專利名稱：：利用植物鋁誘導表達基因增加植物抗鋁性的方法
技術領域：
：本發明涉及植物基因工程領域，具體地說，涉及一種利植物鋁誘導表達基因增加植物抗鋁性的方法。
背景技術：
：鋁是自然界含量最多的金屬元素,占地殼總質量的7%。其中大部分在土壤中以氧化鋁、硅化鉬的形式存在，對植物的生長不夠成傷害。當土壤溶液酸化后(p!K5),鋁就會從氧化物或硅酸鹽中釋放出來，溶解到土壤中，主要以A產形式存在。A產對植物的脅迫最大，甚至低濃度(pmol/L)鋁離子在酸性條件下就能對植物產生毒害效應[Horstetal.Effectofaluminumonrootgrowth,cell-divisionrateandmineralelementcontentsinrootsofimgw'cw/atofgenotypes.ZPflanzenphysiol,1983，109:95-103;KinraideandParker,Assessingthephytotoxicityofmononuclearhydroxyl-aluminum.PlantcellEnviron,1989,12:479-487]。鋁毒最明顯的特征是抑制根的生長，造成植物對水分和營養吸收的困難[KochinaLV，Cellularmechanismsofaluminumtoxicityandresistanceinplants.AnnuRevPlantPhysiol.PlantMolBiol,1995，46:237-260;Clarkson，ClarksonDT.Theeffectofaluminumandsomeothertrivalentmetalcationsoncelldivisionintherootapicesof爿〃/wmcepa.AnnBot,1965,29:309-315]。研究者對鋁誘導植物抗性基因的表達做了大量的研究。Richard和S麗den[RichardsKDetal.Wali6andWali7.Plantphysiol1994,105:1455-1456;SnowdenKCandGardnerRC.Fivegenesinducedbyaluminuminwheat(7HZ/c謂ae勸'v應L,)roots.PlantPhysiol,1993,103:855-861]從鋁敏感小麥中分離得到了7個鋁誘導基因，命名wali基因(forwheataluminuminduced)。這些基因編碼的蛋白分別與植物類金屬硫蛋白(walil)、苯丙氨酸解氨酶(wali4)，蛋白酶抑制劑〔wali3,wali5和wali6)及谷氨酰胺合成酶(wali7)具有同源性。另外還有十幾個鋁誘導的基因已被分離出來，包括小麥、擬南芥和煙草中的各種基因。為了研究植物抗鋁性的機理，人們利用了轉基因技術。DelaFuente等(1997)將細菌(Pseudomonasaeniginosa)的梓檬酸合成酶基因(CS)在煙草中過量表達，結果轉基因煙草的耐鋁能力增強，這是人類首次釆用轉基因技術提高植物耐鋁特性的嘗試[delaFuenteJMetal.Aluminumtoleranceintransgenicplantsbyalterationofcitratesynthesis.Science,1997，276:1566-1568]。Anoop等(2003)將擬南芥的線粒體檸檬酸合酶CS基因導入油菜中并得到過量表達，結果轉基因植株中CS活性提高，植株的耐鋁能力增加[AnoopVMetal.Modulationofcitratemetabolismalteraluminumtoleranceinyeastandtransgeniccanolaofoverexpressingamitochondrialcitratesynthase.PlantPhysiol，2003，132:2205-2217]。Delhaize等(2004)將小麥根尖蘋果酸分泌的轉運蛋白基因ALMT1在大麥中異源表達，轉ALMT1基因的大麥植株其蘋果酸分泌的能力和耐鋁能力都有顯著提高[DelhaizeEetal.Engineeringhigh-levelaluminumtoleranceinbarleywiththeALMT1gene.PlantBiol,2004，101:15249-15254]。cDNA，稱之為Si69基因，它來自于谷子未成熟種子的cDNA文庫，該cDNA與植物抗鋁性有關，
