)激發(fā)光下(左圖)和普通光下(右圖)的觀測(cè)結(jié)果，C1、C2、Z3、Z4代表各組轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)的觀測(cè)結(jié)果；其中，C1、C2分別為單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照I (環(huán)狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)和單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照2 (線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)；Z3、Z4為雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的各組；
[0038]圖14為實(shí)施例2中pPB-MusPSP-neo-EGFP載體轉(zhuǎn)染效率分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039]以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0040]以下實(shí)施例中所使用的引物均是委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成的。
[0041]實(shí)施例1唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建方法
[0042]請(qǐng)參閱圖3，為本發(fā)明的唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建方案圖，包括以下步驟:
[0043](I)、小鼠腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)(PSP)的克隆(包括腮腺蛋白轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及第一內(nèi)含子)
[0044]取FVB品系小鼠尾組織樣品，抽提其基因組DNA，接著以FVB小鼠基因組DNA為模板，采用KOD-FX聚合酶(Τ0Υ0Β0，日本)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。首先采用引物mpsp3497-Fl (SEQ IDNO:1), mpspl6390-Rl(SEQ ID NO:2)進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，得到小鼠腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)(_11503bp~+1390bp)，結(jié)果如圖4A所示；然后采用嵌套引物mPSP-3675_F2 (SEQ ID NO: 3)和mPSP-15980-R2(SEQ ID NO: 4)，以第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增小鼠腮腺蛋白區(qū)域(_11325bp~+980bp)，結(jié)果如圖4B所示，得到克隆FVB品系腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)MusPSP，其中引物序列如表1所示，MusPSP與文獻(xiàn)報(bào)道的序列對(duì)比的分析結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)與NCBI中提交的鼠PSP腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)增強(qiáng)子區(qū)(U73190.1, X68699.1)序列比對(duì)分析，兩個(gè)增強(qiáng)子區(qū)相識(shí)性達(dá)99%，核心啟動(dòng)子區(qū)(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游300bp)與小鼠數(shù)據(jù)庫(kù)(UCSC)比對(duì)結(jié)果完全一致，分析結(jié)果顯示本研究獲得MusPSP調(diào)控區(qū)與Golovan，S.P等(2001)制備轉(zhuǎn)基因豬和小鼠采用的腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)并不是同一來(lái)源的。
[0045]表1小鼠腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)(PSP)的克隆引物
【權(quán)利要求】
1.一種唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、分別以質(zhì)粒PCDNA3.1(+)和 PT2AL200R175-CAGGS-EGFP 為模板，SEQ ID NO: 5 和SEQ ID N0:6、及SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8為引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，獲得帶有若干重疊序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5_3 μ L混合后作為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，純化得到neo-EGFP融合基因；用EcoR I和Xba I雙酶切pcDNA3.1 (+)和neo-EGFP融合基因，純化回收酶切產(chǎn)物，連接，構(gòu)建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP載體； (2)、以質(zhì)粒pPB-UbC-EGFP-neo 為模板，分別以 SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10、及 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 作為引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增得到 Not 1-5-PB-Not I，Xho 1-3-PB-Xho I，分別采用Not I和Xho I酶切后，連接在載體pPSPBGPneo-XynB上，得到載體 pPSPBGPneo-PB-XynB ； (3)、以步驟(1)得到的pcDNA-neo-T2A-EGFP載體為模板，用長(zhǎng)片段PCR體系，SEQIDNO: 13 和 SEQ ID NO: 14 作為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增得到 infusion-CMV-neo-T2A_EGFP 片段，切膠純化；用Cla I和Bgl II雙酶切步驟(2)得到的載體pPSPBGPneo-PB-XynB，對(duì)目的片段切膠純化；將infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重組到pPSPBGPNeo-PB-XynB載體的兩個(gè)1xp 位點(diǎn)中間，得到 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 載體； (4)、以步驟(3)得到的pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 載體為模板，SEQ ID NO: 15 和SEQ ID NO: 16作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到載體中的pPB-lox-neoEGFP-loxp片段，并添加AgeI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，純化，得到新載體骨架； (5)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調(diào)控區(qū)的PCR擴(kuò)增片段為模板，SEQID NO: 17和SEQ IDNO: 18為引物，擴(kuò)增得到小鼠腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)的下游4009bp片段，將4009bp片段與新載體骨架pPB-lox-neoEGFP-loxp中的重組序列進(jìn)行重組，得到中間載體I ; (6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調(diào)控區(qū)的PCR擴(kuò)增片段為模板，以SEQID NO: 19和SEQID N0:20為引物，擴(kuò)增得到小鼠腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)的下游4706bp片段；將其重組到步驟(5)的中間載體I的StuI位點(diǎn)，即為中間載體2 ； (7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調(diào)控區(qū)的PCR擴(kuò)增片段為模板，以SEQID N0:21和SEQID NO:22為引物，利用AgeI位點(diǎn)，擴(kuò)增得到小鼠腮腺蛋白上游調(diào)控區(qū)的下游3956bp片段；將其重組到步驟(6)的中間載體2上，得到載體pPB-MusPSP-neo-EGFP，即為唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(5)-(7)中的小鼠腮腺蛋白基因上游調(diào)控區(qū)的PCR擴(kuò)增片段的克隆方法為:以FVB小鼠基因組DNA為模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2為引物，KOD-FX聚合酶進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增；以第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4為引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述第一次 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?94°C 2min ;98°C 10s, 74 °C 13min, 5cycles ；98 °C 10s, 72 °C 13min, 5cycles ；98 °C 10s, 70 °C 13min, 5cycles ；98 °C 10s, 68 °C13min, 30cycles ；68 °C 7min ;所述第二次 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?94 °C 2min ；98 °C10s, 68°C 13min, 30cycles ；68°C 7min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中所述第一次PCR的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 2min ；98°C 10s,68°C 50s，35個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;第二次 PCR 反應(yīng)程序:98°C 2min ；98°C 10s，68°C lmin40s，35 個(gè)循環(huán)；72°CIOmin0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中所述 PCR 的反應(yīng)程序?yàn)?94°C 30s ；55°C 30s，35 個(gè)循環(huán)；72°C 30s, 72°C min，30個(gè)循環(huán)；步驟⑶中所述PCR的反應(yīng)程序?yàn)?98°C 2min ；98°C 10s，68°C 4min，35個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;步驟(4)-(7)中所述 PCR 的反應(yīng)程序?yàn)?98°C Imin ；98°C IOs ；60°
C 5s;72°C 2min;35 個(gè)循環(huán)；72°C 2min。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的唾液腺組織特異性的轉(zhuǎn)基因載體。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103509812SQ201310343067
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月7日
【發(fā)明者】張獻(xiàn)偉, 吳珍芳, 李紫聰, 劉德武 申請(qǐng)人:吳珍芳, 李紫聰