專利名稱：一種藥用金線蓮組織培養一步成苗快速繁殖方法
技術領域：
本發明涉及一種藥用金線蓮組織培養一步成苗快速繁殖方法，主要用于藥用金線蓮的組 織培養。
技術背景金線蓮[^7oectoc/ iJ"s rox/wrg力ii 6raW. J "/7c7]為蘭科開唇蘭屬多年生草本，別名 金蠶、金線蘭、金線虎頭蕉等，是我國傳統珍貴藥材，素有"金草"、"神藥"、"烏人參"等 美稱，在民間應用范圍較廣，廣泛應用于風濕性關節炎、高血壓、糖尿病、腎病等疑難雜癥 的治療和強身健體、病后體虛恢復等方面，尤其在浙江、福建、臺灣等省和東南亞地區被視 為珍稀名貴藥材，特別在臺灣省更是倍受青睞，被稱為"藥中之王"。近年來，隨著對其藥效 學和臨床應用研究的深入，對金線蓮藥用價值的認識進一步提高，其市場貨源緊缺的狀況更 為嚴峻。金線蓮種子微小，由未成熟的，J及數層種皮細胞構成，自然萌發率和繁殖率低，生產上 的種苗均來自組織培養。目前，金線蓮的組培育苗主要通過"不定芽的誘導、芽增殖與壯苗 培養"三個階段來實現，培養時間較長、成本較高，造成金線蓮生產一直得不到較快的發展。 因此，如何縮短培養時間、提高培養效率、降低培養成本已成為促進金線蓮生產發展的當務 之急。 發明內容本發明的目的是提供一種藥用金線蓮組織培養一步成苗快速繁殖方法。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案包括如下步驟1) 培養基準備(1) 配制以1/2MS為基本培養基，每升添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)2mg、 a -萘乙酸(NAA) 1.0 1.5mg、蕓苔素內酯0.05mg、香蕉100g、瓊脂6. 5g和蔗糖25g， pH值調節至5.6;(2) 分裝將配制后的培養基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱均勻地分裝于干凈的培養瓶中， 每瓶約50ml，稍涼后加蓋；(3) 滅菌將加入培養基的培養瓶及時放入高壓滅菌鍋內滅菌，滅菌條件為121°C 、 105kPa 下滅菌15分鐘，滅菌后及時取出培養瓶，冷卻備用；2) 外植體處理和接種該步驟分為兩種情形，當采用自然生長的植株作為外植體時包括清洗，消毒，接種三 步，其中清洗選擇自然生長、無病蟲害的健壯植株，用加入少許肥皂粉的水清洗植株，后用 流水沖洗2小時；消毒在無菌條件(水平超凈工作臺)下，去除葉片，將植株莖段在75%的酒精中浸潤10 秒后，放入10%的次氯酸鈉消毒15分鐘，用無菌水清洗6遍，瀝干水分，放入無菌的培養皿中 備用；接種將消毒后備用的莖在無菌條件下切成長約lcm、含一個莖節的若干莖段，接種于 準備好的培養基上，每瓶接l個莖段；當采用組培無菌苗時直接進行無菌接種，即在無菌條件下將組培無菌苗去葉，將莖切 成長約lcm、含一個莖節的若干莖段，接種于準備好的培養基上，每瓶接l個莖段；3) 培養將接好種的培養瓶移入培養室進行幼苗的誘導與培養，培養條件為溫度25土2'C，光 照時間每天12小時，光照強度1500 20001x，培養時間四個月，培養期間要勤檢査，發現 污染的要及時去除；4) 移栽選苗高約6 8cm、具葉3張以上、莖基直徑約2mm、發根2 3條的試管苗，煉苗4天 后，洗凈附著在植株上的培養基，并晾干洗滌水后移栽至1份菜園土 + 2份粗砂(粗2 3mm) + 1份木屑，或1份菜園土+1份粗砂+ 2份木屑的基質中，3個月后植株成活率達95%以上， 且植株挺拔、生長良好。本發明通過合理調節激素用量及相互間的配比，促進金線蓮幼苗的誘導與的生長，培 養四個月后，其增殖率達4.8倍，且組培苗色綠、葉多、根壯，生長良好。移栽結果也表 明， 一步培養成的組培苗符合生產所需，可作為金線蓮生產種苗的重要來源。
