專利名稱：草坪草轉化子的抗生素篩選臨界濃度的確定方法
技術領域：
本發明涉及轉基因草坪草轉化子的篩選方法，特別是抗生素篩選臨界濃度的確定方法。
背景技術：
草坪草具有保持水土、改造自然、美化環境等功能。草坪的首要需求來自城市綠化、凈化。隨著城市化、工業化進程的加快，經濟發展、人民生活水平的提高，環境建設日益重要。除城市林網及園林景觀，草坪是城市面積最大的綠色生命之源。但是，草坪草由于存在耗水量大，不能耐受過冷或過熱的氣候，綠期較短等不足之處，限制了其更廣泛的應用。基因轉化可打破物種間基因交流的界限，將外源目的基因導入現有的草坪草品種中，獲得具有更理想性狀的新品種，為滿足多種多樣草坪草需求的新品種培育，提供了更廣闊的技術平臺。
選擇、篩選轉化的細胞和植株是基因轉化的關鍵步驟之一。由于在質粒構建時已經人為地嵌合抗生素的標記基因，使其成為篩選植物轉化細胞的顯性遺傳標記，所以實現基因轉化的細胞或植株能夠對某些抗生素表現抗性的標記性狀。轉化的細胞在附加一定濃度抗生素的選擇培養基上生長、發育、分化而獲得的再生植株可判斷為轉化植株。如果抗生素篩選臨界濃度過高可能使轉化植株致死，相反其濃度過低可能出現大量假陽性的轉化植株，因此，抗生素篩選臨界濃度在此就尤為重要。
自從1994年在水稻上證實農桿菌技術在單子葉植物中可以運用以來，草坪草的農桿菌轉化研究也獲得了成功。但農桿菌介導的草坪草遺傳轉化存在轉化率低的問題，而且，就草坪草的抗生素篩選臨界濃度的確定方法未見報道。

發明內容
本發明的目的旨在提供一種簡單方便，準確率高的草坪草轉化子抗生素篩選臨界濃度的確定方法。
本發明包括以下步驟
1)以相應草坪草成熟胚為外植體接種于愈傷組織誘導培養基誘導愈傷組織；所述誘導培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；2)待愈傷組織長到直徑為2~5mm時，將其轉移到繼代培養基上進行繼代培養，所述繼代培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；3)取同一培養時期，直徑相同的愈傷組織A分置于含不同濃度抗生素篩選劑的培養基上，記錄每一處理愈傷組織的重量(W0)；4)培養一段時間后，再次記錄其重量(Wt)；5)計算愈傷組織的重量增長率r＝(Wt-W0)/W0×100％，愈傷組織的相對質量增長率R＝r/r0×100％，r0為不加篩選劑培養的愈傷組織重量增長率；6)以愈傷組織的相對質量增長率R為指標，當R≤1％，則此抗生素濃度達到篩選臨界濃度。
所述成熟胚經70％酒精消毒3min后，再用0.1％升汞消毒15min，然后用無菌水沖洗3~4次，晾干后接種在誘導培養基上。
所述愈傷組織誘導培養基的2，4-D濃度為2-8mg/l為較佳。
所述愈傷組織誘導培養基中還含有濃度為300mg/l的水解酪蛋白和500mg/l的脯氨酸，或者含有濃度為25g/l的甘露糖，以使愈傷組織的狀態良好，有利于長時間的篩選。
同一培養時期指的是經繼代培養后，相同狀態的色澤鮮黃，直徑4-5mm大小胚性愈傷組織。
所述抗生素篩選劑為G418(慶大霉素衍生物，Geneticin)或Kan(卡那霉素，kanamycin)或Hyg(潮霉素，Hygromycin)或Bastar(除草劑phosphinothricin的合成品)。
針對農桿菌介導的遺傳轉化中存在的問題，本發明包含以下內容1.將成熟種子經70％酒精消毒3min后，再用0.1％升汞消毒15min，然后用無菌水沖洗3至4次，涼干后接種在誘導培養基上。誘導培養基是在MS基本培養基基礎上添加了水解酪蛋白、脯氨酸、甘露糖和2，4-D。
2.待愈傷組織長到直徑為2至5mm大小時，及時將其轉移到繼代培養基上進行繼代培養，每隔20天左右更換一次新鮮培養基，當愈傷組織形成大量胚性愈傷組織后，即可用作轉化受體。繼代培養基的成份與誘導培養基相同。愈傷組織的誘導與繼代培養在黑暗條件下進行，全部培養過程的溫度都控制在26℃左右。
3.取愈傷組織直徑大小相同的胚性愈傷組織，置于含不同濃度梯度的抗生素篩選劑的培養基上，記錄每一處理愈傷組織的質量(W0)，同時設置對照(培養基中不加抗生素篩選劑)。
