專利名稱：：一種人類免疫缺陷病毒抗體確認試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種試劑盒，具體地涉及人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體確認試劑盒。
背景技術：
：獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDSAcquiredImmunodeficiencySyndrome)是由人免疫缺損病毒(HIV，HumanImmunodeficiencyVirus)感染所引起的一種嚴重的傳染性疾病。當前對HIV感染還沒有安全有效的治療方法.HIV極高的突變率等原因又使研制HIV有效疫苗極為困難，所以目前防治的主要手段還是以預防為主，普及HIV抗原抗體檢測，以盡早發現HIV感染者，控制其傳播。艾滋病病毒(HIV)是單鏈RNA病毒，屬于逆轉錄病毒(retrovirus)科，慢病毒(lentivirus)亞科。目前發現的導致人類感染的HIV-l型禾服IV-2型兩種亞型中，HIV-1的感染比較常見，世界各國的HIV感染的絕大多數都是由HIV-1引起的。HIV-2的感染僅在西非和其他少數的地區被發現。如前所述，HIV感染的實驗室檢測在HIV感染的診斷、疾病進展的監測、抗病毒療效觀察和耐藥監測中至關重要。目前臨床檢測內容包括HIV抗體、P24抗原、HIV病毒載量、CD/T淋巴細胞計數等。上述臨床檢測內容中，HIV抗體檢測是目前檢測HIV最為主要、有效的檢測方法。血清學檢測例如ELISA方法已經證實對于檢測病人血液中的HIV抗體十分敏感。但是，血清學檢測的不足之處在于，此類試驗中頻繁出現的假陽性結果使得我們必須尋找一種特異性更加好的測定方法。HIV抗體檢測不同于其他病原微生物的檢測，任何錯誤的診斷，包括假陽性或假陰性，都會對被檢者甚至他人產生十分重要的影響。為了獲得針對HIV特異性更好以及更容易推廣的測定方法，研究人員在該領域進行了不斷研究。目前隨著分子生物學技術的迅速發展，HIV抗體檢測方法也隨之不斷更新，從常規的抗體檢測到現在的逆轉錄PCR實驗(RT-PCR)，分支DNA雜交實驗(bDNA)，核酸序列擴增實驗(NASBA)，盡管新的測定方法不斷推出，但這些方法在實際應用中存在靈敏度與特異性的問題，技術上的問題尚不能使這些新型檢測試劑大規模應用于臨床應用。目前，世界衛生組織(WHO)和國家疾病預防控制中心(CDC)建議使用HIVWesternBlot試驗來重復檢測經由ELISA或者其他血清學試驗方法發現為陽性的標本，作為HIV檢測的最終判斷，以盡可能的避免假陽性結果的出現。在實踐中，HIV抗體檢測方法由初篩試驗和確認試驗組成。初篩試驗結果陽性者再做確證試驗以明確診斷。目前國內的HIV抗體檢測使用的試劑，要求能同時檢測HIV1型和HIV2型。初篩檢測的方法有間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、明膠顆粒凝集試驗(PA)和金標法(SPOT)，其中最常用的方法為酶聯免疫吸附試驗。HIV抗體篩查試劑敏感性較高，存在潛在的非特異性反應，有假陽性的可能，因此確認試驗在HIV檢測的最終判別中尤為重要。確認試驗的方法包括免疫印跡試驗、條帶免疫試驗、放射免疫沉淀試驗及免疫熒光試驗，目前以免疫印跡試驗最為常用。總之，由酶聯免疫吸附檢測(ELISA)聯合免疫印跡檢測(WB)組合而成的抗體檢測至今還是公認的HIV檢測的"金標準"方法。也就是說，目前對人類免疫缺陷病毒(以下簡稱為HIV)抗體進行篩查的整個流程主要是應用HIV抗體酶聯免疫試劑盒，然后對檢測為陽性的樣品需要進行HIV抗體確認檢測，一般采用HIV抗體確認試劑。因此HIV抗體確認試劑在HIV的診斷中尤為重要。