具體實施方式
1、方法和步驟實例藥用金線蓮組織培養一步成苗快速繁殖方法實施例包括如下步驟1) 培養基準備①配制以1/2MS為基本培養基，每升添加6-BA2mg、 NAA1. Omg或l. 5mg、 蕓苔素內酯0.05mg、香蕉100g、瓊脂6.5g和蔗糖25g， pH調節至5. 6;②分裝將配制后的培 養基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱均勻地分裝于干凈的培養瓶中，每瓶約50ml，稍涼后加蓋； ③滅菌將加入培養基的培養瓶及時放入高壓滅菌鍋內滅菌，滅菌條件為12rC、 105kPa 下滅菌15min，滅菌后及時取出培養瓶，冷卻備用。2) 外植體處理和接種該步驟分為兩種情形，當采用自然生長的植株作為外植體時包括清洗，消毒，接種三步，其中清洗選擇自然生長、無病蟲害的健壯植株，用加入少許肥皂粉的水清洗植株，后用 流水沖洗2小時；消毒在無菌條件(水平超凈工作臺)下，去除葉片，將植株莖段在75%的酒精中浸潤10 秒后，放入10%的次氯酸鈉消毒15分鐘，用無菌水清洗6遍，瀝干水分，放入無菌的培養皿中 備用；接種將消毒后備用的莖在無菌條件下切成長約lcm、含一個莖節的若干莖段，接種于準備好的培養基上，每瓶接l個莖段。當采用組培無菌苗時直接進行無菌接種，即在無菌條件下將組培無菌苗去葉，將莖切成長約lcm、含一個莖節的若干莖段，接種于準備好的培養基上，每瓶接l個莖段。3)培養①將接好種的培養瓶移入培養室進行幼苗的誘導與培養。培養條件為溫度(25士2。C)，光照時間12h/d，光照強度1500 20001x;培養時間四個月；②培養期間要勤檢査，發現污染的要及時去除。5)移栽選苗高約6 8cm、具葉3張以上、莖基直徑約2mm、發根2 3條的試管苗，煉苗4天后，洗凈附著在植株上的培養基，并晾干洗滌水后移栽至1份菜園土 + 2份粗砂(粗2 3mm) +1份木屑，或1份菜園土 +粗砂1份+木屑2份的基質中，3個月后植株成活率達95%以上，且植株挺拔、生長良好。實施例l1) 培養基準備(1) 配制以1/2MS為基本培養基，每升添加6-BA2mg、 NAA1. Omg、蕓苔素內酯0, 05mg、 香蕉100g、瓊脂6.5g和蔗糖25g，以上物質混合后的培養基的pH值調節至5.6;(2) 分裝將配制后的培養基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱均勻地分裝于干凈的培養瓶中， 每瓶約50ml，稍涼后加蓋；(3) 滅菌將加入培養基的培養瓶及時放入高壓滅菌鍋內滅菌，滅菌條件為121°C 、 105kPa 下滅菌15分鐘，滅菌后及時取出培養瓶，冷卻備用。2) 外植體處理(1) 清洗選擇自然生長、無病蟲害的健壯植株，用加入少許肥皂粉的水清洗植株，后 用流水沖洗2小時；(2) 消毒在無菌條件(水平超凈工作臺)下，去除葉片，將植株莖段在75%的酒精中浸 潤10秒后，放入10%的次氯酸鈉消毒15分鐘，用無菌水清洗6遍，瀝干水分，放入無菌的培養 皿中備用。3) 接種將消毒后備用的莖在無菌條件下切成長約lcm、含一個莖節的若千莖段，接種于準備好 的培養基上，每瓶接l個莖段；4) 培養(1) 將接好種的培養瓶移入培養室進行幼苗的誘導與培養；(2) 培養條件為:溫度(25士2'C)，光照時間12h/d，光照強度1500 20001x;培養 時間四個月；(3) 培養期間要勤檢査，發現污染的要及時去除。5) 移栽選苗高大于6cm、具葉3張以上、莖基直徑約2mm、發根2 3條的試管苗，煉苗4天 后，洗凈附著在植株上的培養基，并晾干洗滌水后移栽至1份菜園土 + 2份粗砂(粗2 3mm) + 1份木屑的基質中。