專利名稱：：作物萌動種子抗熱性快速鑒定方法
技術領域：
：本發明屬于植物學領域，更具體地，本發明涉及一種篩選青菜抗熱植株的方法。
背景技術：
：隨著全球氣候的變暖，人們對溫度的關注度越來越高。如何提高植物的抗熱性，培育抗熱品種以應對高溫給農業生產和生態環境的不利影響，是植物科學家需要思考和回答的緊迫問題。一方面，應當通過雜交育種的方法改良植物的抗熱性；另一方面，需要從抗熱的植物資源中發掘抗熱的基因。目前我國蔬菜產業化育種的歷史比較短，傳統育種技術落后，周期長，效率低，特別是可滿足夏季生產需要的自主蔬菜品種更少，怎樣利用分子標記的技術加快育種的步伐是一個迫在眉睫的任務。一直以來，抗熱性鑒定和篩選是作物抗熱育種上的主要難題。在蔬菜抗熱性鑒定指標的研究上，本領域人員在以往已經做了大量的工作，然而這些工作確定的鑒定指標主要以生理生化指標為主，鑒定方法比較繁瑣，且不夠直觀，難以實際應用。青菜是我國南方許多地區種植的主要綠葉蔬菜。隨著生活水平的不斷提高和營養觀念的逐漸科學化，人們對青菜的需求量越來越大，其中夏秋季的青菜在綠葉蔬菜中占有相當大的比例。然而，我國現有的青菜品種大多適于秋冬季栽培，夏季高溫栽培的青菜品種很少見，對青菜等綠葉蔬菜的生產造成了極大的限制。因此，盡快選育適合夏季高溫栽培的品種是一項非常迫切的任務。
發明內容本發明的目的在于提供一種新的青菜植株抗熱性鑒定方法一一萌動種子抗熱性快速鑒定方法。在本發明的第一方面，提供一種篩選青菜抗熱植株的方法，所述方法包括(1)在待測青菜的種子萌發(萌動)階段，將種子在46士0.5。C熱處理60土20分鐘，然后轉移到適溫下培養1-5天；同時設置對照組，自青菜的種子萌發階段起將種子在適溫下培養1-5天；(2)計算抗熱指數，如抗熱指數不低于0.4(如0.4-1)，則該植株是抗熱植株；其中，所述的抗熱指數=熱處理植株的胚根長度/對照組植株的胚根長度。在另一優選例中，步驟(1)中，種子在46土0.4'C熱處理60士15分鐘；更優選的，種子在46土0.2。C熱處理60土10(更優選60±5)分鐘。在另一優選例中，步驟(1)中，所述的適溫是28土2。C。在另一優選例中，步驟(1)中，轉移到適溫下培養2-3天。在另一優選例中，步驟(2)中，如抗熱指數不低于0.45，則該植株是抗熱植株。在另一優選例中，步驟(1)中，所述的熱處理是通過水浴加熱實現的。在另一優選例中，在熱處理時，將種子置于敞口的容器中，將裝有種子的容器置于水浴中進行熱處理，并使容器的敞口處于水平面上(即容器中沒有水進入)。在另一優選例中，步驟(1)中，熱處理后，將種子轉移到濕潤的蓬松性介質(如脫脂棉，濾紙等)上，從而胚根穿過介質豎直往下生長，便于測量胚根的長度。在另一優選例中，所述方法還包括(3)對步驟(2)獲得的植株培養至苗期的3葉期，在44-5(TC下進行熱處理，觀察植株的生長情況，進一步確定青菜抗熱植株。在另一優選例中，在步驟(l)之前，還包括步驟將青菜的種子迸行浸種，然后置于濕潤的介質上催芽，使青菜的種子進入萌發階段。在本發明的第二方面，提供一種培養青菜抗熱植株的方法，所述的方法包括(1)在青菜的種子萌發階段，將種子在46土0.5。C熱處理60±20分鐘，然后轉移到適溫下培養1-5天；同時設置對照組，自青菜的種子萌發階段起將種子在適溫下培養1-5天；(2)計算抗熱指數，如抗熱指數不低于0.4(如0.4-1)，則該植株是抗熱植株；其中，所述的抗熱指數二熱處理植株的胚根長度/對照組植株的胚根長度；(3)將(2)中獲得的青菜抗熱植株移栽到大田中繼續培養。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1顯示了最抗熱品種華王和最敏感品種小八葉在苗期5(TC高溫下的不同反應；其中，左圖華王；右圖小八葉。圖2顯示了在4(TC，42'C以及43X:熱處理條件下，華王和小八葉熱抗指數的差異。圖3顯示了在44°C,45°C，46°C，47°C以及48°C高熱處理條件下華王和小八葉熱抗指數的差異。