專利名稱：：一種花藥絨氈層和花粉特異性高效啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，具體地說，涉及一種從玉米中分離到的花藥絨氈層和花粉特異性高效啟動子序列及其應用。從玉米基因組DNA中克隆得到的上述花藥絨氈層和花粉特異性啟動子，并與不同的同源、異源基因連接構建植物表達載體，轉化宿主植物，使轉基因植株劃分高效特異表達其下游基因的方法和應用。
背景技術：
：轉基因植物研究與開發的過程中發現，外源基因表達的時間，空間和表達量，往往是造成無法得到理想的轉基因植物和有效的研究基因作用機理的重要因素。轉錄水平的調控是植物基因表達調控的最重要的調控方式在。啟動子的驅動活性和特性直接決定了基因表達的時空特性以及表達量的多少。因此，對植物啟動子的克隆和功能分析非常重要。雜種優勢作為一種提高作物產量，改善作物品質，提高作物抗蟲、抗病、抗逆的手段已被廣泛的應用，并取得令人矚目的成就，以植物雄性不育為基礎的雜種優勢利用已成為許多作物的育種目標，在農業生產上發揮巨大的作用。但自然出現的雄性不育類型很少存在著周期長，不育基因來源單一等問題，而且恢復系的培育和后代的篩選上也存在著一定的不足。而利用基因工程創造雄性不育的策略為雜種優勢的利用克服了上述缺陷。主要利用花粉或花藥特異表達啟動子，驅動目標基因在花粉中特異表達，獲得雄性不育植株。例如Mariani等利用煙草花藥絨氈層特異啟動子TA29將核糖核酸基因導入煙草，結果核糖核酸酶特異表達能夠選擇性地破壞與花粉發育相關的一些器官或組織，阻斷花粉發育進程，導致植物雄性不育[MarianiC,BeuckeleerMD，TmettnerJ，LeemansJandRobertBG..Inductionofmalesterilityinplantsbyachimaericribonucleasegene.Nature1990.347:737-741]。Paul等[PaulW,HodgeR，SmarttS,Draper,JandScoottR.Theisolationandcharacterizationofthetapetum-specificv4raZ)z'cfo/w7JA9gene.PlantMol.Biol.1992.19:61l-622]利用擬南芥花藥絨站層特異性啟動子A9特異表達核糖核酸酶基因同樣獲得了雄性不育煙草植株。Hird等將與抗病性相關的P-l，3葡聚糖酶基因分別與擬南芥花粉發育早期啟動子A9，A3融合，轉化矮牽牛后獲得不同程度的雄性不育植株[Hird,D丄.，Worrall,W.,Hodge，R.,Smartt,S.,Paul,W.，Scott,R..Theanther-specificproteinencodedbytheBraM/ca"a/船andy4ra6zVio戸'sZ/za//a"aA6genedisplayssimilaritytobeta1,3-glucanases.PlantJ.1993.4:1023-1033]。目前對花藥特異基因的轉錄調控還知之甚少，花藥特異啟動子的獲得有助于深入理解花藥和花粉發育。玉米中已經獲得的花藥特異基因有10余個，大多數是花粉特異，同時在花粉和花藥中表達的基因很少。
發明內容本發明目的之一是提供一種花藥絨氈層和花粉特異表達啟動子序列，來自于玉米基因組DNA，在植物花藥絨氈層和花粉中特異表達。本發明的另一目的是提供一種驅動同、異源基因在花藥絨氈層和花粉中高效特異表達的新方法。本發明通過利用花藥特異的cDNA片段，篩選玉米基因組文庫，得到的核苷酸序列，稱之為pZmW7，長度為1971bp,為雙鏈核酸類型，其序列如序列表SEQIDNo.l所示。通過三大數據庫的檢索，未發現有相同或相似性較高的序列。生物信息學分析pZm^7序列，發現其具備真核啟動子的基本元件(TATAbox和CAATbox)和花藥特異表達的相關順式元件(GCbox，NTP303Qelement,LAT52Qelement)。本發明還提供了含有上述啟動子的重組表達載體。所述啟動子的下游可連接結構基因、調節基因、結構基因的反義基因、調節基因的反義基因或者能夠干擾內源基因表達的小RNA,用于驅動結構基因、調節基因、結構基因的反義基因、調節基因的反義基因、天然小RNA或人工合成的小RNA的表達。