4.培養一段時間后，再次記錄其質量(Wt)，愈傷組織的質量增長率r＝(Wt-W0)/W0×100％，愈傷組織的相對質量增長率R＝r/r0×100％(r0為對照培養的愈傷組織質量增長率)。
5.以愈傷組織的相對質量增長率R為指標，當R≤1％，則表明在含某一劑量抗生素的培養基上培養的愈傷組織質量增長趨于停滯，增長速率趨近于0，而在對照(抗生素含量為0mg/L)培養基上培養的愈傷組織質量仍持續增長，因此可以認為在這一劑量抗生素的培養基上培養的愈傷組織質量增長趨于停滯的原因是由于抗生素濃度達到篩選臨界濃度，限制了愈傷組織的增殖。
發明人研究發現在上述過程中用到的水解酪蛋白的濃度為300mg/l；脯氨酸的濃度為500mg/l；甘露糖的濃度為25g/l為最佳用量。2，4-D的濃度為2至8mg/l對愈傷組織均有良好地誘導效果。以上濃度均有利于愈傷組織作長時間的篩選。
胚性愈傷組織需在良好的狀態下才能被抗生素長時間地篩選，農桿菌轉化浸染的過程會對愈傷組織的細胞造成一定程度的損傷，如果馬上對其進行篩選，會造成愈傷組織(其中包括轉化子)大量死亡。而由本發明所確定的篩選用的臨界濃度的抗生素便可發揮作用。在農桿菌與胚性愈傷組織共培養后，需進行較長時間的愈傷組織恢復培養，采用一步篩選法，即將轉化子直接接種于含有一定濃度抗生素(可以是添加300mg/l的頭孢霉素)的培養基上進行培養。恢復培養是培養基中不添加篩選用的抗生素，僅添加300mg/l的頭孢霉素用以抑制農桿菌的生長，以減少農桿菌對細胞的傷害。而在后繼的篩選培養基上除了需一直添加300mg/l的頭孢霉素外，還要添加由本發明的方法所確定的臨界濃度的抗生素。


圖1示愈傷組織的誘導圖2示愈傷組織的繼代圖3示愈傷組織的分化(此圖為轉化目的基因的愈傷組織通過本方法篩選之后能夠存活，而且仍具有分化能力，得到分化芽；而沒有轉化目的基因的愈傷組織通過本方法篩選之后褐化致死)。
圖4示再生植株的生根(此圖為轉化目的基因的分化芽通過本方法篩選之后仍能生根得到轉化的再生植株，而得到轉化的再生植株是遺傳轉化的最終目的)圖5示G418篩選臨界濃度的確定(mg/L)圖6示Hyg篩選臨界濃度的確定(mg/L)圖7示kan篩選臨界濃度的確定(mg/L)具體實施方式
以下實施例旨在說明本發明而不是對本發明的進一步限定。
實施例1、草地早熟禾轉化子的抗生素篩選臨界濃度的確定方法(1)將草地早熟禾優異、巴林、肯塔基三個品種成熟種子經70％酒精消毒3min后，再用0.1％升汞消毒15min，然后用無菌水沖洗3至4次，涼干后接種在誘導培養基上。誘導培養基是在MS基本培養基基礎上添加了水解酪蛋白300mg/l、脯氨酸500mg/l和2，4-D4mg/l。
(2)待愈傷組織長到直徑為2至5mm大小時，將其轉移到繼代培養基(與誘導培養基相同)上進行繼代培養，每隔20天左右更換一次新鮮培養基，當愈傷組織形成大量胚性愈傷組織后，即可用作轉化受體。繼代培養基的成份與誘導培養基相同。愈傷組織的誘導與繼代培養在黑暗條件下進行，全部培養過程的溫度都控制在26℃左右。
(3)取同一培養時期，愈傷組織直徑大小相同的胚性愈傷組織，置于含不同濃度梯度的抗生素篩選劑的培養基上。其中潮霉素(hygromycin，Hyg)分0，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L六個濃度梯度；G418(慶大霉素衍生物)分0，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L六個濃度梯度；Kan(卡那霉素)分0，200mg/L，400mg/L，600mg/L，800mg/L，1000mg/L六個濃度梯度。每濃度梯度設置五個重復，即倒五個平板，每個平板上(培養皿)接種21顆愈傷組織，記錄每一平板上愈傷組織的質量(W0)。