具體實施例方式田間選育植株品種周期長，費工費時，而且環境因素比較復雜，如果能夠在早期幼苗階段就進行初步的鑒定，必將大大減少工作量，縮短選育的時間。本發明人經過深入的研究，首次揭示一種在種子萌發期通過適當高溫處理來篩選青菜抗熱植株的方法。采用所述的方法處理后，青菜植株可表現出非常顯著的抗熱性差異，并與植株后期在高溫條件下生長的的存活率密切相關。所述的方法耗時短，操作簡單，準確高效。青菜(5ra5^/cflc畫/e幼'/s邵.cA/"e肌'力，為十字花禾斗蕓薹屬一年生、二年生草本植物。所述的"抗熱植株"是指能夠在高溫的氣候環境下維持生長、發育、成熟的植株，所述的高溫一般指空氣溫度大于35'C(如4(TC)，而相應的土壤表面溫度可高達45-6(TC。所述的抗熱植株能夠在夏天生長、發育和成熟。所述的"適溫"是指最適合于植株生長的溫度，在該溫度下，植物處于較佳的生長狀態。作為本發明的優選方式，所述的適溫在20-32°C;更佳的，所述的適溫在26-30°C。6本發明人對于抗熱青菜種質資源和抗熱基因的研究已經持續了很多年，為此收集和選育了大批有用的育種材料，包括抗熱自交系華王和熱敏感自交系小八葉等。為了準確、高效地鑒定青菜多種自交系的抗熱性，在以往的研究中，本發明人曾經嘗試苗期、成株期和花期高溫處理，以找到一種可靠的方法，但是未能獲得理想的抗熱性鑒定結果。進一步深入研究后，本發明人意外地發現，在青菜種子的萌發期，對種子進行適當高溫處理，然后在適溫(如28'C)下繼續培養2天左右，就可以有效且快速地區分出青菜的抗熱性。因此，本發明提供一種篩選青菜抗熱植株的方法，所述方法包括(1)在待測青菜的種子萌發階段，將種子在46土0.5。C熱處理60土20分鐘，然后轉移到適溫下培養1-5天；(2)觀察植株的生長情況，篩選出青菜抗熱植株。所述的"種子萌發"，是指種子吸水后打破休眠，撐破種皮露出胚根的過程。種子萌發時，主要表現為以下特征干種子通過吸脹吸水，原生質膠體由凝膠狀態轉變為溶膠狀態，酶蛋白恢復活性，酶促反應與呼吸作用增強，貯藏物質開始轉化，胚根、胚芽的細胞生長與分裂使種皮破裂，胚根伸出。觀察到種子萌發后，挑選胚根側露白的種子，用于后續的熱處理。本發明人找到了可以最顯著地體現種子抗熱性差異的熱處理溫度，即46士0.5。C。高于46.5'C易于出現死苗現象，而低于45.5'C則無法最顯著地體現植株品種的抗熱性差異。熱處理的時間一般在60土20分鐘是較為適宜的。較優選的，步驟(1)中，將種子在46土0.4。C熱處理60士15分鐘；更優選的，將種子在46士0.2。C熱處理60±10分鐘；更優選的，將種子在46土0.rC熱處理60土5分鐘。在對萌發的種子進行熱處理后，將種子轉移到適溫下生長。所述的適溫是指常規的適合青菜生長的溫度，通常是在20-32'C下。在適溫下培養1天后，抗熱性植株和非抗熱性植株的生長差異就可以有所體現，因此可在適溫下培養1-10天后，較佳的l-5天，觀察植株的生長情況。優選的，步驟(1)中，將熱處理后的種子轉移到28士2t:下培養2-3天。作為本發明的特別優選的方式，植株生長情況的判斷通過觀察植株的胚根生長情況來實現。如果胚根能夠繼續以一定的速度伸長，則該植株可能是抗熱品種。優選的，還同時設置不經過熱處理的同種植株對照，通過觀察熱處理和非熱處理的植株的胚根伸長情況來判斷該種植株的抗熱性。優選的，所述的對照組植株是自青菜的種子萌發階段起將種子在28土2。C下培養2-3天獲得的植株。作為本發明的優選方式，以抗熱指數來定量地確定植株的抗熱性。所述的抗熱指數的計算公式如下抗熱指數(HI)-熱處理植株的胚根長度/對照組植株的胚根長度根據本發明人長期的、反復的試驗，并將植株的抗熱指數與之后植株在受熱環境下的存活率進行比對，結果確定合適的抗熱指數值是不低于0.4(如0.4-1)。也即當植株的抗熱指數不低于0.4時，則該植株是抗熱植株；優選的，將抗熱指數不低于0.45的植株作為抗熱植株；更優選的，將抗熱指數不低于0.5的植株作為抗熱植株。可以采用多種加熱的方式對處于萌發階段的種子進行熱處理，加熱的方法是本領域人員已知的。