所述重組表達載體為植物重組表達載體。在一個優選的實施方式中，其表達盒是由/Zm4W啟動子和GUS(卩-葡糖醛酸酶基因)報告基因及來自胭脂堿合成酶(nos)基因的轉錄終止區域構成，選擇標記基因為新霉素磷酸轉移酶II(NPTII),所述的表達載體優選的是重組質粒pZm401::GUS。本發明將上述含有所述；Zm4W啟動子序列的重組表達載體轉化宿主細胞或宿主組織及其后代細胞，獲得外源基因在花藥絨氈層和花粉中高效驅動表達的基因工程化宿主細胞或宿主組織及其后代細胞。在一個優選的實施方式中，將含有所述pZm4W啟動子序列驅動的表達載體轉化煙草，獲得了GUS基因在花藥和絨氈層中高效驅動表達的轉基因植物。本發明所述的植物宿主細胞或宿主組織可以是植物花藥絨氈層和花粉細胞或植物藥絨氈層和花粉細胞本身，或它們的后代，蛋白質等組成成分或花藥和絨氈層特性已經改變的植物花藥和絨氈層細胞或植物花藥和絨氈層本身。本發明所述的植物組織中表達花藥和絨氈層特異性啟動子的方法，包括下述步驟(1)將含有本發明啟動子的植物表達載體導入植物細胞；(2)使所述的植物細胞生長成能夠結種子的成熟植物。本發明中所述的核酸序列還可以是還可以是所述核苷酸序列與其他啟動子融合序列。本發明中所述的其他外源基因是指任何一段核酸序列，并具有編碼某種蛋白質或其他活性物質功能，包括RNA或DNA序列，該序列與種子特異性啟動子正常情況不相結合。此核酸序列包括不同于啟動子植物種類的異源核酸序列，以及從相同于啟動子植物種類得到的同源核酸序列，但這些序列與野生型(非轉基因)植物的啟動子無關。本發明中所述的表達載體是指現有技術中已知的、能夠在植物中進行表達的任何一種載體，如pBI121等。本發明中所述的轉化技術是指已知的、能夠將外源基因導入植物細胞或植物組織的任何一種植物轉化方法，如農桿菌介導法等。本發明中所述的宿主細胞或宿主組織及后代細胞是指所有植物細胞或植物組織或由這些細胞或組織發育成熟的整株植株(包括種子)。術語"核酸序列"指含有天然存在的堿基，糖和糖之間(支鏈)的鍵的核苷酸或核苷酸單體的序列。該序列也包括含有發揮相似功能的非天然存在的單體或其部分被修飾或取代的序列。術語"花藥絨氈層和花粉特異性啟動子"是指在啟動子控制下表達的基因在有或沒有基本表達的植物花藥的絨氈層和花粉中優先表達。本發明找到了玉米花藥絨氈層和花粉特異高效表達啟動子序列，并對這一啟動子的花藥絨氈層和花粉高效特異活性進行了功能驗證。將所述的啟動子序列連接異源或同源基因后，轉化到植物中可使異源或同源基因在植物花藥絨氈層和花粉中高效特異表達，避免了目的基因在其他部位持續表達所帶的不利影響。本發明提供了一種利用所述核苷酸序列驅動目的基因在植物花藥絨氈層和花粉中高效特異表達的新方法，在植物的遺傳改良，雄性不育的創造和轉基因生物安全性研究方面具有重大的應用前景。圖1顯示的是來源于玉米的花藥絨氈層和花粉特異表達啟動子序列pZm4W的相關啟動子元件。圖2顯示的是由/7Zm4W驅動的植物表達載體的構建過程。圖3顯示的是植物表達載體Zm401::GUS的酶切和PCR鑒定圖，其中泳道1~4依次為Sacl，i^I+Jftal，五coRI,Wal的酶切電泳，6為PCR產物(1535f/r),5&7為X/歷"din+五coRI。圖4顯示的是不同時期的再生煙草，其中A&B抗性芽形成，C、D&E煙草植株再生，F轉化煙草植株開花。圖5顯示的是部分轉基因煙草植株的PCR檢測結果，A:Zm^W啟動子的PCR檢測，B:g^基因的PCR檢測，2&17:陽性對照，3&16:陰性對照(wildtype),1&18:X/歷mffll+五coRI,其他為不同轉化植株。圖6顯示的是部分轉啟動子報告基因融合載體轉基因煙草的Southern雜交檢測，其中1-5:不同轉化植株楊蓓，6:野生型，7:質粒對照，8:入編dlII+五coRI。圖7顯示的是Zm401::GUS轉基因煙草根、莖、葉、花藥和花粉的組織化學分析，其中A:根；B:莖；C:葉；D:轉基因花藥的GUS染色；E:成熟花粉的GUS染色，放大倍數40x,標尺30pm。圖8顯示的是Zm401::GUS轉基因煙草花藥的GUS組織化學分析，其中A:轉基因花藥截面，B:野生型對照截面.