由于HIV抗體確認試劑的技術含量較HIV初篩試劑的含量高，目前，HIV抗體確認試劑在我國完成注冊僅有兩家，其中包括美國MP公司在新加坡生產的HIVBlot2.2試劑和杭州澳亞公司的人類免疫缺陷病毒(HIV)1+2抗體確認試劑盒。國內每年HIV確認試劑用量大約在十萬人份，由于進口試劑的特異性較國內生產的試劑相對穩定，進口試劑在我國市場占有率達95%以上。但是進口試劑的缺點在于成本較高，檢測過程時間較長。而國內生產試劑的主要缺點在于穩定性、特異性相對于進口試劑有所欠缺。在現有技術中，文獻報道疊氮鈉和硫柳汞可作為防腐劑使用。但是，通常的觀點是，疊氮鈉和硫柳汞用于純的HIV抗體質控血清時，對血清的穩定性沒有影響。綜上所述，本領域缺乏一種特異性好、靈敏度高，同時具備成本低、能夠迅速檢測HIV等優點的HIV抗體確認試劑盒。因此，本領域迫切需要開發一種特異性好、靈敏度高，同時具備成本低、能夠迅速檢測HIV等優點的HIV抗體確認試劑盒。
發明內容本發明的目的在于獲得一種特異性好、靈敏度高，同時具備成本低、能夠迅速檢測HIV等優點的HIV抗體確認試劑盒。本發明的另一目的在于獲得一種對HIV進行確認的方法，該方法特異性好、靈敏度高，同時具備成本低、能夠迅速檢測HIV等優點。本發明的另一目的在于獲得一種對HIV進行檢測的方法，該方法特異性好、靈敏度高，同時具備成本低、能夠迅速檢測HIV等優點。本發明的另一目的在于獲得一種防腐劑在對照試劑中的應用。本發明的一種HIV抗體確認試劑盒，所述試劑盒包括HIV-l型和/或HIV-2型特異性抗原；對照試劑，所述對照試劑中含有防腐劑，所述防腐劑為濃度在O.10.2重量％之間的堿金屬疊氮鹽和濃度在0.0020.06重量％之間的硫柳汞；以及輔助試劑。優選地，所述堿金屬疊氮鹽選自疊氮鈉、疊氮鉀或其組合。在本發明的一個具體實施方式中，所述防腐劑中，所述堿金屬疊氮鹽與硫柳汞的重量比為20200:1;優選地，所述堿金屬疊氮鹽的濃度為O.1±0.01重量％之間，所述硫柳汞的濃度在O.05±0.005重量％之間。在本發明的一個具體實施方式中，所述HIV-l型特異性抗原選自gpl60抗原、gpl20抗原、p66抗原、p51抗原、gp41抗原、p24抗原、pl7抗原中的一個或多個；所述HIV-2型特異性抗原選自gp36抗原；禾口/或所述對照試劑選自陽性對照試劑、弱陽性對照試劑、陰性對照試劑中的一種或多種。在本發明的一個具體實施方式中，所述HIV-l型和/或HIV-2型特異性抗原固定在免疫印跡膜上。優選地，所述免疫印跡膜為硝酸纖維素膜。在本發明的一個具體實施方式中，所述試劑還含有酶聯物。優選地，所述酶聯物選自抗人IgG酶聯物。在本發明的一個具體實施方式中，所述輔助試劑選自濃縮洗滌緩沖液、樣本稀釋液、以及堿性磷酸酶底物溶液。本發明的第二方面提供一種對HIV進行確認的方法，其包括如下步驟提供HIV-l型和/或HIV-2型特異性抗原；提供受測者的血清或血漿樣本；所述特異性抗原與所述樣本反應后進行顯色，得到的顯色結果與對照試劑進行對照，從而對HIV進行確認；其中所述對照試劑中含有防腐劑，所述防腐劑為濃度在O.10.2重量％之間的堿金屬疊氮鹽和濃度在0.0020.06重量％之間的硫柳汞。在本發明的一個具體實施方式中，所述顯色步驟中，采用酶聯物進行顯色。優選地，所述酶聯物為抗人IgG酶聯物。本發明的第三方面提供一種對HIV進行檢測的方法，其包括如下步驟提供初篩為陽性的初篩血清或血漿樣本；所述初篩血清或血漿樣本采用本發明所述的方法對HIV進行確認。優選地，所述初篩法采用酶聯免疫吸附檢測法測定。本發明的第三方面提供一種防腐劑在對照試劑中的應用，所述防腐劑為濃度在O.10.2重量％之間的堿金屬疊氮鹽和濃度在0.0020.06重量％之間的硫柳汞。優選地，所述對照試劑選自陽性對照試劑、弱陽性對照試劑、陰性對照試劑中的一種或多種。具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，通過改進制備工藝，將特定組合的疊氮鈉和硫柳汞用于對照試劑，從而獲得了一種特異性好、靈敏度高，同時具備成本低、能夠迅速檢測HIV等優點的HIV抗體確認試劑盒。