專利名稱：一種報春苣苔(Primulina tabacum Hance)組織培養(yǎng)繁殖及野外栽培方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種對珍稀瀕危植物報春苣苔(戶"附"http://朋to6ac"w Hance)的離體保存和繁育的 生物技術，具體地說，涉及一種對報春苣苔(尸n'ww""a to6ac"m Hance)的組織培養(yǎng)繁殖及野外 栽培方法。
技術背景報春苣苔CFW/m^"atok o/附Hance)為苦苣苔科多年生小型草本植物，自1881年美國人亨 利在粵北連州連江流域的石壁上發(fā)現了報春苣苔這一珍稀植物后，它又神秘消失了 120年。 直到幾年前，國內有關媒體報道了在連州又發(fā)現了報春苣苔這一國家第一批一級瀕危保護植物。它的發(fā)現對研究嶺南古氣候、土壤和動植物演變無疑具有重大的學術價值。運用植物組 織培養(yǎng)技術開展植物的保護和繁殖在很多植物種上已獲得成功。根據不同類型的植物在離體 培養(yǎng)所需要的培養(yǎng)條件及方法等方面存在很大的不同，而報春苣苔作為中國第一批重點一級 保護的珍稀瀕危保護植物，由于該物種生存環(huán)境要求特殊、地理分布狹小、種群數量很少。 目前運用植物生物技術繁殖和栽培報春苣苔，保護和利用這種珍稀瀕危植物，國內外均未見 報道。 發(fā)明內容為保護報春苣苔(尸〃> "http://""to6flcww Hance)這種珍稀瀕危植物，申請人開展了該植物組織 培養(yǎng)的研究工作，成功地誘導了體細胞胚胎發(fā)生和不定芽的形成，以此建立了有效的繁殖體 系和植株再生體系，并結合恢復生態(tài)原理實現了報春苣苔在原生地的種植存活，從而提出了 本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提出一種報春苣苔(iV/m"""a to6"c"w Hance)組織培養(yǎng)繁殖及野外栽培 方法。本發(fā)明所提出的報春苣苔(戶n'mw/^a toZ^cwn Hance)組織培養(yǎng)繁殖及野外栽培方法，其技術方案如下以野外采集的報春苣苔植株葉片作為外植體，按以下步驟進行培養(yǎng)繁殖和栽培(l)誘導培養(yǎng)步驟將報春苣苔植株葉片外植體接插到誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導報春苣苔 葉片外植體體細胞胚胎發(fā)生或/和不定芽的形成，在20 3(TC下，于黑暗培養(yǎng)或每天于1 20 pmolm—2s—H光照射12 14小時，培養(yǎng)50 70天，在外植體能夠誘導形成體細胞胚或不定 芽后，繼續(xù)培養(yǎng)20-30天，所述的誘導培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣220 440 mgL"， 蔗糖20 30g1/1， pH值6.5 7.5為基礎，另配加有NAA0.5 1.0 mgU1 +TDZ 0.5 1.0 mg L—1，或BAP0.5 1.0mgU1 +TDZ 0.2 1.0 mg L—1 ，或BAP 0.5 1.0 mg L-1 +NAA0.5
l.Omgi;1。其中NAA0.5 1.0mg1/1 +TDZ 0.5 1.0 mg U1可誘導體細胞胚胎發(fā)生；BAP 0.5 1.0 mg L" +NAA 0.5 1.0 mg L"可誘導不定芽的形成；BAP 0.5 1.0 mg L" +TDZ 0.2 1.0 mg L'1則可同時誘導體細胞胚和不定芽的形成。平均每個外植體能夠誘導80 90個 左右的體細胞胚或不定芽。(2) 叢芽繁殖步驟將體細胞胚或不定芽轉入到繁殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，條件為在20 3(TC 下，每天光照20 50pmolnT、^14小時， 一個月至一個半月繼代一次，繁殖頻率可達5 8， 所述的繁殖培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣220 440 mg L—1，蔗糖20 30 g L—1， pH值6.5 7.5為基礎，另配加有BAP0.5 1.0mgL"+NAA0.1 0.5mgL";(3) 生根培養(yǎng)步驟將叢芽分切轉入到生根培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)誘導生根，成為試管苗， 條件為20 3(TC，每天光照20 50nmolm—23_114小時，生根培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附 加鈣220 440mgU1，蔗糖20 30gU1， pH值6.5 7.5為基礎，另配加有IBA0.2 1.0 mg U1或/和0.2%活性碳，試管苗在該培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個月后進行移栽；(4) 移栽步驟將長根的試管苗移栽到移植到沙盆的基質中，放置于濕潤、遮蔭的環(huán)境下培養(yǎng)，沙盆中的基質按石灰石蛭石沙石=(1 2) : (2 4) : (1 2)的比例配置；(5) 野外移栽步驟將經上述沙盆中壯苗后的試管苗種植于石灰?guī)r洞口環(huán)境，與伴生種苔蘚一同種植。