專利名稱：一種器官保存液及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物學和醫學領域，尤其是涉及一種器官保存液及其制備方法。
背景技術：
器官移植是20世紀人類醫學科學的重大進展。目前，全世界在肝臟、腎臟、心臟、胰腺和骨髓移植的領域的移植總數已超過70萬例(次)，存活最長的器官移植受者已近半個世紀。器官移植是本世紀醫學發展的主要方向之一，是治療終末期器官衰竭唯一有效的根治手段。任何臨床器官移植首先要有高質量的供體，這是器官移植成功的先決條件和根本保障，作為器官移植學三大支柱之一的器官保存是器官移植的基石。
1987年，Folkert O.Belzer博士領導的美國WISCONSIN大學實驗小組成功研制了一種低溫保存液——UW液，極大地延長了肝臟、腎臟、胰腺、心臟、肺和小腸等器官的保存時間，推動了世界器官移植的快速發展。UW液的成分是羥乙基淀粉50克/升、乳酸(內酯)35.83克/升、KH2PO43.4克/升、MgSO4·7H2O 1.23克/升、棉子糖17.83克/升、腺苷1.34克/升、別嘌呤醇0.136克/升、總谷胱甘肽0.922克/升、KOH 5.61克/升、pH為7.4胰島素40單位青霉素G 20萬單位、地塞米松16mg。
UW液的特點有(1)不使用代謝活躍的葡萄糖來維持滲透壓，而用乳糖醛酸鹽作為非滲透陰離子，并用棉子糖作為附加的滲透支持，用來預防因體溫過低而引發的細胞水腫；(2)用谷胱甘肽、別嘌呤醇對抗氧自由基；(3)含有腺苷，可刺激ATP合成，支持能量代謝；(4)含羥乙基淀粉(250 KU)，用來防止細胞間隙膨脹和維持膠體滲透壓；(5)以磷酸鹽系統防止細胞酸中毒。臨床證實UW液可顯著延長器官體外活性，由此增加了可供移植的器官數量。目前，UW液及其各種UW型改良液已在國際上日益廣泛應用。但是目前此類保存液并不能降低器官移植過程中的灌注再損傷，對進一步提高器官移植后的存活率存在一定障礙。
由于移植器官的保存對于移植手術的成功與否至關重要，因此，本領域迫切需要開發新的器官移植保存液。
缺血再灌注損傷是缺血再灌注損傷的特殊類型，在現代臨床肝移植中越來越顯出其重要性，以往研究表明在肝臟的再灌注期，枯否氏細胞大量激活，釋放一系列的炎性損傷因子，導致肝竇內皮細胞損傷及肝功能受損。在冷保存期間導致再灌注損傷的因素已經存在，而在再灌注期通過某種途徑激活相關損傷因子，導致肝臟損傷。
盡管缺血缺氧引起細胞凋亡的機制尚不完全清楚，但缺氧引起細胞膜鈣離子通道狀態改變，導致細胞內鈣超載，已被普遍認為是細胞死亡的“最后共同途徑”。研究證明，拮抗鈣離子內流，在一定程度上能夠抑制細胞的凋亡。
鹽酸地爾硫卓為鈣離子通道阻滯藥，臨床用于在冠狀動脈痙攣引起的心絞痛，可使心外膜、心內膜的冠狀動脈擴張，緩解心絞痛，在勞力性心絞痛，它擴張周圍血管，降低血壓，減輕心臟工作負荷。由于鹽酸地爾硫卓使血管平滑肌松弛，周圍血管阻力降低，血壓下降，而用于治療高血壓。但是在器官保存液中使用鹽酸地爾硫卓未見報導。

發明內容
本發明的目的在于針對目前傳統的UW液使用中存在的不能降低器官移植過程中的灌注再損傷的實際問題，提供一種能在器官移植保存中通過抑制鈣超載，對缺血所致的器官細胞損傷有明顯的保護作用的多器官移植保存液及其制備方法。