發明內容本發明目的是提供一種利用植物受鋁誘導的基因來提高植物抗鋁性的方法。本發明從谷子(&to〃'a/to//caBeauv.Var.3661，3662)未成熟種子cDNA文庫中篩選得到一個cDNA克隆，稱之為Si69基因。該cDNA的序列長度為1061bp，為雙鏈核酸類型，線性，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。通過三大數據庫的檢索，發現Si69cDNA編碼蛋白與水稻(NP—001051238AAP12992)、擬南芥(NP—188925NP—199196)、小鹽芥(AAM19711)和小麥(AAC37416.1)同源性分別為84%,58%,50%，50%。它們都具有一共同特點蛋白結構中存在一保守的wali7結構域，但功能未知。Southern印跡研究表明該基因在谷子基因組中以單拷貝存在。Northern印跡分析5V砂基因的表達模式，表明其在谷子谷子幼苗、根、莖、葉、幼穗及未成熟種子等組織中均可檢測到其轉錄產物的存在。RT-PCR和熒光定量PCR研究表明^'"基因的表達受到鋁的誘導。進一步，本發明構建含Si69的表達載體，并將其轉化植物，用以考察轉基因植物的抗鋁性。在本發明實施方案中，構建了含有S/McDNA的擬南芥表達載體，其表達盒是由花椰菜花葉病毒35S啟動子和來自胭脂堿合成酶(nos)基因的3轉錄終止區域構成，選擇標記基因為新霉素嫌酸轉移酶II(NPTII)。所述的表達載體優選的是重組質粒pBI121-Si69，其中S/仰cDNA正向插入并且在35S啟動子驅動下。本發明將上述含有所述&69cDNA的重組表達載體轉化植物，如擬南芥，獲得了抗鋁性提高的轉基因植物。在本發明實施方案中，將含有所述cDNA的表達載體轉化擬南芥，獲得的植株抗鋁性提高，根伸長受鋁抑制減弱。本發明找到了與植物受鉬誘導的cDNA(稱為^'卯基因)，將所述的基因轉化到植物中可使植物抗鋁性增加。利用本發明方法，可以顯著提高植物的抗鋁性，從而對植物生物量的增加特別是農作物增產有重要意義。圖1顯示的是來自谷子的&69cDNA序列，以及推導的氨基酸序列。圖2顯示的是含有5V砂cDNA的擬南芥表達載體構建過程圖。圖3顯示的是T3代轉基因擬南芥Western雜交。圖4顯示的是擬南芥根部蘇木靜染色圖，其中左上圖和右上圖分別為野生型和轉基因植株在20^MA1處理下的染色圖，左下圖和右下圖分別是野生型和轉基因植株在50|aMAl處理下的染色圖(lOOpm標尺)；圖5顯示的是擬南芥根尖掃描電鏡圖(放大倍數上層xl.00K30pm標尺；下層:x2.50K12.0lim標尺)圖6顯示的轉基因擬南芥和野生型的根尖伸長及MDA含量情況。具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例l植物受鋁誘導基因S/69的克隆選取谷子授粉后5、7及12天的未成熟種子，材料混合后，提取總RNA,磁珠法富集mRNA(Promega)，釆用Stratagene公司cDNASynthesisKit反轉錄合成cDNA,雙鏈cDNA補平后，連接五"RIadapter,將其構建至人ZAPII載體上，使用ZAP-cDNAGigapackIIIGoldCloningKit(Stratagene公司)進行體外包裝。包裝完畢后，加入SM溶液和氯仿，離心后，上清即為構建好的文庫。取lpl文庫上清液進行滴度測定，結果表明構建的文庫容量為2xl07pfo/ml。原始文庫構建完成后，擴增一次備用。利用酵母雙雜交(Clontech公司)篩選cDNA表達文庫，技術為公知技術，經過篩選后，得到陽性克隆。進行序列測序,測序結果如SEQIDNo.1所示，稱之為S/65>。實施例2植物受鋁誘導基因&"的克隆1、植物組織總RNA的提取(1)將4ml苯酸與8mlRNA提取緩沖液混勻后，放在65°C水洛預熱；(2)取谷子葉片約5g，加入液氮和少量石英砂，研缽中充分研磨成粉末，裝入50ml離心管；(3)將預熱的提取混合液加入含有植物材料粉末的離心管中，與植物材料充分混勻，室溫抽提10min;再加入4ml氯仿，繼續抽提10min;(4)室溫條件下12,000rpm離心20min;吸取上清液，加入等體積氯仿再抽提一次；(5)室溫條件下12,000rpm離心20min;吸取上清液，加入1/3體積的8mol/LLiCl，混勻后置于4。