在上述的誘導培養(yǎng)步驟中，所述的誘導培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣440mgL"，蔗糖20 30gL"，pH值6.5 7.0為基礎，另配加有NAA0.5 mg L" +TDZ 1.0 mgL-1，或BAP0.5mgL-1 +TDZ0.2mgU1 ，或BAP1.0mgU1 +NAA0.5 mg L";。在上述的叢芽繁殖步驟中，所述的繁殖培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為以MS基本培養(yǎng)基，附加,丐440mgU1,蔗糖20 30gL"， pH值6.5 7.0為基礎，另配加有BAP 1.0 mg L"+NAA0.1 mgL.1。在上述的生根培養(yǎng)步驟中，所述的生根培養(yǎng)基的優(yōu)先配方為以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣440 mg L"，蔗糖20 30 g L"， pH值6.5 7.0為基礎，另配加有IBA 1.0 mg L"或/和0.2%活性碳。在上述的移栽步驟中，試管苗所移栽的沙盆中的基質按石灰石蛭石沙石=1 : 2 : i的 比例配置為佳。本發(fā)明通過提供一系列合適的配方和培養(yǎng)條件，包括從誘導、繁殖、生根、移栽等系列 基本過程的配方，使報春苣苔能夠實現其有效繁殖的目的。結合生態(tài)恢復原理將試管苗在發(fā) 現報春苣苔的當地種植，實現報春苣苔在原生地的種植成活和生態(tài)恢復。a)誘導培養(yǎng)階段通過調節(jié)生長調節(jié)劑配方，可有目的地誘導報春苣苔葉片外植體體細胞
胚胎發(fā)生或不定芽的形成； b)叢芽繁殖階段將體細胞胚或不定芽轉入到繁殖培養(yǎng)基上能夠建立叢芽繁殖體系，篩選最適培養(yǎng)基，以獲得較高的增殖頻率； C)生根階段將叢芽分切轉入到所篩選的最適生根培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)誘導生根，試管苗在該培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個月內均能夠生根；d) 移栽階段將長根的試管苗移栽到室外，利用石灰石、蛭石以及沙石的基質并附加置于 濕潤、遮蔭的環(huán)境下培養(yǎng)，產生適應報春苣苔喜歡高鈣和高pH值的生長環(huán)境，保證了 試管苗有較高的移栽成活率，其移栽成活率達到85 90%;e) 野外移栽試驗利用恢復生態(tài)學物種回歸原理，再造恢復生境，提高成活率；通過該項 目的運用，總成活率高達80%以上，能夠使這一國家一級瀕危植物得以保存和發(fā)展，利 于石灰?guī)r地區(qū)洞口的植被恢復，為今后更進一步利用該物種奠定良好的基礎。
具體實施方式
實施例一以從連州地下河景區(qū)采集的報春苣苔葉片作為外植體，進行報春苣苔(尸r/mw/z7^ toZ^a^ Hance)組織培養(yǎng)繁殖及野外栽培，具體步驟如下(1) 誘導培養(yǎng)步驟將報春苣苔植株葉片外植體接插到誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導報春苣苔 葉片外植體體細胞胚胎發(fā)生和不定芽的形成，誘導培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣440mg L"，蔗糖30 g L"， pH值7.0為基礎，另配加有BAP 0.5 mg L" +TDZ 0.2mg L"，培養(yǎng)條件 20 30°C，每天于lOnmolm—2s—^i光照射14小時，培養(yǎng)60天，在外植體能夠誘導形成體 細胞胚和不定芽后，繼續(xù)培養(yǎng)30天。平均每個外植體能夠誘導80 90個左右的體細胞胚或 不定芽。(2) 叢芽繁殖步驟將體細胞胚或不定芽轉入到繁殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，條件為在20 30'C 下，每天光照30^imolnT25—'14小時， 一個月繼代一次，所述的繁殖培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng) 基，附加鈣440 mg U1，蔗糖30 g L"， pH值6.5為基礎，另配加有BAP 1.0 mg L"+ NAAO.lmg(3) 生根培養(yǎng)步驟將叢芽分切轉入到生根培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)誘導生根，成為試管苗，條件為20 30'C，每天光照50nmolnT、^14小時，生根培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣 440mgl/1，蔗糖20gL'1， pH值6.5為基礎，另配加有IBA 1.0 mg L"和0.2%活性碳。試管 苗在該培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個月后進行移栽；(4) 移栽步驟將長根的試管苗移栽到移植到沙盆的基質中，放置于濕潤、遮蔭的環(huán)境下培養(yǎng)，沙盆中的基質按石灰石蛭石沙石=1 :2:i的比例配置；(5) 野外移栽步驟將經上述沙盆中壯苗后的試管苗種植于石灰?guī)r洞口環(huán)境，與伴生種苔蘚一同種植。