本發明的目的是這樣實現的一種器官保存液，其特征在于，在1000ml器官保存液中含有5mol/L的NaOH溶液3ml以及羥乙基淀粉58.5～71.5g；乳糖酸鉀 37.08～45.32g；MgSO4·7H2O 1.12～1.38g；腺苷 1.61～1.97g；別嘌呤醇 0.13～0.16g；KH2PO43.15～3.85 g；蔗糖 9.23～11.29g； 谷胱甘肽 0.92～1.12g；鹽酸地爾硫卓 20mg； KOH 適量；
雙蒸水 適量；保存液的pH值為7.3～7.5。
在本發明中所述的羥乙基淀粉的分子量為200KD，取代級為0.5MS。
一種上述器官保存液的制備方法，其特征在于按照1000ml配制量的具體步驟如下(a)用去離子水配制5mol/L的NaOH溶液3ml備用；配制5mol/L的KOH溶液20ml備用；取5mol/L的KOH溶液5ml，并將0.13～0.16g的別嘌呤醇溶解于其中備用；(b)將800ml雙蒸水加入＞1000ml的容器中，再加入37.08～45.32g乳糖酸鉀攪拌至顏色變為清晰；并在攪拌中依次加入1.12～1.38gMgSO4·7H2O、備用的3ml NaOH溶液、備用的15ml KOH溶液，繼續攪拌；(c)加入1.61～1.97g腺苷，攪拌至顏色變為清晰，加入5ml溶有別嘌呤醇的KOH溶液，攪拌至顏色變為清晰；加入3.15～3.85g KH2PO4，攪拌至顏色變為清晰；加入9.23～11.29g蔗糖，攪拌至顏色變為清晰；加入0.92～1.12g谷胱甘肽，攪拌至顏色變為清晰；加入20mg鹽酸地爾硫卓，攪拌至顏色變為清晰；加入58.5～71.5g羥乙基淀粉，攪拌至顏色變為清晰；(d)用KOH混合物的pH值調至7.3～7.5，繼續加雙蒸水，至1000ml攪拌均勻，形成器官保存液；(e)所得1000ml保存液，先經0.45μm無菌濾膜濾除不溶性雜質，再用0.45μm和0.22μm無菌濾膜疊加過濾后，濾液在0℃～8℃無菌保存。
在所述的器官保存液的制備方法中配制的環境溫度為20～25℃。
本發明的優點在于鹽酸地爾硫卓是苯并噻嗪類鈣通道阻斷藥，能阻止L型鈣通道，阻止鈣內流。同時刺激鈣離子ATP酶，使胞質內鈣排除增加，增強線粒體、內質網等攝取儲存鈣的作用。在細胞膜表面存在通過介導胞漿游離鈣升高而起作用的鈣動員受體，鈣通道阻滯劑是指能選擇性地阻滯Ca2+從細胞外液經電壓依賴性鈣通道流人細胞內，從而減少細胞內Ca2+濃度的藥物，有效地預防細胞內鈣超載，從而對缺血再灌注有保護作用。在生理情況下肝細胞內外存在Ca2+濃度差但保持得相當穩定，對維持細胞的各種代謝過程十分重要。但在缺血再灌注損傷時Ca2+即可通過細胞膜上鈣通道流入細胞內，破壞了肝細胞分裂、增殖、能量代謝及氧的供求關系，細胞膜變薄，細胞膜損傷，影響線粒體呼吸功能和氧化磷酸化，ATP生成減少，使肝細抱變性、壞死。如灌注液中使用Ca2+拮抗劑，則對缺血所致的肝細胞損傷有明顯的保護作用。由于器官保存液含有鹽酸地爾硫卓，從而減輕鈣超載；并能促進平滑肌松弛及血管擴張和血流增加，提高器官和組織對缺血的耐受性，促進器官和組織功能恢復。
它含有這種逆轉因熱缺血造成的血管內皮細胞損傷藥物，能有效地防治被保存器官的血管內皮損傷。應用該保存液可有效延長移植器官的存活時間，提高移植器官在宿主體內的存活率，還可以減輕缺血再灌注損傷，它可以替代傳統的UW液應用于包括肝臟、腎臟、胰腺、心臟、等重要臟器的移植。
本發明的優點還在于采用了第三代的中分子量、低取代級的羥乙基淀粉(平均分子量為200KD，取代級為0.5MS)，與高分子量(450～480KD)羥乙基淀粉相比，其對凝血功能的影響較?。慌c低分子量(70～130KD)羥乙基淀粉相比，其清除快、體內蓄積少，有防堵毛細血管滲漏作用。
具體實施例方式