在此基礎上完成了本發明。本發明的抗體確認方法的發明構思如下檢測人血清或血漿中針對HIV-1/2抗原(包括HIV-1gpl60、gpl20、p66、p51、gp41、p24、p17以及HIV-2gp36等)產生的特異性IgG抗體，依據所出現的條帶反應，確認初篩為HIV抗體陽性的人血清或者血漿中存在的HIV-1或HIV-2抗體。在一個具體實施方式中，本試劑盒運用免疫印跡實驗。以下對本發明的各個部分進行詳述HIV抗體確認試劑盒本發明的mv抗體確認試劑盒，包括HIV-l型禾口/或HIV-2型特異性抗原；對照試劑，所述對照試劑中含有防腐劑，所述防腐劑為濃度在O.10.2重量％之間的堿金屬疊氮鹽和濃度在0.0020.06重量％之間的硫柳汞；以及輔助試劑。所述HIV-l型和/或HIV-2型特異性抗原中，所述HIV-1型特異性抗原包括gpl60抗原、gpl20抗原、p66抗原、p51抗原、gp41抗原、p31抗原、p24抗原、p17抗原中的一個或多個。優選地，所述HIV-1型特異性抗原為HIV-l病毒裂解蛋白(HTLV-IIIB株)的7個特異性抗原，包括gpl60抗原、gpl20抗原、p66抗原、p51抗原、gp41抗原、p24抗原和pl7抗原。所述HIV-l型和/或HIV-2型特異性抗原中，所述HIV-2型特異性抗原包括HIV-2重組蛋白，例如為gp36抗原。所述HIV-l型禾卩/或HIV-2型特異性抗原還可以采用本領域其他的各種種類的HIV-l型和/或HIV-2型特異性抗原，只要不對本發明的發明目的產生限制即可。所述HIV-l型和/或HIV-2型特異性抗原可以采用各種本領域的方式固定在載體上，只要不對本發明的發明目的產生限制即可。優選地，所述HIV-1型和/或HIV-2型特異性抗原固定在免疫印跡膜上。更優選地，所述免疫印跡膜為硝酸纖維素膜。具體地例子包括，HIV-1病毒裂解蛋白通過十二垸基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)分離不同分子量的多肽，分離的HIV-1多肽通過電轉移從凝膠轉移到硝酸纖維素膜上；同時另外兩個多肽分子直接點在膜上，它們分別是1)一條是金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)的質控帶，2)—條是通過重組表達的HIV-2特異性包膜抗原。含有上述多肽的硝酸纖維素膜切成可用于單樣本檢測的膜條。本發明的對照試劑含有防腐劑，所述防腐劑為濃度在O.10.2重量％之間的堿金屬疊氮鹽和濃度在O.0020.06重量％之間的硫柳汞。所述對照試劑中，對照試劑的種類選自陽性對照試劑、弱陽性對照試劑、陰性對照試劑中的一種或多種。所述陽性對照試劑含高滴度HIV-1/2抗體以及HBsAg陰性的人血清。所述"高滴度"的范圍只要使得所述試劑可以作為陽性對照試劑進行定性比對即可。通常，陽性對照試劑中HIV感染人血的血清轉換盤為6個月左右。所述弱陽性對照試劑含低滴度HIV-l/2抗體以及HBsAg陰性的人血清。所述"低滴度"的范圍只要使得所述試劑可以作為弱陽性對照試劑進行定量比對即可。通常，弱陽性對照試劑中艾滋病感染人血清轉換盤為14天左右。所述陰性對照試劑為HIV-l/2抗體陰性以及HBsAg陰性的人血清。所述防腐劑中，優選地，所述堿金屬疊氮鹽選自疊氮鈉、疊氮鉀或其組合。所述防腐劑中，優選地，所述堿金屬疊氮鹽與硫柳汞的重量比為20200:1。更優選地，所述堿金屬疊氮鹽的濃度為O.1±0.01重量％之間，所述硫柳汞的濃度在O.05±0.005重量％之間。發明人發現，在使用特定組合的堿金屬疊氮鹽和硫柳汞作為防腐劑后，可以大大提高對照試劑的穩定性，從而提高試劑盒的質量水平。優選地，所述試劑盒中還含有酶聯物。更優選地，所述酶聯物選自抗人IgG酶聯物。所述輔助試劑包括各種試劑盒中需要的試劑，例如，包括濃縮洗滌緩沖液、樣本稀釋液、以及堿性磷酸酶底物溶液。對HIV進行確認的方法