實施結果培養四個月后，平均成苗數4.3株，組培苗平均株高6.2cm、平均葉凈增 3.4張、平均發根數2.6條、平均鮮重凈增517.5mg。移栽3個月后，植株成活率96.4%， 成活植株挺拔、生長良好。 實施例21) 培養基準備(1) 配制以1/2MS為基本培養基，每升添加6-BA2mg、 NAA 1. 5mg、蕓苔素內酯0. 05mg、 香蕉100g、瓊脂6. 5g和蔗糖25g， pH調節至5.6;(2) 分裝將配制后的培養基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱均勻地分裝于干凈的培養瓶中， 每瓶約50ml，稍涼后加蓋；(3) 滅菌將加入培養基的培養瓶及時放入高壓滅菌鍋內滅菌，滅菌條件為12rC、105kPa 下滅菌15分鐘，滅菌后及時取出培養瓶，冷卻備用。2) 外植體處理(1) 清洗選擇自然生長、無病蟲害的健壯植株，用加入少許肥皂粉的水清洗植株，后用流水沖洗2小時；(2) 消毒在無菌條件(水平超凈工作臺)下，去除葉片，將植株莖段在75%的酒精中浸 潤10秒后，放入10%的次氯酸鈉消毒15分鐘，用無菌水清洗6遍，瀝干水分，放入無菌的培養 皿中備用。3) 接種將消毒后備用的莖在無菌條件下切成長約lcm、含一個莖節的若干莖段，接種于準備好的培養基上，每瓶接l個莖段；4) 培養(1) 將接好種的培養瓶移入培養室進行幼苗的誘導與培養；(2) 培養條件為溫度(25士2。C)，光照時間12h/d，光照強度1500 20001x;培養 時間四個月；(3) 培養期間要勤檢査，發現污染的要及時去除。5) 移栽選苗高約6 8cm、莖基直徑約2mra、發根2 3條的試管苗，煉苗4天后，洗凈附著在 植株上的培養基，并晾干洗滌水后移栽至1份菜園土 + 1份粗砂(粗2 3mm) +2份木屑的 基質中。實施結果培養四個月后，平均成苗數4.7株，組培苗平均株高6.5cm、平均葉凈增 3.6張、平均發根數2.4條、平均鮮重凈增536.4mg。移栽3個月后，植株成活率97.0%， 且植株挺拔、生長良好。 實施例31) 培養基準備 —(1) 配制以1/2MS為基本培養基，每升添加6-BA2mg、 NAA 1. 5mg、蕓苔素內酯0. 05mg、 香蕉100g、瓊脂6.5g和蔗糖25g， pH調節至5.6;(2) 分裝將配制后的培養基加熱至瓊脂完全溶解，乘熱均勻地分裝于干凈的培養瓶中， 每瓶約50ml，稍涼后加蓋；(3) 滅菌將加入培養基的培養瓶及時放入高壓滅菌鍋內滅菌，滅菌條件為1'21'C 、 105kPa 下滅菌15分鐘，滅菌后及時取出培養瓶，冷卻備用。2) 外植體選擇生長較為健壯組培無菌苗(植株)作為外植體。3) 接種在無菌條件下將組培無菌苗去葉，將莖切成長約lcm、含一個莖節的若干莖段，接種于 準備好的培養基上，每瓶接l個莖段。4) 培養(1) 將接好種的培養瓶移入培養室進行幼苗的誘導與培養；(2) 培養條件為溫度(25土2。C)，光照時間12h/d，光照強度1500 20001x;培養 時間四個月；(3) 培養期間要勤檢査，發現污染的要及時去除。5)移栽選苗高約6 7cm、具葉3張以上、莖基直徑約2mm、發根2 3條的試管苗，煉苗4天 后，洗凈附著在植株上的培養基，并晾干洗滌水后移栽至1份菜園土+2份粗砂+ 1份木屑， 或1份菜園土+粗砂1份(粗2 3鵬)+2份木屑的基質中。實施結果培養四個月后，平均成苗數4.2株，組培苗平均株高6. lcm、平均葉凈增3.2 張、平均發根數2.3條、平均鮮重凈增505.8mg。移栽3個月后，植株成活率96.1%，且植株挺 拔、生長良好。