C放置16h或冰上放置8-12h，沉淀RNA;(6)在4。C條件下12,000rpm,離心20min,棄去上清液；(7)加入2ml70o/。乙醇洗滌RNA沉淀，室溫條件下12,000rpm離心5min，將RNA沉淀在超凈工作臺內吹干，溶于適量DEPC處理水中，在-20°C(短期)或-70。C(長期)保存備用。2、RT-PCR(1)cDNA第一鏈的合成在經DEPC處理的離心管中依次加入以下成分試劑用量RNA5嗎oligdT0.2嗎DEPC-H20補足體積至20^混勻后瞬時離心，在70。C變性5min,冰上冷卻。依次加入以下成分試劑用量5xRTbuffer10|alRNasin0.5^dNTP1niM-MLV1piDEPC-H2017.5piTotal50(xl混勻后瞬時離心，在42。C反應60min。(2)PCR反應反應體系如下反轉錄產物1-2^15'primer(100ng/jjl)1pi3'primer(100ng/|jl)l^ddNTP(lOmmol/Leach)1jallOxTaqBuffer5|alTaq(51%1)1WSDW補足終體積至50pi首先將上述試劑加于200jxl離心管，混勻，瞬時離心，放于PCR儀上。用于&砂cDNA全長擴增引物PI:5'-GCGAGGAGAGAGGAGGGAAGAGC隱3'P2:5'-CGTCTCAGCGGTTCAGCGGATA-3'。擴增條件如下94。C,變性1min;60。C，退火1min;72°C,延伸1min;擴增循環數35;最后72°C，延伸10min。取適量PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余產物放于-2(TC保存。將PCR產物連接到T-vector,進行酶切和序列測序，鑒定正確，命名該質粒為pS,'69。實施例3用于擬南芥中表達S/69的表達載體的構建和轉化農桿菌表達盒是由花椰菜花葉病毒"5*啟動子和來自胭脂堿合成酶(nos)基因的3轉錄終止區域(Depickere等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-570)組成，選擇標記基因為新霉素磷酸轉移酶II(NPTII)。如圖2所示，以57卯質粒(實施例2的陽性克隆質粒)為模板，利用PCR擴增，使5，端帶入SamHI酶切位點，3，端帶入flag-tag標簽(MDYKDDDDK)和酶切位點，使flag-tag與Si69融合。擴增引物PI(5'-CGGGATCCAAGCGAGGAGAGAGG-3')，P2(5'畫GCGAGCTCTCAC7TGTCGTCGTCGTCCTr，GTCC^4CTGGTTGGACCAGT-3'),反應體系如下表所列，5769質粒5'primer(100ng/|il)1pl3'primer(100ng/(il)inidNTP(10籠ol/Leach)1pl10xTaqBuffer5^1Taq(5U/nl)1(alSDW補足終體積至50nl擴增條件為94°C,變性lmin;60°C,退火1min(退火溫度及時間應根據引物的長度及Tm值來確定)；72°C，延伸1min;擴增循環數30-35;最后72°C,延伸10min。取適量PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余產物放于-2(TC保存。克隆至pMD18-T，測序正確。將帶有flag-tag標簽的Si69用萬"附HI和S"cl雙酶切，回收840bp的片段；將雙元表達載體pBIUl((購自Clontech公司)用5amHI和&cl雙酶切，除去報告基因GUS,回收載體大片段，將載體和目的片段連接，轉化后，得到構建在pBI121載體上，由35S啟動子驅動的S柳cDNA.正向插入的重組質粒pBI121畫Si69。將pBI121畫Si69采用凍溶法直接轉化農桿菌GV3101，獲得含有重組質粒pBI121-Si69的農桿菌GV3101(pBI121-Si69)。農桿菌轉化技術為公知技術。實施例435S啟動子AS/69表達載體轉化擬南芥野生型擬南芥植株生長約4周后，出現初級花序。初級花序長至5-10cm高時將其剪去，使其次級花序生長。6-7天后，植物次級花序即將開花，或僅有極少的花已開，此時是轉化最佳時期。