放大倍數200x,標尺=50具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1.玉米花藥絨氈層和花粉特異性啟動子序列/iZ附4W的克隆以從玉米成熟花粉cDNA文庫中分離得到了花粉特異性表達的cDNA克隆Zm柳(682bp)(Lietal.，2001)為探針(其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示)篩選玉米基因組文庫(Cat.#FL1032D,Lot#5443,Clontech,PaloAlto,CA,USA)，得到了Zm卯7基因的基因組克隆pGZM401。序列分析該基因組DNA全長6.0kb，其中5，端1-2000(序列起始處堿基定位l)為推斷的啟動子區段，該區段具有RNA聚合酶II結合的順式作用元件TATAbox(1844-1849)和CAATbox(1720-1723)，此外還有花粉特異表達的順式元件GCbox(1496-1500)，能夠調節基因表達量的6bpQ因子(NTP303Qelement,AAATGA,No.801-806和LAT52Qelement,TGGTTA，No.1266-1271)(圖1)。實施例2.玉米花藥絨氈層和花粉特異性啟動子序列/;Zm^W的分離設計并合成如下兩條引物，為以后分離和構建的需要，在兩個引物的5'端分別加入了限制性內切酶//z'"din位點和限制性內切酶力"I位點引物1:5，CCA4GCTrCTGCAGACATAGCTCTCGAC3'引物2:5，CATCAAACACTTGGCCTATTACTAGCC3'以質粒DNApGZM401為模板，進行PCR反應，反應體系如下反應組分加入量緩沖液(10X)(含20mmol/LMgCl2)2，dNTP(1Ommol/L)引物1(lOpmol/L)0.5^il引物2(10pmol/L)0.5^1Taq(2.5u/|il)0.5)xlH2019.5^1模板質粒(0.2嗎/jil)0，總體積25%1擴增條件95。C10min;95。Clmin、58。Clmin、72。C2min,共30個循環；72。C10min,擴增得到1971bp的DNA片段(如SEQIDNo.l所示)。用DNA膠回收試劑盒(天為時代生物公司)回收，把回收片段亞克隆到測序載體pGEN-3zf(+)(Promega)中，連接產物轉化到用CaCb法處理的大腸桿菌DH5a感受態細胞，在含有氨節青霉素(終濃度100嗎/ml)的LB固體培養基上培養過夜；挑取平板上生長的白色菌落，接入含氨節青霉素(終濃度100昭/ml)的LB液體培養基培養過夜，離心收集菌體按堿裂解法[Sambroook，etal.，1989,MolecularCloning,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,p19-21]提取質粒，經限制性內切酶歷"am和范ai雙辦切和PCR擴增鑒定陽性克隆，命名重組質粒為p401pro3Z。實施例3.植物表達載體pZm401::GUS的構建如附圖2所示，用堿裂解法提取p401pro3Z質粒，經過5^/I酶切，Klenow補平，再用^YZ^I酶切，得到/ZwW/啟動子片段，與經過/f/"d111酶切，Klenow補平，再用酶切的植物表達載體pBI121(ClonTech)的大片段相連，然后將連接產物轉化到用CaCl2法處理的大腸桿菌DH5ot感受態細胞中，在含有卡那霉素(終濃度100嗎/ml)的LB固體培養基上培養過夜；挑取平板上生長的白色菌落，接入含卡那霉素(終濃度10(Vg/ml)的LB液體培養基培養過夜，離心收集菌體按堿裂解法提取質粒，經限制性內切酶酶切和PCR鑒定正確(圖3)。實施例4.pZm401::GUS表達載體轉化煙草利用凍融發將重組的植物表達載體pZm401::GUS轉入根癌農桿菌LBA4404,轉化方法參照Hofen等[HofenR，WillmitzerL，Storageofcompetentcellsfor^gro6ac&r/wmtransformation.I^ucleicAcidsResearch,1988.16,9877]。