實施例二以從連州地下河景區(qū)采集的報春苣苔葉片作為外植體，進行報春苣苔(/>^"http://"" Hance)組織培養(yǎng)繁殖及野外栽培，具體步驟如下(1) 誘導培養(yǎng)步驟將報春苣苔植株葉片外植體接插到誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導報春苣苔 葉片外植體體細胞胚胎發(fā)生，誘導培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣400 mg L"，蔗糖30 g U1， pH值6.5為基礎，另配加有NAA0.5mgL" +TDZ 1.0 mg U1，培養(yǎng)條件20 30°C，每天 于5pmolm—2s—'弱光照射14小時，培養(yǎng)60天，在外植體能夠誘導形成體細胞胚后，繼續(xù)培 養(yǎng)30天。(2) 叢芽繁殖步驟將體細胞胚轉入到繁殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，條件為在20 3(TC下，每 天光照20pmolm—2s—h4小時， 一個月繼代一次，所述的繁殖培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附 加鈣400mg1/1，蔗糖30gl/1， pH值7.0為基礎，另配加有BAP 1.0mgL"+NAA0.1mgL";(3) 生根培養(yǎng)步驟將叢芽分切轉入到生根培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)誘導生根，成為試管苗， 條件為20 30'C，每天光照50pmolm—、^14小時，生根培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣 440mgL'1，蔗糖20gL"， pH值7.0為基礎，另配加有IBA 1.0 mg L"。試管苗在該培養(yǎng)基上 培養(yǎng)l個月后進行移栽；(4) 移栽步驟將長根的試管苗移栽到移植到沙盆的基質中，放置于濕潤、遮蔭的環(huán)境下培養(yǎng)，沙盆中的基質按石灰石蛭石沙石=1 :2:i的比例配置；(5) 野外移栽步驟將經上述沙盆中壯苗后的試管苗種植于石灰?guī)r洞口環(huán)境，與伴生種苔蘚一同種植。 實施例三以從連州地下河景區(qū)采集的報春苣苔葉片作為外植體，進行報春苣苔(iVfm"/z'"a to6flc"m Hance)組織培養(yǎng)繁殖及野外栽培，具體步驟如下(1) 誘導培養(yǎng)步驟將報春苣苔植株葉片外植體接插到誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)基以 MS基本培養(yǎng)基，附加鈣300mgU1，蔗糖30gL'1， pH值7.0為基礎，另配加有BAP1.0mg I/1 +NAA0.5mgL-'，培養(yǎng)條件20 30°C，每天于10 p mol nT2 s—1弱光照射14小時，誘 導報春苣苔葉片外植體不定芽的形成，培養(yǎng)60天，在外植體能夠誘導形成不定芽后，繼續(xù)培 養(yǎng)30天。(2) 叢芽繁殖步驟將不定芽轉入到繁殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，條件為在20 3(TC下，每天 光照30pmolnT23—44小時， 一個月繼代一次，所述的繁殖培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加 鈣440mgL"，蔗糖30g!/1， pH值7.0為基礎，另酉己加有BAP 1.0 mg L"+NAA0.1 mg L";(3) 生根培養(yǎng)步驟將叢芽分切轉入到生根培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)誘導生根，成為試管苗， 條件為20 3(TC，每天光照50pmolm-、—!14小時，生根培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣 440 mgL'1，蔗糖30gL'1, pH值7.0為基礎，另配加有0.2%活性碳。試管苗在該培養(yǎng)基上培 養(yǎng)l個月后進行移栽；
(4) 移栽步驟將長根的試管苗移栽到移植到沙盆的基質中，放置于濕潤、遮蔭的環(huán)境下培養(yǎng)，沙盆中的基質按石灰石蛭石沙石=1 :3:i的比例配置；(5) 野外移栽步驟將經上述沙盆中壯苗后的試管苗種植于石灰?guī)r洞口環(huán)境，與伴生種苔蘚一同種植。
權利要求