則潮霉素的6個濃度梯度的W0平均值分別為3.1833g，6.4633g，2.6g，1.2267g，0.62g，0.575g；G418的6個濃度梯度的W0平均值分別為3.1833g，0.6663g，0.5851g，0.5560g，0.3321g，0.315g；Kan的6個濃度梯度的W0平均值分別為3.1833g，2.3533g，3.2533g，1.3367g，1.5167g，0.9733g。
(4)培養相同的一段時間后，再次記錄各平板上愈傷組織質量(Wt)，則潮霉素的6個濃度梯度的Wt平均值分別為8.8067g，9.62g，3.6233g，1.82g，0.8967g，0.89g；G418的6個濃度梯度的Wt平均值分別為8.8067g，0.8584g，0.8586g，0.597g，0.363g，0.3023g；Kan的6個濃度梯度的Wt平均值分別為8.8067g，4.94g，6.12g，2.4433g，2.5233g，1.33g。
愈傷組織的質量增長率r＝(Wt-W0)/W0×100％，愈傷組織的相對質量增長率R＝r/r0×100％(r0為對照即在篩選劑含量為0mg/L的培養基上培養的愈傷組織質量增長率)。具體計算實例以G418濃度為50mg/L計算為例，愈傷組織的質量增長率r＝0.3023-0.315/0.315×100％＝-4.03％，而G418濃度為40mg/L時r為9.30％；對照愈傷組織質量增長率r0＝176.65％；愈傷組織在50 mg/L的相對質量增長率R＝r/r0×100％＝-2.28％，在40mg/L的相對質量增長率R＝5.15％。顯然，在培養同一段時間后，抗生素G418的臨界濃度為50 mg/L。其它抗生素不同濃度的R值見表1。
結果表明這三種篩選劑對草地早熟禾愈傷組織的生長有不同的抑制作用，其中以G418的抑制效果最為明顯，在較低的使用濃度下就可以使愈傷組織的增長率大幅度下降，Hyg的抑制效果次之，而Kan的抑制效果最差，當其濃度達到500mg/L時，草地早熟禾愈傷組織仍有24.69％的增長能力。因此，在草地早熟禾的轉化中可以應用G418 50mg/L這種篩選劑濃度來進行轉化子的篩選。
表1不同抗生素濃度對愈傷組織生長的抑制作用Table 1 Effects of different antibiotics for cailus’growth

實施例2、匍匐翦股穎轉化子的抗生素篩選臨界濃度的確定方法(1)將匍匐翦股穎L-93、回旋、潘娜A-1三個品種成熟種子經70％酒精消毒3min后，再用0.1％升汞消毒15min，然后用無菌水沖洗3至4次，涼干后接種在誘導培養基上。誘導培養基是在MS基本培養基基礎上添加了水解酪蛋白300mg/l、脯氨酸500mg/l和2，4-D 4mg/l。
(2)待愈傷組織長到直徑為2至5mm大小時，將其轉移到繼代培養基(與誘導培養基相同)上進行繼代培養，每隔20天左右更換一次新鮮培養基，當愈傷組織形成大量胚性愈傷組織后，即可用作轉化受體。繼代培養基的成份與誘導培養基相同。愈傷組織的誘導與繼代培養在黑暗條件下進行，全部培養過程的溫度都控制在26℃左右。
(3)取愈傷組織直徑大小相同的胚性愈傷組織，置于含不同濃度梯度的抗生素篩選劑的培養基上。其中潮霉素(hygromycin，Hyg)分0，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L六個濃度梯度；G418(慶大霉素衍生物)分0，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L六個濃度梯度；Kan(卡那霉素)分0，100mg/L，200mg/L，300mg/L，400mg/L，500mg/L六個濃度梯度。每濃度梯度設置五個重復，即倒五個平板，每個平板上(培養皿)接種21顆愈傷組織，記錄每一平板上所有愈傷組織的總質量(W0)。則潮霉素的6個濃度梯度的W0平均值分別為4.9867g，3.9319g，2.9732g，1.9225g，2.8598g，1.507g；G418的6個濃度梯度的W0平均值分別為4.9867g，0.5640g，0.418g，0.4893g，0.3321g，0.315g；Kan的6個濃度梯度的W0平均值分別為4.9867g，2.6207g，1.9171g，2.2590g，2.4764g，2.4895g。