技術領域：
：本發明的對HIV進行確認的方法，包括如下步驟提供HIV-l型和/或HIV-2型特異性抗原；提供受測者的血清或血漿樣本；所述特異性抗原與所述樣本反應后進行顯色，得到的顯色結果與對照試劑進行對照，從而對HIV進行確認；其中所述對照試劑中含有防腐劑，所述防腐劑為濃度在O.10.2重量％之間的堿金屬疊氮鹽和濃度在O.0020.06重量％之間的硫柳汞。在本發明的一個具體實施方式中，所述顯色步驟中，采用酶聯物進行顯色。優選地，所述酶聯物為抗人IgG酶聯物。在本發明的一個具體實施方式中，通過含有HIV-l/2蛋白的膜條與血清/血漿樣本反應，洗滌除去未結合的抗體，與HIV-l/2蛋白特異性結合的人免疫球蛋白與結合有堿性磷酸酶的單抗人免疫球蛋白反應，堿性磷酸酶催化底物BCIP/NBT發生顯色反應，把出現條帶的位置與用HIV-l/2陽性對照血清孵育的參照卡上的條帶位置進行比較，判定是否存在HIV特異性抗體條帶，帶的強度與HIV-1/2弱陽性對照進行比較。對HIV進行檢測的方法
技術領域：
：本發明的對HIV進行檢測的方法，包括如下步驟提供初篩為陽性的初篩血清或血漿樣本；所述初篩血清或血漿樣本采用本發明所述的方法對HIV進行確認。優選地，所述初篩法采用酶聯免疫吸附檢測法測定。具體地，采用間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。所述初篩法還可以采用本領域其他的初篩方法進行，只要不對本發明的發明目的產生限制即可。例如明膠顆粒凝集試驗(PA)、金標法(SPOT)等。應用本發明還提供一種防腐劑在對照試劑中的應用，所述防腐劑為濃度在o.l0.2重量y。之間的堿金屬疊氮鹽和濃度在0.0020.06重量％之間的硫柳汞。優選地，所述對照試劑選自陽性對照試劑、弱陽性對照試劑、陰性對照試劑中的一種或多種。本發明所提供的各種試劑可以通過市售原料和傳統化學轉化方式合成。本發明的優點在于(1)通過526份考核樣品和1045份臨床樣品，得出本試劑敏感性為100%，特異性98.58%。考評結果一致認為本試劑實驗方法比較簡單，易于操作，特異性較好，與參比試劑HIVBlot2.2相比，二者檢測HIV-l感染者樣品沒有明顯差異，但本試劑特異性略高。本發明的其他方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另有定義或說明，本文中所使用的所有專業與科學用語與本領域技術熟練人員所熟悉的意義相同。此外任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。實施例19、對比例18試劑盒成分實施例1的試劑盒配方成分如下(l)HIV-1/2膜條①24條/板X2在硝酸纖維素膜上含有HIV-1病毒裂解蛋白(HTLV-mB株)的7個特異性抗原gpl60，gpl20，p66，p51,gp41，p24，p17和一條HIV-2重組蛋白(gp36)。(2)HIV-1/2陽性對照鮮LX2:含高滴度(艾滋病感染人血清轉換盤為6個月)HIV-1/2抗體以及HBsAg陰性的人血清，含0.1%疊氮鈉和0.005。/。硫柳汞作為防腐劑。(3)HIV-l/2弱陽性對照100叱X2:含低滴度(艾滋病感染人血清轉換盤為14天)HIV-1/2抗體以及HBsAg陰性的人血清，含0.1%疊氮鈉和0.005%硫柳汞作為防腐劑。(4)人IgG陰性對照1001^X2:HIV-1/2抗體陰性以及HBsAg陰性的人血清，含0.1°/。疊氮鈉和0.005%硫柳汞作為防腐劑。(5)濃縮洗滌緩沖液(10X)25mLX2:稀釋成250mL溶液。NaCl:1.400Mol/L，Na2HP0412H20:0.080Mol/L，KH2P04:0.020Mol/L，KC1:0.026Mol/L。含0.5%Tween-20和0.005%硫柳滎作為防腐劑。(6)樣本稀釋液30mLX2可直接使用。