實施例1器官保存液的制備(以配制1000ml為例)原材料的準備羥乙基淀粉65g；乳糖酸鉀41.2g；MgSO4·7H2O 1.25g；腺苷1.79g；別嘌呤醇0.146g；KH2PO43.5g；蔗糖10.26g；谷胱甘肽1.02g；鹽酸地爾硫卓20mg；5mol/L的NaOH溶液3ml；足量的KOH和雙蒸水。
其中羥乙基淀粉的分子量為200KD，取代級為0.5MS。
1500ml的容器一個，量杯3個，玻璃攪拌棒1根。
制備過程具體步驟如下環境溫度為20～25℃實施。首先用去離子水配制5mol/L的NaOH溶液3ml備用；配制5mol/L的KOH溶液20ml備用；取5mol/L的KOH溶液5ml，并將0.146g的別嘌呤醇溶解于其中備用；配置中先將800ml雙蒸水加入＞1000ml的容器中，再加入41.2g乳糖酸鉀攪拌至顏色變為清晰；并在攪拌中依次加入1.25g MgSO4·7H2O、備用的3ml NaOH溶液、備用的15ml KOH溶液；繼續攪拌5分鐘；然后加入1.79g腺苷，攪拌至顏色變為清晰，加入5ml溶有別嘌呤醇的KOH溶液，攪拌至顏色變為清晰；加入3.5g KH2PO4，攪拌至顏色變為清晰；加入10.26g蔗糖，攪拌至顏色變為清晰；加入1.02g谷胱甘肽，攪拌至顏色變為清晰；加入20mg鹽酸地爾硫卓，攪拌至顏色變為清晰；加入65g羥乙基淀粉，攪拌至顏色變為清晰；最后用KOH混合物的pH值調至7.4，繼續加雙蒸水至1000ml攪拌均勻，形成器官保存液。所得1000ml保存液先經0.45μm無菌濾膜濾除不溶性雜質，再用0.45μm和0.22μm無菌濾膜疊加后過濾，在0℃～8℃保存。
實施例2器官保存液在肝移植手術中的應用受試對象家豬將家豬分成A、B、C、D、E、F六組，每組n＝12，其中供體n＝6，受體n＝6；A組供體術后移植肝用UW液冷保存12h后移植到受體；B組供體術后移植肝用實施例1提供的器官保存液(下稱“本器官保存液”)冷保存12h后移植到受體；C組供體術后移植肝用UW液冷保存24h后移植到受體；D組供體術后移植肝用本器官保存液冷保存24h后移植到受體；E組供體術后移植肝用UW液冷保存36h后移植到受體；F組供體術后移植肝用本器官保存液冷保存36h后移植到受體。
實施過程供體手術術前禁食12小時，在全身麻醉下采用經典原位肝移植的手術方式，術后予靜脈補液、輸血、抗排斥、抗感染等治療，兩天后自行進食。手術時，先以氯胺酮誘導，氣管插管，全身麻醉后，取腹部正中劍突至恥骨聯合切口，切開腹壁后推開腸道，暴露后腹膜，于腹主動脈下段前方切開后腹膜，游離主動脈下段和其右側下腔靜脈下段，并預置7號線。解剖第一肝門，于十二指腸上緣剪斷膽總管，游離肝動脈至腹腔干、腹主動脈，游離門靜脈主干，剪斷肝周韌帶，游離肝上、下腔靜脈，予結扎腹主動脈下段遠心端，向近心端插入預制的18號氣囊導尿管，注水10ml后結扎近心端，開始分別灌注HCA液500ml和UW液1000ml或HCA液500ml和本器官保存液1000ml，結扎門靜脈近腸側，向近肝側插入18號腔靜脈管，結扎近肝端，開始分別灌注HCA液500ml和UW液或實施例1的器官保存液1000ml，同時剪斷肝上、下腔靜脈開放流出道，再剪斷門靜脈和腹主動脈上段，取出供肝并稍作修剪。
保存將修剪后的肝臟按照不同的組分別放入0～4℃UW液或本器官保存液中保存備用。