2、試驗2.1激素對金線蓮一步成苗影響的試驗采用生長健壯的無菌組培苗植株作為外植體，以1/2Ms為基本培養基，添加香蕉10%、 瓊脂O. 65%和蔗糖2.5%，激素添加量分別為6-BA2 3. Omg/L、 NAAO. 0 1. 5mg/L、蕓苔素 內酯0.00 0.05mg/L，共16個處理，pH調節至5.6。將外植體在無菌條件下去葉后，莖段 切成長約lcm、含一個莖節的若干小莖段，分別接種在16個培養基上，每瓶接一個小莖段， 每處理接20瓶，重復三次。培養條件為溫度(25土2。C)，光照時間12h/d，光照強度1500 20001x。培養期間 每隔10d觀察一次生長情況，培養時間四個月考察、測定成苗數、新增葉片數、發根數和 鮮重凈增量。2. 2移栽試驗選苗高約6 8cm、莖基直徑約2mra、叢生根有2 3條的試管苗，煉苗4天后，洗凈附 著在植株上的培養基，并晾干洗滌水后移入9種不同的種植基質中，考察不同基持對金線 蓮組培苗成活率的影響。移栽前，試驗基質均用45%多菌靈可濕性粉劑800倍溶液澆透消毒。試驗條件為遮蔭度80%的陰棚，保持空氣相對濕度的80 90%。如發現有病死植株，及 時拔除。每處理100株，重復三次。移栽3個月后考查成活株數，并進行分析。3、 結果與分析3.1激素對金線蓮一步成苗影響的試驗結果分析激素種類與配比對金線蓮組培一步成苗結果存在明顯的影響。從表l可以看出，6-BA 對金線蓮芽的萌發具有較好的促進作用，但只加6-BA的情況下，成苗率較低、葉片及發根 數少，且生長差；NAA對發葉、發根有利，在添加1.0mg/L與1.5mg/L的情況下，新增葉片、 發根數和鮮重凈增量均好于其它處理；蕓苔素內酯0.05mg/L能明顯促進植株生長。最適宜 的激素添加配比為6-BA2mg/L、 NAA1. Omg/L或1. 5mg/L、蕓苔素內酯0. 05mg/L，培養四個 月后的平均成苗數4. 8株、平均葉凈增3. 6張、平均發根數2. 5條、平均鮮重凈增525. 6mg。表l激素對金線蓮一步成苗的影響序號激素添加量(mg/U平均發芽 數(株)平均凈增 葉(片)平均發根 數(條)平均鮮重 凈增(mg)綜合評價6-BA陽蕓苔素內酯12.0—-3.711.010.65342.4差22.0_0. 053.691.211.30427.6差32.00.5-4.032.371.43386.5差42.00.50. 054.603.351.76498.5良2.01.0_4.863.402.13470.1差62.01. 00. 054.973.642.68564.6優2.01. 5-4.723.782.50516.3良82.01. 50. 054.783.692.72551.2優93.0——5.620.630.42312.5差103.0—0. 055.750.920.77405.8差113.00.5-5.082.271.56425.6差123.00.50. 055.133.452.37436.1差13 3.01.0—4.923.352.39464.5差143.01.00.054.853.502.43543.4良153.01. 5-4.903.422.33470.7差163,01. 50. 054.673.532.54521.2良3.2移栽試驗結果分析表2為金線蓮組培苗移栽3個月后的植株成活情況。從表中可以看出，處理6和處理9 保持96. 0%以上的成活率；處理7和處理8的植株成活率在80%左右，處理1的成活率最低， 僅為46.6%。表明在菜園土中加入粗砂、木屑能明顯提高金線蓮試管苗移栽的成活率，適宜 添加的比例為1份菜園土中加入粗砂2份、木屑1份或粗砂1份、木屑2份，要求充分混勻。