煙草的轉化參照Horsch等[HorschRB,FryJE，HoffmanN.Asimpleandgeneralmethodfortransferringgenesintoplants.Science,1985.227:1229-1231]。轉化受體為煙草(Mco"a"ato6acwwcvSamsun)。將過夜培養的農桿菌LBA4404(含有pZm401::GUS)菌液，按照1:100比例轉接至YEB液體培養基中，振蕩培養至OD綱值約0.6—0.8左右；收集菌體后，用滲入緩沖液懸浮菌體，稀釋到OD6QQ值約為0.6左右，先將無菌的煙草葉盤與轉入pZm401::GUS質粒的農桿菌共同孵育。十分鐘后，將葉盤轉移到MS基本培養基黑暗條件下共培養3d。然后將葉片轉移至MS分化培養基(3mg.r16-BA,0.2mgT1NAA，100mg.r1Kan，500mg.r1Cb)培養(光周期16h/8h),約四周后將抗性再生苗從外植體上切下，轉到MS生根培養基(100mg'r1Kan,500mg.r1Cb)誘導生根(光周期16h/8h)，約兩周后即可生出細嫩的抗性根。將生根良好的再生植株轉移到溫室中，經練苗后移栽到小花盆中(營養土:跖石=1:1)(附圖4)。實施例5.轉基因煙草的分子檢測PCR檢測使用植物基因組DNA少量提取方法提取再生煙草植株葉片DNA,利用Zm^W啟動子內部引物和g^引物進行PCR擴增。結果表明，攜帶有外源基因的轉基因煙草可以擴增出與轉化質粒擴增產物大小一9致的目的條帶，而未轉化植株則沒有相應大小的產物(圖5)。Southern雜交檢測對于PCR檢測結果為陽性的植株，進行基因組Southern雜交檢測。取30嗎煙草基因組DNA,并用限制性內切酶州'miIII徹底酶切，以[a-"P]標記的2.0kb的，+腿片段(2.0kb)作為探針，進行Southern雜交。雜交結果表明，目標片段以不同位點整合入煙草基因組中(圖6)。實施例6轉基因煙草的GUS活性的組織化學檢測GUS基因活性的組織化學染色分析方法依據Bradford等人[BradfordHM.Arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding[J].AnalBiochem.,1976,72:248-254.]。將收集轉基因煙草的不同組織材料與含底物X-Gluc(X-Gluc染液組成1.0mg/|ilX-Gluc;50mmol/L磷酸緩沖液，pH7.0;10mmoi/LEDTA,pH8.0;0.05mmol/L鐵氰化鉀；0.05mmol/L亞鐵氰化鉀；甲醇，終濃度20%;0.1%TritonX-100.)的染色反應液于37°C保溫6-8h，進行組織化學染色觀察，葉片等綠色組織用95%乙醇脫色后觀察。結果發現，與對照株相比，轉基因煙草的根、莖、葉均未有藍色出現，僅有轉基因煙草的花藥和成熟花粉有藍色出現，如附圖7。將GUS染色后的轉基因煙草花藥經抽氣后固定在FAA固定液中，制備石蠟切片(厚度10imi),在光鏡下進行觀察。結果表明ZmW/啟動子可以驅動報告基因在花粉，絨氈層和藥隔組織中表達。另外在藥室內壁也有微弱表達。野生型煙草的花藥中未觀察到報告基因的表達(附圖8)。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>agagtacctctgtcaggtaccaaactttgggttttaaaggataaagacgagaccgggcgg1500gtgccttgcacgagaaggaagtctcggtgtagtgtctccgtctgagtcgtttaaggatcg1560agccgatgtaggcttgatgatcaaggaccttttaactggccacatgcctcatcatgtgta1620agctttgcctcgatcggacccaatactaga肌agctaccacgcaatgggagtgg,gat1680ggCg卿gt3gC3t3t3CCCtccgtggcaactatgccctc1740ggttggcgtgaacccattctagtcttgaga肌tccgggtgtgagttgacatatgc犯gg