作為本發明的優選方式，使用水浴的加熱方式來對種子進行熱處理。優選的，將種子置于適當的容器(上端敞開且處于水平面上)中，置于水浴中。經過試驗還發現，水浴的熱處理方法比采用培養箱通過空氣加熱種子的方法的熱處理效果更優異，采用水浴的方法在抗熱品種早期選育中能夠很好地反映出品種間差異。這是因為水浴的方法比較接近大田高熱土壤的溫度和濕度環境，且溫度易于控制，受熱均勻，結果可重復。在經過熱處理后，將種子轉移到一般的培養介質中培養，所述的培養介質沒有特別的限制，適合于青菜苗期生長的培養介質均是可用的。優選地，所述的培養介質是濕潤的蓬松性介質，例如用水濕潤的濾紙或脫脂棉，從而胚根可以穿過所述介質豎直往下生長。本發明人的驗證發現，在青菜苗期的3葉期進行熱處理也能夠一定程度地體現植株的抗熱性差異，盡管這種抗熱性差異表現不如在種子萌發期進行熱處理的抗熱性差異明顯。因此，在對種子萌發期進行上述篩選的基礎上，對篩選出來的植株還可在苗期的3葉期進行進一步的熱處理篩選，從而作為判斷植株抗熱性的進一步參考依據。優選的，在苗期的3葉期進行熱處理時，溫度可以是44-50。C。作為本發明的優選方式，為了獲得處于萌發階段的青菜種子，將待測青菜的種子浸種(如浸種約1-5小時，較佳的2小時)后置于濕潤的介質上催芽，使青菜的種子進入萌發階段。所述的濕潤的介質例如是濕潤的濾紙或濕潤的脫脂棉。在獲得了所述青菜抗熱植株后，可將生長到一定階段的植株移栽到試驗田或大田中，繼續培養。在本發明的優選實施例中，發明人選擇了一種已知的抗熱品種華王和一種已知的熱敏感品種小八葉，驗證它們經過熱處理后的抗熱性反應。也即，將萌動的青菜種子置于46'C的高溫下催芽1小時，經28'C的適溫培養2天，測定胚根長度，以兩種溫度下胚根長度的比值作為個體抗熱水平的抗熱指數。結果發現，華王在抗熱性上確實表現出明顯的優勢，而小八葉抗熱性不佳。因此，可以確定本方法能夠準確地反映華王和小八葉兩品種的抗熱性差異。本發明的方法適用于鑒定許多青菜自交系和雜交系的抗熱性，選擇出抗熱植株，經后續移栽后驗證，本發明的方法準確性高、重復再現性良好。利用本發明的方法，本發明人已經從HR-ll(抗熱品種)XHR-31(熱敏感品種)雜交的F4群體中鑒定出200個抗熱水平不同的株系，并培育出雄性不育抗熱雜交品種。本發明的主要優點在于本發明的方法以剛萌發的種子熱處理后的熱抗指數為衡量指標，簡單方便，溫度容易控制，短時內(僅需要數天)就能夠快速得出判斷，可用于品種間的快速比較。并且，本發明的方法準確度高，有廣泛的應用價值。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。I.材料與方法1.耐熱試驗受試品種試驗采用青菜抗熱品種華王(見《上海蔬菜》，2005年第6期)和熱敏感9品種小八葉(見《上海蔬菜》，2007年第5期)作為主要的研究對象，同時選用其它青菜品種和自交系31個(見表l)與上述兩個品種比較。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.苗期高溫處理在溫室內2rC下盆栽青菜，待植株長到3葉、6葉和9葉時轉移到人工氣候箱內，在40°C，42°C，44°C，46°C，48。C和50'C的溫度下培養，觀察植株形態的變化。培養時，采用的培養基質是常規的營養土、蛭石、草炭土按1:1:1混和的混合物。3.花期高溫處理在溫室內2rc下盆栽青菜植株，待植株抽薹時轉移到人工氣候箱內，在40°C,42°C，44°C，46°C，48。C和50°C的溫度下培養，觀察植株形態的變化。培養時，采用的培養基質是泥炭土和蛭石混和營養土。4.萌動種子高溫處理熱處理方法將萌發的種子測一初始胚根長后播在塞有濕潤脫脂棉的1.5ml離心管中，分別置于水浴鍋中熱處理，設3個溫度40°C，42°C，43°C，每個溫度各處理0.5h，lh，2h,然后轉移至28。C培養1天后再測胚根長度。高熱處理方法根據熱處理的結果再調整熱處理溫度和方法將種子播在鋪有濕潤濾紙的平板上催芽，待種子萌發時挑選胚根側露白，大小一致的種子播在EP管中，水浴鍋熱處理設5個溫度44°C，45°C，46°C，47°C，48°C，每個溫度下各處理0.5h，lh，2h，然后轉移至28。