表2種植基質對金線蓮試管苗移栽成活率的影響處理移栽數平均成活株數:平均成活率綜合種植基質號(株)(株)1 ( 評價1菜園土30014046.6差2菜園土1份+粗砂1份(2--3mm、下同)30018561.6差3菜園土l份+粗砂2份3002331 77. 7差4菜園土1份+木屑1份3001771 59.0差5菜園土l份+木屑2份3002031 67. 7差6菜園土l份+粗砂2份+木屑l份30029598.3優菜園土l份+粗砂2份+木屑2份3002581 86.0良8菜園土1份+粗砂1份+木屑1份300242i 80. 7良9菜園土l份+粗砂l份+木屑2份3002891 96.3優
權利要求
1、一種藥用金線蓮組織培養快速繁殖方法，其特征在于包括如下步驟1)培養基準備該步驟包括配制，分裝，滅菌三步，其中配制以1/2MS為基本培養基，每升添加6-芐氨基嘌呤2mg、α-萘乙酸1.0～1.5mg、蕓苔素內酯0.05mg、香蕉100g、瓊脂6.5g和蔗糖25g，混合后的培養基的pH值調節至5.6；分裝將配制后的培養基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱均勻地分裝于干凈的培養瓶中，稍涼后加蓋；滅菌將加入培養基的培養瓶及時放入高壓滅菌鍋內滅菌，滅菌條件為121℃、105kPa下滅菌15分鐘，滅菌后及時取出培養瓶，冷卻備用；2)外植體處理和接種該步驟分為兩種情形，當采用自然生長的植株作為外植體時包括清洗，消毒，接種三步，其中清洗選擇自然生長、無病蟲害的健壯植株，用加入少許肥皂粉的水清洗植株，后用流水沖洗2小時；消毒在無菌條件下，去除葉片，將植株莖段在75％的酒精中浸潤10秒后，放入10％的次氯酸鈉消毒15分鐘，用無菌水清洗6遍，瀝干水分，放入無菌的培養皿中備用；接種將消毒后備用的莖在無菌條件下切成長約1cm、含一個莖節的若干莖段，接種于準備好的培養基上，每瓶接1個莖段；當采用組培無菌苗時直接進行無菌接種，即在無菌條件下將組培無菌苗去葉，將莖切成長約1cm、含一個莖節的若干莖段，接種于準備好的培養基上，每瓶接1個莖段；3)培養該步驟將接好種的培養瓶移入培養室進行幼苗的誘導與培養，培養條件為溫度25±2℃，光照時間每天12小時，光照強度1500～2000lx，培養時間四個月左右，培養期間要勤檢查，發現污染的要及時去除；4)移栽選苗高約6～8cm、具葉3張以上、莖基直徑約2mm、發根2～3條的試管苗，煉苗4天后，洗凈附著在植株上的培養基，并晾干洗滌水后移栽至1份菜園土+2份粗砂+1份木屑，或1份菜園土+1份粗砂+2份木屑的基質中。
全文摘要
本發明公開了一種藥用金線蓮組織培養一步成苗快速繁殖方法，主要包括1)培養基準備，該步驟包括配制，分裝，滅菌三步；2)外植體處理和接種，該步驟分為兩種情形，當采用自然生長的植株作為外植體時包括清洗，消毒，接種三步；當采用組培無菌苗時直接進行無菌接種；3)培養；4)移栽。本發明以自然生長或組培繼代培養產生的金線蓮植株中間莖段為外植體，在無菌條件下將含有一個莖節的莖段接種于培養基上，結果表明最適宜的培養基經過四個月的培養后，每個外植體平均成苗數4.8株，每株平均葉凈增3.6張、平均發根數2.5條、平均鮮重凈增525.6mg。組培苗移栽至基質中生長良好，3個月后植株成活率達95％以上。本發明可大大縮短金線蓮組培成苗時間，顯著提高培養效率，降低育苗成本，可作為金線蓮種苗生產的重要方法。
文檔編號A01H4/00GK101213942SQ20081005923
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月10日 優先權日2008年1月10日
發明者任江劍, 俞旭平, 徐建中, 江建銘, 沈宇峰, 沈曉霞, 王志安 申請人:浙江省中藥研究所有限公司