NaCl:0.l權ol/L,Na2HP0412H20:0.008Mol/L,KH2P04:0.002Mol/L，KC1:0.003Mol/L。含有0.5%Gentamicin和ProClin(體積比:1:250)作為防腐劑。(7)抗人IgG酶聯物30mLX2:可直接使用的與堿性磷酸酶結合的羊抗人IgG(Fc片斷特異性的)。含0.1%Tween-20，含無汞無疊氮化物的防腐劑。(8)堿性磷酸酶底物溶液30mLX2:直接使用的堿性磷酸酸酶底物溶液BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/氮藍四唑)，組成濃度為BCIP0.692mMol/L，NBT:0.734mMol/L，含0.1%Tween-20。所述試劑盒中還含有孵育板(6塊)、記錄表(2張)、說明書(l本)、參照卡(1張)。注①HIV-1/2膜條的制備HIV-1病毒裂解蛋白通過十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)分離不同分子量的多肽，分離的HIV-1多肽通過電轉移從凝膠轉移到硝酸纖維素膜上；同時另外兩個多肽分子直接點在膜上，它們分別是1)一條是金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)的質控帶，2)—條是通過重組表達的HIV-2特異性包膜抗原。含有上述多肽的硝酸纖維素膜切成可用于單樣本檢測的膜條。得到的HIV-1/2膜條為含有HIV-1病毒裂解蛋白(HTLV-IIIB株)的7個特異性抗原gp160，gpl20，p66，p51，gp41，p24，pl7和一條HIV-2重組蛋白的免疫印跡膜。操作過程在檢測過程中，含有HIV-1/2膜條與血清樣本反應，洗滌除去未結合的血清中抗體，如果血清樣本中含有與膜上相應的HIV多肽反應的特異性抗體，則通過隨后加入的標記有堿性磷酸酶的羊抗人免疫球蛋白(羊抗人IgG)與底物BCIP/NBT的作用條帶被顯現出來。出現條帶的位置與用HIV-1/2陽性對照血清孵育的參照卡上的條帶位置進行比較。帶的顯色強度與HIV-1/2弱陽性對照進行比較。使用本試劑盒時，應嚴格按照國家有關傳染性物質的操作要求，至少在生物安全II級實驗室進行操作。操作過程如下(記載于試劑盒中說明書)1.稀釋洗滌緩沖液(IX)的配制按l:IO稀釋，即將lmL的濃縮洗滌緩沖液(10X)加入到9mL去離子水中，徹底混勻即可。每個模條配制10mL稀釋洗滌緩沖液2.注意事項1)按前面的配方準備好所有試劑。在使用前讓其達到室溫。所有的步驟都在室溫(20—25。C)下完成。2)僅僅使用搖擺搖床用作攪拌，不要用水平搖床。所有的孵育都在搖擺速度以30—40轉/分鐘的搖床上完成。檢查搖床的速度和振幅，加lmL的稀釋洗滌緩沖液到托盤每個槽孔里并打開搖床。調整速度避免溶液濺到旁邊的槽孔中。3)使用連接在真空系統的一次性吸液頭把每個槽孔中的液體吸盡。帶捕集器的吸液器就足夠了。不要傾倒托盤以排空槽孔，這會引起液體越過槽邊而與臨近的樣本混合。3.實驗步驟1)向槽孔中加入lmL稀釋洗滌緩沖液。2)用剪刀從試劑膜條靠近數字的一邊剪去連接的部分，以便分開單個膜條。3)用鑷子把膜條依次放入實驗槽孔內，有數字的一面朝上。4)在搖床上孵育1分鐘直到所有的膜條均勻地浸濕。用吸液器分別吸去液體。5)加lmL樣本稀釋液到實驗槽孔中。6)再加IO叱檢測樣本、或HIV-1/2陽性對照、弱陽性對照或陰性對照到適當的有膜條的槽孔中，在各孔中刷洗槍頭以便混勻。7)在搖床上孵育2小時。用吸液器分別吸去液體。8)向各孔中加入lmL稀釋洗滌緩沖液洗滌所有膜條，在搖床上搖3分鐘然后吸去液體。再重復本步驟2次。9)向各孔中加lmL酶聯物，在搖床上孵育15分鐘。吸去液體。10)向各孔中加lmL稀釋洗滌緩沖液漂洗所有膜條。搖3分鐘然后吸去液體。再重復本步驟1次。11)向各孔中加lmL去離子水漂洗所有膜條。搖3分鐘然后吸去液體。