C培養3天后再測胚根長度。熱抗指數(HI，HeatIndex)以不經熱處理，在28'C下培養相同時間、相同品種的植株胚根長作對照，分別計算各品種在不同溫度處理下的熱抗指數熱抗指數=高溫處理下的胚根長/28'C處理下的胚根長熱抗指數大于1則表明促進胚根伸長，小于1則是胚根伸長受到抑制。需要說明的是，在熱抗指數小于l時，僅能說明熱處理后的植株胚根生長受到限制，如果熱處理后的植株的胚根還能以一定速度生長和發育，且熱抗指數不低于0.4，可認為是抗熱植株。II.實施例實施例1.苗期高溫處理后青菜各品種的不同反應在苗期分別考察了青菜不同自交系3葉期，6葉期及9葉期對高溫的反應，結果表明在3葉期進行熱處理品種間差異最明顯，植株越大，對逆境抵抗力越強，差異越小。環境溫度在46。C以上時傷害趨于明顯。由圖l可以看出，5(TC高溫下華王植株還能正常生長，表現為抗熱品種；而小八葉則葉片焦枯，出現死苗，對高溫最為敏感。其它31個青菜自交系或品種在苗期的抗熱性介于華王和小八葉之間。實施例2.花期高溫條件下青菜各品種的反應待各自交系抽薹時轉移到人工氣候箱的高溫環境下培養后發現高溫使生殖生長的進程受到明顯的抑制，側枝不再抽薹，逆轉入營養生長階段。抗熱品種華王主薹還能緩慢開花，但難以正常結實。而熱敏感品種小八葉的花器官分化出現不正常。實施例3.萌動期種子熱處理后熱抗指數的差異因為青菜不同品種在外觀特征上還是有些差異，因此本發明人在比較品種間抗熱性的時候需要引入相對值的概念即熱抗指數來扣除無高溫脅迫存在時各品種的本底差異。本發明人分別考察了已知的抗熱品種華王和不耐熱品種小八葉在40°C，42°C，43'C條件下的熱抗指數，發現一個有趣的現象和28。C相比，在40°C，42°C，43'C條件下華王的熱抗指數小于1,即胚根伸長一律受到抑制，且隨著處理時間的延長及溫度的升高抑制程度加深(圖2)。而小八葉在4(TC處理0.5，1，2小時及42t:處理0.5小時反而促進胚根伸長(熱抗指數大于l)，在此基礎上再提高溫度及延長處理時間后才表現出受抑制的現象。并且小八葉的熱抗指數一直大于華王，一直到43。C處理2小時的時候才出現逆轉。不過隨著熱處理程度的加深，小八葉熱抗指數的跌幅還是明顯大于華王的，結合前述2品種苗期(2.1)和花期(2.2)高溫條件下的表現，本發明人有理由相信本次實驗設置的溫度還不夠高，還不足于形成突現華王抗熱優勢的熱脅迫。事實上，夏季高溫的時候土表溫度可超過45°C，而高溫產生的熱蒸氣會使植物根際周邊溫度高于50°C,因此，對于青菜抗熱性研究來說找到一個最佳的臨界溫度是至關重要的，在該溫度下既能使品種間顯現出最顯著的抗熱性差異，又能保證熱敏感的小八葉不受到致命的影響。基于上述考慮，本發明人設計了高熱處理實驗，在42'C以上又設置幾個溫度梯度來考察華王和小八葉這2個品種的表現。實施例4.高熱處理后胚根長度的變化在42'C基礎上進一步提高熱處理溫度后出現了本發明人所預期的結果(圖3)，華王在抗熱性上果然表現出了明顯的優勢，在本發明人設置的5個溫度下其熱抗指數均高于小八葉，并且隨著溫度的增加和脅迫時間的延長，兩者的差距越來越大。在47t:和48。C處理2小時后的小八葉在3天28'C培養后甚至只長出l-2片子葉，胚根一點也沒伸長，因此移栽(移栽到盆缽中，在夏天(7-8月)室外的自然條件下生長)后這樣的植株沒能成活。因為47。C和48'C條件下有死苗現象的發生，而44。C和45。C下兩品種差異也不是最大，因此46t成為首選的溫度條件。在0.5、1、2小時的處理時間上比較，也是l小時的差異最大，也最為穩妥。利用本發明的方法，本發明人已經從HR-ll(抗熱自交系)XHR-31(熱敏感自交系)等雜交組合中篩選抗熱水平不同的組合，并培育出雄性不育抗熱雜交品種。一些代表性的株系的處理方式、熱抗指數以及移栽后情況見表2。可見熱抗指數高的品種其移栽后的成活率也很高，因此，本發明的方法可良好地用于鑒定青菜植株的抗熱性，鑒定結果準確。