受體手術術前禁食12小時，在全身麻醉下采用經典原位肝移植的手術方式，術后予靜脈補液、輸血、抗排斥、抗感染等治療，兩天后自行進食。手術時，先以氯胺酮誘導，氣管插管，全身麻醉后，取腹部正中劍突至恥骨聯合切口，依次離斷肝周圍韌帶。再解剖第一肝門，解剖膽總管全長，在左、右肝管匯合處離斷肝管。確認肝動脈，直視其至左、右半肝的兩分支，分別予以縫扎，輕輕牽開肝動脈并顯露門靜脈，將門靜脈游離，繼而游離肝上、下腔靜脈，在肝門高位將門靜脈剪斷，無肝期開始，再分別剪斷肝上、下腔靜脈。首先用4-0Prolene縫線連續縫合肝上下腔靜脈，再以5-0Prolene縫線連續縫合門靜脈，依次開放門靜脈和肝上下腔靜脈，結束無肝期，然后以4-0Prolene縫線連續縫合肝下下腔靜脈，再用7-0Prolene縫線行肝動脈的端端吻合，最后將供肝膽總管直接與受體膽總管端一端吻合，放或不放T管，先連續縫合后壁，再間斷縫合前壁，切除膽囊。嚴密止血后放引流管關腹。
肝移植后受體生存情況A組分別存活38d(死于肺部感染)、67d(死于腹腔感染)、87d(死于膽漏)和3頭＞180d。
B組分別存活43d(死于膽道并發癥)、62d(死于肺部感染)、70d(死因不明)和3頭＞180d。
結果兩組生存時間無顯著性差異。
C組分別存活18d(死于腹腔感染)、35d(死于膽漏)、46d(死因不明)和3頭＞180d。
D組分別存活33d(死于膽漏)、51d(死于嚴重營養不良)、79d(死于頑固性腹水)、85d(死于膽道感染)和2頭＞180d。
結果兩組生存時間無顯著性差異。
E組分別存活31d(死于肺部感染)、38d(死于反復腹水)、51d(死于腹腔感染)和3頭＞180d。
F組分別存活26d(死于膽漏)、37d(死因不明)、55d(死于嚴重營養不良)、83d(死于肺部感染)和2頭＞180d。
結果兩組生存時間無顯著性差異。
實施例3對實施例2所述各組受體肝移植手術后跟蹤檢測豬的肝功能，結果參見表1～表6。
表1 A細豬肝功能

表2 B組豬肝功能

結論A、B組各時間點肝功能無顯著性差異。
表3 C組豬肝功能

表4 D組豬肝功能

結論C、D組各時間點肝功能無顯著性差異。
表5 E組豬肝功能

表6 F組豬肝功能

結論E、F組各時間點肝功能無顯著性差異。
實驗證明，本器官保存液和UW液相比，在保存12小時、24小時、36小時時間段上，兩組豬在生存時間、肝功能和病理改變上，均沒有顯著性差異，提示本發明中的器官保存液在肝臟的灌注和保存上完全可以代替傳統的UW液。
實施例4本器官保存液與UW液在肝臟移植肝灌注損傷對比試驗受試對象家豬實驗分組UW組n＝6 移植肝冷保存2h；本器官保存液組n＝6移植肝冷保存2h。
(移植肝冷保存前期處理采用實施例2的供體手術實現)檢測指標高效液相色譜法測定肝組織中三磷酸腺苷含量、肝細胞內游離鈣濃度(保存2小時)，檢測結果如表7。
表7 移植肝的三磷酸腺苷ATP含量、能量負荷EC、肝細胞內游離鈣Ca2+濃度

肝細胞功能的維持必須消耗ATP，細胞內ATP的變化可以反映肝細胞的代謝活力。能量負荷(EC)＝(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)，EC作為評價肝能量代謝的指標。UW組與本器官保存液組肝細胞的ATP檢測值及EC值進行比較，本器官保存液組顯著較UW組高。UW組與本器官保存液組肝細胞內Ca2+濃度進行比較，本器官保存液組明顯低，具有顯著性差異(P＜0.01)。
供肝在灌注保存時處于缺血缺氧狀態，ATP生成主要依靠糖酵解，但生成量少，同時移植物在不斷消耗ATP，因此隨著保存時間延長，ATP含量越來越低。