再重復本步驟1次。12)向各孔中加lmL底物液，在搖床上孵育6-8分鐘。吸去所有槽孔的液體。13)在短暫的時間內更換2次去離子水漂洗所有槽孔內膜條以終止顯色。14)使用鑷子把膜條面朝上轉移到一張紙巾上晾干。不要把它們放在紙巾間吸干或拍千。在印跡沒有完全干燥之前不要解釋結果。15)把膜條保存在暗處，干燥的膜條對檢測結果提供了永久的記錄，在任何時候它們都可用于解釋。4.質量控制(1)每個實驗室都應該建立符合自己實驗室的質量保證。(2)在每個試劑盒中提供了陽性對照、弱陽性對照和陰性對照。這些血清提供了所期望的陽性和陰性條帶類型。弱陽性對照用作確定什么時候終止顯色反應以及作為衡量條帶顯色強度的指導。(3)每次實驗都設置陽性、弱陽性和陰性對照。每個膜條都有內在的質控條帶以確保病人的樣本和所有的試劑沒有漏加。實驗按順序完成后質控帶清晰可見，才表明實驗結果有效。實施例29、對比例18的試劑盒成分、檢測方法與實施例1相似，不同在于疊氮鈉與硫柳汞的濃度不同，其濃度與穩定性結果見如下表1。表1配方穩定性實驗總結<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由如上表l所示，采用保護劑配方組合能夠顯著提高對于蛋白抗體的保護能力。采用兩種復配成份的穩定液，可以顯著延長蛋白抗體的保存時間。不同配方和不同組合的保護液顯示出不同的結果。經過4度同等保存條件并經長期觀察和使用ELISA檢測，證明疊氮鈉0.1%+硫柳汞0.005%效果最好，最經濟。本配方使用于臨床用診斷試劑，經過1045例臨床試驗，證明效果良好，未見任何產品檢驗效能的減弱，表明穩定液對蛋白抗體的保護作用非常明顯和實用。性能測定(一)穩定性測定穩定性測定結果見如上表l(二)臨床試驗結果臨床研究用所有產品的名稱、規格、來源、批號、效期及保存條件，對比試驗產品的注冊情況(1)考核試劑實施例1的試劑盒(2)其它試劑所有試劑均經我國SFDA批準。HIV抗體檢測生物梅里埃公司人類免疫缺陷病毒(HIV)1+2抗體診斷試齊ij(酷聯免疫法)，批號A44CC、A45EC、A45HA禾卩A46AA;HIV抗體確認試劑(參比試劑)Genelabs公司HIVBlot2.2，批號AE4050禾口AE2029;生物梅里埃NuclisensEasyQHIV-1試劑盒，批號05071101HIV病毒載量測定Roche公司TheAmplicorHIV-1MonitorTest,v1.5，批號F08869禾口EXE074;試驗目的本試驗主要用于評價考核試劑的實際應用情況，分析考核試劑的敏感性、特異性以及考核試劑檢測不同基因型HIV-1感染者樣品的能力。試驗總體設計及方案整個臨床考核工作由中國藥品生物制品檢定所組織完成。中國藥品生物制品檢定所、上海市預防醫學研究院和湖南省疾病預防控制中心負責對HIV感染者和疑似感染者樣品以及HIV抗體陰性樣品進行考核；解放軍艾滋病檢測確認實驗室負責對HIV感染者樣品進行考核；所有考核樣品均經生物梅里埃HIV抗體試劑進行檢測，對檢測為HIV抗體陽性的樣品進一步經HIVBlot2.2試劑(參比試劑)進行確認檢測。然后利用考核試劑檢測所有樣品。對中國藥品生物制品檢定所保存的樣品，同時經生物梅里埃NuclisensHIV-1easyQ試劑和RocheCobasAmplicorHIV-1MonitorV1.5試劑等進行病毒載量檢測，對HIV-1感染者樣品進行envV3區基因型分析，以分析考核試劑檢測不同基因型HIV-1樣品的能力。所有樣品經考核試劑檢測后，分析考核試劑和HIV抗體試劑之間是否存在差異，若存在差異，分析差異產生的原因并利用其他試劑進行進一步檢測分析。樣本選擇依據、入選標準、排除標準和剔除標準本研究旨在評價考核試劑在我國的實際應用情況，分析考核試劑的敏感性、特異性以及檢測不同基因型HIV-1樣品的能力。因此，考核樣品所用的HIV-1感染者樣品，應考慮我國HIV-1流行的地區因素、基因型差異、以及樣品所處的HIV-1感染階段等。