農桿菌轉化擬南芥植株的方法采用花芽浸泡法[CloughSJandBentAFFloraldip:asimplifiedmethodfor^4gro6ac^n'ww-mediatedtransformationof」ra6Wo戸^PlantJ,1998,16:735-743)，將擬南芥植株倒置，使蓮座葉以上的花序浸入稀釋好的菌液約3min，期間輕微晃動。將菌液浸泡過的植株橫放至22T:環境中，暗培養24小時后，豎直見光培養至收獲種子。收獲的T。代轉基因植株的種子用70%酒精處理2min，0.5%次氯酸鈉消毒處理8-10min，再用無菌水洗滌4-6遍。將種子均勻置于含Kan50|ig/mlMS培養基上篩選。置4。C暗培養2-3天進行春化，然后光照培養(16h光照，8h黑暗)7-12天，取抗性苗50株(苗深綠色，有真葉，有真正的根)移栽到花盆(花丼營養土蛭石=1:l)培養，獲得Ti代轉基因種子，有85%的轉基因株系篩選得到3:1比例分離的陽性植株。同時用上述相同的方法轉化不含Si69的空載體，作為陰性對照。提取陽性植株基因組DNA,擴增&'69基因。引物P1:5'-GCCAACCTGAAGCAGCACTA-3'和P2:5'-GCGTAAGGAACGTAGCAGAA-3',反應體系如表所列，<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>擴增條件為94°C，變性lmin;55°C,退火1min(退火溫度及時間應根據引物的長度及Tm值來確定)；72°C，延伸1min;擴增循環數30-35;最后72°C，延伸10min。取適量PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段長度619bp。其余產物放于-2(TC保存。結果表明，被檢10株陽性植株均擴增得到&仰基因，而野生植株(2株)和陰性對照(轉化不含5V砂基因的空載體植株)均未檢出。實施例5轉基因擬南芥中蛋白的檢測提取T3代轉基因擬南芥葉片總蛋白，經SDS-PAGE電泳分離，恒流冰洛轉膜后進行Westernblot雜交。其中一抗為anti-flagtag抗體，稀釋比例為1:10,000，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，稀釋比例為1:10,000。Western雜交結果參見圖3。圖中結果表明Si69在轉基因擬南芥中穩定表達。實施例6轉基因擬南芥中根部蘇木靜染色和掃描電鏡觀察實驗對象陽性植株10株，每組5株；陰性對照4株，每組2株；野生型植株4株，每組2株。樣品處理野生型、陰性植株和轉基因擬南芥種子用70%酒精處理2min，0.5%次氯酸鈉消毒處理8-10min，再用無菌水洗滌4-6遍。將種子均勻置于含50嗎/mlKan的MS培養基上篩選。置4。C暗培養2-3天進行春化，然后22。C光照培養(16h光照，8h黑暗)7天，用含有不同鋁濃度(20iiM和50laMAlCl3)的1/6MS(含10g/L蔗糖)培養液(pH4.0)分別處理植株根24h，根在鋁處理后用200ml蒸餾水浸泡15分鐘，然后用50ml蘇木精水溶液(w^O.P/。蘇木精w=0.01%KIO3O.lmmol/LNaOH)染色20分鐘，最后用去離子水浸洗15分鐘至無浮色。用顯微鏡觀察根尖染色情況并拍照。取擬南芥幼苗，用5%戊二醛溶液固定，抽氣至樣品沉到固定液中，再用鋨酸固定2小時，經乙醇系列脫水，C02臨界點干燥，噴金屬膜后用曰立S-570掃描電鏡觀察。顯微鏡觀察結果顯示在2(HlMAlCl3處理后轉基因擬南芥根尖基本都沒有染上紅色，而野生型擬南芥和陰性對照根尖呈藍紫色；50pMAl處理后，轉基因擬南芥根尖有淺紫色出現，染色程度要明顯低于野生型(深紅色)(圖4)。掃描電鏡觀察，結果顯示20|iMAlCl3處理后，轉基因擬南芥的根尖結構都沒有變化，和野生型沒有受鋁處理的擬南芥根尖細胞結構基本相同；50^iMAlCl3處理后，轉基因擬南芥根尖伸長區細胞出現部分凹陷，但破壞程度不嚴重，相比之下，野生型擬南芥和陰性對照在鋁離子處理下根尖細胞受到嚴重破壞，特別是根冠和伸長區，細胞大量凹陷(圖5)。實施例7轉基因擬南芥根伸長和丙二醛含量測定實驗對象陽性植株6株，每組3株；野生型植株2株，每組1株。