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>利用本發明的方法，本發明人也系統鑒定了其它31個青菜品種、自交系或Fl代雜交品種在46'C處理下熱處理60分鐘后的熱抗系數。并且將各品種移栽到到盆缽中，使它們在夏天(7-8月)室外的自然條件下生長，觀察它們的移栽后成活率。結果見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由上表可見，熱抗指數大于0.4的品種，移栽后的平均成活率是94.4%;而熱抗指數小于0.4的品種，移栽后的成平均活率是84.3%;具有統計學意義。因此，可見采用本發明的方法，通過鑒定抗熱指數的大小可良好地獲得移栽后成活率高的耐熱品種。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求1.一種篩選青菜抗熱植株的方法，其特征在于，所述方法包括(1)在待測青菜的種子萌發階段，將種子在46±0.5℃熱處理60±20分鐘，然后轉移到適溫下培養1-5天；同時設置對照組，自青菜的種子萌發階段起將種子在適溫下培養1-5天；(2)計算抗熱指數，如抗熱指數不低于0.4，則該植株是抗熱植株；其中，所述的抗熱指數＝熱處理植株的胚根長度/對照組植株的胚根長度。2.如權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，種子在46士0.2。C熱處理60±10分鐘。3.如權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的適溫是28士2。C。4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，轉移到適溫下培養2-3天。5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，如抗熱指數不低于0.45，則該植株是抗熱植株。6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的熱處理是通過水浴加熱實現的。7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，熱處理后，將種子轉移到濕潤的蓬松性介質上，從而胚根穿過介質豎直往下生長。8.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法還包括(3)對步驟(2)獲得的植株培養至苗期的3葉期，在44-5(TC下進行熱處理，觀察植株的生長情況，進一步確定青菜抗熱植株。9.如權利要求l所述的方法，其特征在于，在步驟(l)之前，還包括步驟將青菜的種子進行浸種，然后置于濕潤的介質上催芽，使青菜的種子進入萌發階段。10.—種培養青菜抗熱植株的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)在青菜的種子萌發階段，將種子在46土0.5。C熱處理60±20分鐘，然后轉移到適溫下培養1-5天；同時設置對照組，自青菜的種子萌發階段起將種子在適溫下培養1-5天；(2)計算抗熱指數，如抗熱指數不低于0.4，則該植株是抗熱植株；其中，所述的抗熱指數=熱處理植株的胚根長度/對照組植株的胚根長度；(3)將(2)中獲得的青菜抗熱植株移栽到大田中繼續培養。全文摘要本發明公開了一種作物萌動種子抗熱性快速鑒定方法。所述的方法包括在待測青菜的種子萌發階段，將種子在46±0.5℃熱處理60±20分鐘，然后轉移到28±2℃下培養1-5天；測量胚根長并觀察植株的生長情況，篩選出青菜抗熱植株。本發明的方法耗時短，操作簡單，準確高效。文檔編號A01G1/00GK101647351SQ20081004155公開日2010年2月17日申請日期2008年8月11日優先權日2008年8月11日發明者何玉科,段海燕,鐘蔚麗申請人:中國科學院上海生命科學研究院