對分析試劑特異性所用的HIV抗體陰性樣品，同樣應該考慮樣品所處的地域因素。所有樣品經考核試劑檢測后，檢測結果均應該嚴格根據試劑的說明書進行判斷，對檢測結果判斷為"無效"的樣品進行重新檢測，若仍無效，則統計分析時應該剔除該樣品。所有樣品同樣經考核試劑檢測，分析考核試劑和參比試劑的一致性，對檢測結果不一致的樣品，應進行雙份復試，以復試結果為最終的結果；同時，需進一步確定或者鑒別那些結果不一致樣品所處的HIV-1感染狀態。對沒有進行跟蹤隨訪的樣品、以及HIV-1NAT檢測無效的樣品，應不計算入有效的統計數據中。儲存條件儲存于2~8°〇；操作情況嚴格按照操作方法進行操作并判定結果。樣本采集、保存、運輸方法所有樣品均為橘櫞酸鈉抗凝的血漿，分裝為0.5mL每管，凍存于一8CTC冰箱。質量控制方法每一次試驗，均設三個對照(陰性對照、弱陽性對照和強陽性對照)，而且每個膜條均設有質控帶，只有每條膜條上出現質控帶，且陰性對照、弱陽性對照和強陽性對照均成立，試驗才有效。檢測單位共組織4家單位(中國藥品生物制品檢定所、解放軍艾滋病檢測確認實驗室、上海市預防醫學研究院、湖南省疾病預防控制中心)共1045例樣本對實施例1的人類免疫缺陷病毒HIV(1+2)抗體確認試劑盒(免疫印跡法)進行了評價。共對1045份臨床樣品進行了考核，其中HIV抗體確認陽性樣品共683份；HIV抗體不確定樣品共25份；HIV抗體陰性樣品337份，樣品分別來自北京、新疆、河北、遼寧、山西、河南、廣東、廣西、湖南和湖北等地區。具體樣品來源如下表2所示表2:具體樣品來源HIV抗體陽性不確定陰性合計檢定所3086212526解放軍HIV實驗室206206上海預防醫學研究院891064163湖南CDC80961150合計683253371045結果判定方法(1)試驗有效性:在實驗完成后，每個膜條的質控帶清晰可見，表明實驗結果有效。(2)結果判定HIV-1結果判斷如下表3所示表3:試驗結果判讀表HIV-1結果判斷_條帶情況_陰性結果無病毒特異性條帶存在既不符合陽性條帶模式標準乂不符合陰性條帶模式標準的任何條帶模不確認結果式任何兩個或更多的以下條帶(p24,gp41,gp120/gp160)存在，陽忡結'fi其它的HIV-1蛋白條帶可能存在也可能不存在HIV-2型判定如下表4所示表4:試驗結果判讀表￡^_條帶情況_HIV-2條帶不存在或比弱陽性對照上的HIV-2條帶強陰性度淡m^HIV-2條帶強度與弱陽性對照上的HIV-2條帶強度相陽件"當或深結果討論I.考核試劑與抗體試劑檢測結果的比較1045份臨床樣品，經HIV抗體檢測試劑和HIV抗體確認試劑檢測(參比試劑)，結果683份樣品為HIV抗體確認陽性，25份為HIV抗體不確定，337份為HIV抗體陰性樣品。經考核試劑檢測，結果683份樣品為HIV抗體確認陽性，13份樣品為HIV抗體不確定，349份樣品為HIV抗體陰性。考核試劑和參比試劑的檢測結果比較見表5，綜合數據，考核試劑和HIVBlot2.2試劑的總體符合率為(681+8+334)+1045=97.89%。表5:考核試劑檢測結果與HIV抗體檢測結果的符合率樣品數量考核試劑參比試劑陰性不確定陽性陰線不確定陽性HIV抗體陽性683HIV抗體不確定HIV抗體陰性3372502158334368120合計104534913683綜合上述數據，有效的考核樣品數量為1041份，其中HIV-1感染者樣品689份，HIV陰性樣品352份(見表2、3)。由此，考核試劑敏感性為100%，特異性98.58%;參比試劑敏感性100%，特異性94.89%。II.HIV基因型分析中國藥品生物制品檢定所保存的樣品中，HIV抗體確證陽性、HIV抗體不確定樣品共186份，對這186份樣品進行eiwV3區基因分型，結果見表6。表6:不同地區血清/S的基因型分析<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>基因分型結果顯示，總共有151份樣品成功完成基因分型，其中，B亞型占32.45%、BC亞型占58.28X，AE亞型占9.27X。