野生型和轉基因擬南芥種子滅菌春化處理后，將生長7天的幼苗轉到分別含有20pM和50pMAlCl3的培養液中生長72小時。測量處理前后的根長，與正常生長情況下的根伸長對比，20和50iaMAlCl3處理后，野生型擬南芥根相對伸長分別減少35%和70%，而轉基因擬南芥根相對伸長分別減少10-25%和50-55%。稱取AlCl3處理過的擬南芥根部0.5g，加入lml10。/。TCA研磨至勻漿，加入lml0.6。/。TBA溶液，混勻物于95°。反應20分鐘，迅速冷卻后10000g離心5分鐘，吸上清，測定532、600、450nm波長下的消光度。MDA濃度(nmol/L"6.45(A532-A6。o)-0.56A450MDA含量(iamol/g"MDA濃度(iimol/L)x提取液體積(ml)/植物組織鮮重(g)在2(HiM和50(iMAlCl3處理下，與對照相比，野生型擬南芥根部MDA含量分別增加3.5倍和5.0倍，而轉基因擬南芥根部MDA含量分別是對照的2.0倍和3.5倍，要明顯低于野生型(圖6)。序列表說明SEQIDNo.l&2是Si69基因及其編碼的氨基酸序列；SEQIDNo.3&4是用于擴增S/卯cDNA全長的引物序列；SEQIDNo.5&6是擴增質粒并在其兩端引入酶切位點和標簽的引物序列；SEQIDNo.7&8是用于檢測S/69基因的引物。序列表〈110〉中國農業大學<120>利用植物鋁誘導表達基因增加植物抗鋁性的方法<130〉KHP09112101.5<160>8<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>765〈212>DNA<213〉谷子<220〉〈221〉CDS<222>(1)..(765)〈400〉1atgctggcggtgttcgatcccacggtggccaagtgcccggagggcetc48MetLeuAlaValPheAspProThrValAlaLysCysProGluGlyLeu151015cgcageccgctggtggccggcgcggccgetgccgcggccggcggcgtg96ArgSerProLeuValAlaGlyAlaAlaAlaAlaAlaAlaGlyGlyVal202530ggcgcgetcatgaagggcttctecgccteacacgacggcaccgtcacc144GlyAlaLeuMetLysGlyPheSerAlaSerHisA印GlyThrValThr354045gtcagectggggccctecggcgcgctggcgcacteggcggccaaccag192ValSerLeuGlyProSerGlyAlaLeuAlaHisSerAlaAlaAsnGin505560agecccetcgtccctaggttgtttggtgetgtgaatgacatettttgc240SerProLeuValProArgLeuPheGlyAlaValAsnAspliePheCys65707580ctgttccaagggaacattgagaacattgccaacctgaagcagcactac288LeuPheGinGlyAsnlieGluAsnlieAlaAsnLeuLysGinHisTyr859095ggcctgageaagacegccaacgaggtgactateetcategaggcctac336GlyLeuSerLysThrAlaAsnGluValThrlieLeulieGluAlaTyr100105110agaaccctgagggacaggggtcccgtccca_gccagecaggttgtgaga384ArgThrLeuArgAspArgGlyProValProAlaSerGinValValArg115120125gatcttagtggaaagttcgcattcatettgtatgacaccctgtegaag432AspLeuSerGlyLysPheAlaPhelieLeuTyrAspThrLeuSerLys130135140tecaccttcgttgetgetgacgetgatggcageatecccttcttctgg480SerThrPheValAlaAlaAspAlaAspGlySerlieProPhePheTrp145150155160ggcgtcgacteggaggaccacetcgtgttctctgacgatgetgggeta528GlyValAspSerGluAspHisLeuValPheSerAspAspAlaGlyLeu165170175etcaagaccggctgcggcaactegttcgcgccattccctaaaggttgc576LeuLysThrGlyCysGlyAsnSerPheAlaProPheProLysGlyCys180185190ttctacaccacctecggcgggctgcagagetacgagcacccgctgcac624PheTyrThrThrSerGlyGlyLeuGinSerTyrGluHisProLeuHis195200205gaggtc卿gcggtgccgcgcgtggscagecagggccsg3tgtgcggc672GluValLysAlaValProArgValAspSerGinGlyGinMetCysGly210215220tecaccttcaaggtcgacagegagaccaagaagaagcaggacgccage720<image>imageseeoriginaldocumentpage16</image>PheAlaPhelieLeuTyrAspThrLeuSerLys130135140SerThrPheValAlaAlaAspAlaAspGlySerlieProPhePheTrp145150155160GlyValAspSerGluAspHisLeuValPheSerAspAspAlaGlyLeu165170175LeuLysThrGlyCysGlyAsnSerPheAlaProPheProLysGlyCys180185190PheTyrThrThrSerGlyGlyLeuGinSerTyrGluHisProLeuHis195200205GluValLysAlaValProArgValAspSerGinGlyGinMetCysGly210215220SerThrPheLysValAspSerGluThrLysLysLysGinAspAlaSer225230235240lieProArgValGlySerAlaAlaAspTrpSerAsnGinPhe245250<210〉3<211>23<212〉DNA<213>人工序列<400〉3gcgagg卿gaggagggaagage23<210>4〈211〉22<212>DNA<213〉人工序列<400>4cgtctcagcggttcagcggata22<210>5<211>23〈212>DNA<213>人工序列<400>5cgggatccaagcgaggagagagg23〈210>6<211〉52<212>腿<213>人工序列<400>6gcgagctctcacttgtcgtcgtcgtccttatagtcgaactggttggaccagt52<210>7<211>20〈212〉醒<213>人工序列<400>7gccaacctgaagcagcacta20<210>8<211>20〈212>DNA<213>人工序列<400>8gcgt犯ggaacgtagc卿a2018權利要求1、Si69基因在增加植物抗鋁性中的應用。2、一種利用植物鋁誘導表達基因增加植物抗鋁性的方法，其特征在于，所述的基因為&砂。3、如權利要求2所述的方法，其特征在于，該方法使用含有5V砂基因的表達載體轉化目的植物。4、如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述表達載體的啟動子為組成型啟動子。5、如權利要求24任一項所述的方法，其特征在于，所述植物為雙子葉植物。6、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物為擬南芥。7、如權利要求24任一項所述的方法，其特征在于，所述表達載體為pBI121-Si69。全文摘要本發明提供了一種利用植物鋁誘導表達基因增加植物抗鋁性的方法，該方法利用Si69基因來提高植物的抗鋁性。研究表明，通過將Si69基因轉化植株，能夠顯著提高植株的抗鋁性。本發明方法對植物生物量的增加特別是農作物增產有重要意義。文檔編號A01H5/00GK101532029SQ20091008034公開日2009年9月16日申請日期2009年3月19日優先權日2009年3月19日發明者于靜娟,敖光明,倩趙,趙琳娜申請人:中國農業大學