31800catatgttgtgtggttggsgatccccagctgggtatt犯tcaattcgaat1860cgatgttacttctcaaacatg卿acttggtcactgacctacacgtagcaacaagtg犯c1920gctsgtaataggccaagtgtttgatctagat1971<210〉2<211〉633〈212〉DNA〈213〉ZeamaysL<400〉2cgttgctgtcggstgtgg肌tcgtagacccgagggatatgaacggacttgtggettggctg60accacggcgcgatgtctcacggtggtgttcttggccgatt120gagctatggtggat肌tcgggagcgaggagtggtgctctgggtgcgtaaca卿aggcgg180ggcgtcaatttatagggattgsccactggtgctacgaatttgggca卿t240tg3gCtt3CggCggtg3gtgggtgagtcaccggagtatggCt3CCgtggt300gcaaggtctcgggtggt犯ctggctatcactcacgactcattgtgacgtg360cgatggtgtggcgcgaccgaggt肌acggcggccaccatggcgacggtcgcacggccacg420gcgccgggcaagtgggtacgacgaggc卿cccaatcca^cccccttctgatcttttcac480tcctgcggtaatatccttcctgaaxxaagcacg犯tcacagcggccagcgcgaatcctca540tgcggagattaccgacgagctcatttaccagcctgacagagcaatttgaggagctttgtt600cttcggttttcatgtgacgaeiccgeicagcaacg633<210〉3〈211>28〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉3cc肌gcttctgcagacatagctctcgac28<210〉4<211>27〈212〉DNA<213〉人工序列<400〉4catcaaacacttggcctattactagcc271權利要求1、一種花粉和花藥絨氈層特異性啟動子，其特征在于，所述啟動子的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2、含有權利要求1所述啟動子的表達載體。3、含有權利要求2所述表達載體的植物宿主細胞或植物宿主組織。4、如權利要求3所述的植物宿主細胞或植物宿主組織，其特征在于所述植物宿主細胞為植物花藥絨氈層細胞或花粉細胞，所述植物宿主組織為植物花藥絨氈層或花粉本身。5、權利要求l所述啟動子或權利要求2所述表達載體在制備轉基因植物中的應用。6、如權利要求5所述的應用，其特征在于所述的植物為雙子葉植物或單子葉植物。7、如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的植物為煙草。8、如權利要求5所述的應用，其特征在于，用權利要求l所述啟動子或權利要求2所述表達載體改造花粉育性。9、權利要求1所述啟動子或權利要求2所述表達載體在改造植物安全性中的應用。全文摘要本發明提供了花粉和花藥絨氈層特異性啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。該啟動子序列是通過對玉米基因組文庫篩選，從玉米基因組中克隆得到的，其能驅動目的基因在花藥絨氈層和花粉中具有特異性表達。本發明包括利用該啟動子序列來創造雄性不育的植物基因工程方法，更具體的說，將所述啟動子下游銜接異源或同源基因，并構建植物表達載體，轉化宿主植物，該啟動子序列能夠驅動其下游基因在其花藥絨氈層和花粉中高效特異表達目的蛋白，實現創造植物雄性不育，或者改造轉基因植物的安全性。文檔編號A01H5/00GK101532015SQ20091008035公開日2009年9月16日申請日期2009年3月19日優先權日2009年3月19日發明者于靜娟,劉俊起,敖光明,李成霞,王冬雪,倩趙申請人:中國農業大學