本實驗用測定供肝的能量代謝情況，結果本器官保存液組肝細胞的ATP及EC檢測值顯著較UW組高，提示能降低供肝灌注保存中肝細胞的Ca2+濃度，減輕Ca2+超載，具有顯著性地減輕低溫灌洗保存下肝細胞之ATP及EC的消耗，對低溫保存的肝臟及肝細胞具有良好的保護作用從而增加移植肝的成活率。
實驗證明，本器官保存液和UW液相比，由于本器官保存液使用鈣通道阻滯劑鹽酸地爾硫卓可使細胞內的游離鈣離子濃度顯著下降，減輕肝細胞損傷，可彌補傳統UW液的不足。
上述各實施例通過例舉的一個具體配比實例，并以此制備的器官保存液在家豬的肝移植過程中與UW液進行對比，不是對本發明的一種限制，具體實施時，所述的器官保存液可以按照權利要求涉及的配比范圍和制備方法進行配制，所述的器官保存液可以替代UW液應用于包括肝臟、腎臟、胰腺、心臟等在內的多種重要臟器移植手術中的臟器保藏。
權利要求
1.一種器官保存液，其特征在于，在1000ml器官保存液中含有5mol/L的NaOH溶液3ml以及羥乙基淀粉 58.5～71.5g；乳糖酸鉀 37.08～45.32g；MgSO47H2O 1.12～1.38g；腺苷 1.61～1.97g；別嘌呤醇0.13～0.16g；KH2PO43.15～3.85g；蔗糖9.23～11.29g； 谷胱甘肽 0.92～1.12g；鹽酸地爾硫卓20mg； KOH 適量；雙蒸水 適量；保存液的pH值為7.3～7.5。
2.根據權利要求1所述的器官保存液，其特征在于所述的羥乙基淀粉的分子量為200KD，取代級為0.5MS。
3.如權利要求1或2所述的一種器官保存液的制備方法，其特征在于按照1000ml配制量的具體步驟如下(a)用去離子水配制5mol/L的NaOH溶液3ml備用；配制5mol/L的KOH溶液20ml備用；取5mol/L的KOH溶液5ml，并將0.13～0.16g的別嘌呤醇溶解于其中備用；(b)將800ml雙蒸水加入＞1000ml的容器中，再加入37.08～45.32g乳糖酸鉀攪拌至顏色變為清晰；并在攪拌中依次加入1.12～1.38gMgSO47H2O、備用的3ml NaOH溶液、備用的15ml KOH溶液，繼續攪拌；(c)加入1.61～1.97g腺苷，攪拌至顏色變為清晰，加入5ml溶有別嘌呤醇的KOH溶液，攪拌至顏色變為清晰；加入3.15～3.85g KH2PO4，攪拌至顏色變為清晰；加入9.23～11.29g蔗糖，攪拌至顏色變為清晰；加入0.92～1.12g谷胱甘肽，攪拌至顏色變為清晰；加入20mg鹽酸地爾硫卓，攪拌至顏色變為清晰；加入58.5～71.5g羥乙基淀粉，攪拌至顏色變為清晰；(d)用KOH混合物的pH值調至7.3～7.5，繼續加雙蒸水，至1000ml攪拌均勻，形成器官保存液；(e)所得1000ml保存液，先經0.45μm無菌濾膜濾除不溶性雜質，再用0.45μm和0.22μm無菌濾膜疊加過濾后，濾液在0℃～8℃無菌保存。
4.根據權利要求3所述的一種器官保存液的制備方法，其特征在于配制的環境溫度為20～25℃。
全文摘要
本發明涉及一種器官保存液及其制備方法。在1000ml器官保存液中含有5mol/L的NaOH溶液3ml及羥乙基淀粉58.5～71.5g；乳糖酸鉀37.08～45.32g；MgSO
文檔編號A01N1/02GK101019529SQ200710021020
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月22日 優先權日2007年3月22日
發明者孫倍成, 陸森, 王尤山, 羅望, 岳明 申請人:南京中脈生物醫藥有限公司