(4)培養相同的一段時間后，再次記錄愈傷組織總質量(Wt)，則潮霉素的6個濃度梯度的W0平均值分別為8.4733g，9.2867g，5.29g，2.82g，4.0233g，2.3g；G418的6個濃度梯度的W0平均值分別為8.4733g，1.7036g，0.0.8184g，0.597g，0.383g，0.3023g；Kan的6個濃度梯度的W0平均值分別為8.4733g，2.3621g，1.9171g，2.2496g，2.4764g，2.4895g。
愈傷組織的重量增長率r＝(Wt-W0)/W0×100％，愈傷組織的相對質量增長率R＝r/r0×100％(r0為對照培養的愈傷組織重量增長率)。
結果表明這3種篩選劑對匍匐翦股穎愈傷組織的生長有不同的抑制作用，其中以G418的抑制效果最為明顯，在較低的使用濃度下就可以使愈傷組織的增長率大幅度下降，Hyg的抑制效果和Kan的抑制效果較差(表2)。因此，在匍匐翦股穎的轉化中可以應用G418這種篩選劑來進行轉化子的篩選，當篩選濃度為40mg/L時，便可達到篩選目的。
表2不同抗生素濃度對愈傷組織生長的抑制作用Table2 Effects of different antibiotics for callus’growth

權利要求
1.草坪草轉化子抗生素臨界濃度篩選方法，該方法包括以下步驟1)以相應草坪草成熟胚為外植體接種于愈傷組織誘導培養基誘導愈傷組織；所述誘導培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；2)待愈傷組織長到直徑為2～5mm時，將其轉移到繼代培養基上進行繼代培養，所述繼代培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；3)取同一培養時期，直徑相同的愈傷組織A分置于含不同濃度抗生素篩選劑的培養基上，記錄每一處理愈傷組織的重量W0；4)培養一段時間后，再次記錄其重量Wt；5)計算愈傷組織的重量增長率r＝(Wt-W0)/W0×100％，愈傷組織的相對質量增長率R＝r/r0×100％，r0為不加篩選劑培養的愈傷組織重量增長率；6)以愈傷組織的相對質量增長率R為指標，當R≤1％，則此抗生素濃度達到篩選臨界濃度。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述成熟胚經70％酒精消毒3min后，再用0.1％升汞消毒15min，然后用無菌水沖洗3～4次，晾干后接種在誘導培養基上。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述愈傷組織誘導培養基的2，4-D濃度為2-8mg/l。
4.根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于所述愈傷組織誘導培養基中還含有濃度為300mg/l的水解酪蛋白和500mg/l的脯氨酸，或者含有濃度為25g/l的甘露糖。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于同一培養時期相同狀態的愈傷組織為色澤鮮黃，直徑4-5mm大小。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述抗生素篩選劑為慶大霉素衍生物或卡那霉素或潮霉素或除草劑phosphinothricin的合成品。
全文摘要
本發明公開了一種草坪草轉化子的抗生素篩選臨界濃度的確定方法，該方法包括以下步驟1)以成熟胚為外植體誘導愈傷組織；2)取愈傷組織置于含不同濃度抗生素篩選劑的培養基上，記錄每一處理愈傷組織的重量(W
文檔編號A01H4/00GK101015273SQ20071003448
公開日2007年8月15日 申請日期2007年2月27日 優先權日2007年2月27日
發明者易自力, 陳智勇, 蔣建雄, 覃靜萍, 蔡能, 唐小艷 申請人:湖南農業大學, 易自力