1.一種報春苣苔(Primulina tabacum Hance)組織培養(yǎng)繁殖及野外栽培方法，其特征在于以野外采集的報春苣苔植株葉片作為外植體，按以下步驟進行培養(yǎng)繁殖和栽培(1)誘導培養(yǎng)步驟將報春苣苔植株葉片外植體接插到誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導報春苣苔葉片外植體體細胞胚胎發(fā)生或/和不定芽的形成，在20～30℃下，于黑暗培養(yǎng)或每天于1～20μmolm-2 s-1弱光照射12～14小時，培養(yǎng)50～70天，在外植體能夠誘導形成體細胞胚或不定芽后，繼續(xù)培養(yǎng)20-30天，所述的誘導培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣220～440mg L-1，蔗糖20～30 g L-1，pH值6.5～7.5為基礎，另配加有NAA 0.5～1.0mg L-1+TDZ 0.5～1.0mgL-1，或BAP 0.5～1.0mg L-1+TDZ 0.2～1.0mg L-1，或BAP 0.5～1.0mg L-1+NAA 0.5～1.0mg L-1；(2)叢芽繁殖步驟將體細胞胚或不定芽轉入到繁殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，條件為在20～30℃下，每天光照20～50μmol m-2 s-114小時，一個月至一個半月繼代一次，所述的繁殖培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣220～440mg L-1，蔗糖20～30g L-1，pH值6.5～7.5為基礎，另配加有BAP 0.5～1.0mg L-1+NAA 0.1～0.5mg L-1；(3)生根階段將叢芽分切轉入到生根培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)誘導生根，成為試管苗，條件為20～30℃，每天光照20～50μmol m-2 s-114小時，生根培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣220～440mg L-1，蔗糖20g L-1，pH值6.5～7.5為基礎，另配加有IBA 0.2～1.0mg L-1和/或0.2％活性碳，試管苗在該培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個月后進行移栽；(4)移栽階段將長根的試管苗移栽到移植到沙盆的基質中，放置于濕潤、遮蔭的環(huán)境下培養(yǎng)，沙盆中的基質按石灰石∶蛭石∶沙石＝(1～2)∶(2～4)∶(1～2)的比例配置；(5)野外移栽階段將經上述沙盆中壯苗后的試管苗種植于石灰?guī)r洞口環(huán)境，與伴生種苔蘚一同種植。
2. 根據權利要求1所述的報春苣苔(尸〃'》^//冊to6ac"m Hance)組織培養(yǎng)繁殖及野外栽培 方法，其特征在于所述的誘導培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣440 mg L—1，蔗糖20 30 g L—1, pH值6.5 7.0為基礎，另配加有NAA0.5mg1/1 +TDZ 1.0 mg L"，或BAP 0.5 mg L" +TDZ 0.2mgl/1，或BAP1.0mg1/1 +NAA 0.5 mg I/1 。
3. 根據權利要求1所述的報春苣苔CPn7m^'"fl to6acwm Hance)組織培養(yǎng)繁殖及野外栽培 方法，其特征在于所述的繁殖培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣440 mg L'1，蔗糖20 30 g L—1 ， pH值6.5 7.0為基礎，另配加有BAP 1.0 mg L"+NAA0.1 mg L—1 。
4. 根據權利要求1所述的報春苣苔(iV/mw/Z朋to6acwm Hance)組織培養(yǎng)繁殖及野外栽培 方法，其特征在于所述的生根培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基，附加鈣440 mg L—1，蔗糖20 30 g L—1， pH值6.5 7.0為基礎，另配加有IBA 1.0 mg L—1和/或0.2%活性碳。
5. 根據權利要求1所述的報春苣苔(iV^w/i朋to6aow2 Hance)組織培養(yǎng)繁殖及野外栽培 方法，其特征在于在移栽階段，試管苗所移栽的沙盆中的基質按石灰石蛭石沙石=1 : 2 : l的比例配置。
全文摘要
一種報春苣苔(Primulina tabacum Hance)組織培養(yǎng)繁殖及野外栽培方法，本發(fā)明以野外采集的報春苣苔植株葉片作為外植體，通過誘導培養(yǎng)步驟、叢芽繁殖步驟、生根培養(yǎng)步驟、移栽步驟和野外移栽步驟等培養(yǎng)階段，調配和優(yōu)選誘導、繁殖、生根、移栽等各培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基配方，使報春苣苔能夠實現其有效繁殖的目的。結合生態(tài)恢復原理將試管苗在發(fā)現報春苣苔的當地種植，實現報春苣苔在原生地的種植成活和生態(tài)恢復。
文檔編號A01G31/00GK101116423SQ20071003026
公開日2008年2月6日 申請日期2007年9月17日 優(yōu)先權日2007年9月17日
發(fā)明者海 任, 何長信, 張倩媚, 張新華, 李世晉, 楊偉雄, 焦德強, 胡玉姬, 鄧偉雄, 馬國華 申請人:中國科學院華南植物園;清遠市連州愛地旅游發(fā)展有限公司