III.臨床討論和結論從上述1045例血清樣本的實際檢測中，可以認為實施例l的試劑盒具有與市售同類產品相同的檢出率和準確性，該試劑實驗方法比較簡單，易于操作；通過對以上樣品的檢測，說明該試劑特異性較好；同時，對于我國主要流行的HIV-1病毒株的感染均能比較準確的完成確認檢測；與參比試劑相比，二者檢測HIV-1感染者樣品沒有明顯的差異，但考核試劑特異性略高。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求1.一種HIV抗體確認試劑盒，所述試劑盒包括HIV-1型和/或HIV-2型特異性抗原；對照試劑，所述對照試劑中含有防腐劑，所述防腐劑含有濃度在0.1～0.2重量％之間的堿金屬疊氮鹽和濃度在0.002～0.06重量％之間的硫柳汞；以及輔助試劑。2.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述防腐劑中，所述堿金屬疊氮鹽與硫柳汞的重量比為20200:1;優選地，所述堿金屬疊氮鹽的濃度為O.1±0.01重量％之間，所述硫柳汞的濃度在O.05士0.005重量％之間。3.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述HIV-l型特異性抗原選自gpl60抗原、gpl20抗原、p66抗原、p51抗原、gp41抗原、p24抗原、pl7抗原中的一個或多個；所述HIV-2型特異性抗原選自gp36抗原；和/或所述對照試劑選自陽性對照試劑、弱陽性對照試劑、陰性對照試劑中的一種或多種。4.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述HIV-l型和/或HIV-2型特異性抗原固定在免疫印跡膜上。5.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑還含有酶聯物；優選地，所述酶聯物選自抗人IgG酶聯物。6.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述輔助試劑選自濃縮洗滌緩沖液、樣本稀釋液、堿性磷酸酶底物溶液或其組合。7.—種對HIV進行確認的方法，其特征在于，包括如下步驟提供HIV-1型和/或HIV-2型特異性抗原；提供受測者的血清或血漿樣本；所述特異性抗原與所述樣本反應后進行顯色，得到的顯色結果與對照試劑進行對照，從而對HIV進行確認；其中所述對照試劑中含有防腐劑，所述防腐劑含有濃度在O.10.2重量％之間的堿金屬疊氮鹽和濃度在0.0020.06重量％之間的硫柳汞。8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述顯色步驟中，采用酶聯物進行顯色。9.一種對HIV進行檢測的方法，其特征在于，包括如下步驟提供初篩為陽性的初篩血清或血漿樣本；所述初篩血清或血漿樣本采用如權利要求78任一項所述的方法對HIV進行確認。10.—種防腐劑在對照試劑中的應用，其特征在于，所述防腐劑含有濃度在0.10.2重量％之間的堿金屬疊氮鹽和濃度在0.0020.06重量％之間的硫柳汞。全文摘要本發明提供一種HIV抗體確認試劑盒，所述試劑盒包括HIV-1型和/或HIV-2型特異性抗原；對照試劑，所述對照試劑中含有防腐劑，所述防腐劑為濃度在0.1～0.2重量％之間的堿金屬疊氮鹽和濃度在0.002～0.06重量％之間的硫柳汞；以及輔助試劑。所述試劑盒特異性好、靈敏度高，同時具備成本低、能夠迅速檢測HIV等優點。文檔編號A01N59/00GK101581720SQ20081003736公開日2009年11月18日申請日期2008年5月14日優先權日2008年5月14日發明者力王申請人:上海英旻泰生物技術有限公司