專利名稱：一種非程序細胞凍存液的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞凍存液，特別涉及一種非程序細胞凍存液。
背景技術：
細胞，特別是干細胞等高價值的細胞，具有潛在的醫用價值等其他價值，細胞保存 技術是實現這些價值的基礎。常用的細胞保存方法有培養保存和凍存。培養保存，耗時耗力，程序繁瑣，在培養 的過程中，特別是長期繼代培養時，細胞容易發生變異，細胞特性喪失，失去保存價值。因 此，培養保存一般應用于易于培養，不易發生變異的細胞中，如部分瘤細胞。細胞凍存即將細胞置于低溫環境下保存，以使細胞暫時脫離生長狀態，保存其細 胞特性。這樣保存的成本較低，可以在需要時將細胞復蘇培養。與些同時，也避免了培養保 存中因細胞污染而導致的細胞品種損失?，F有的細胞凍存液，主要由DMS0、血清以及細胞培養液組成，細胞培養液一般作為 溶劑。這種凍存液一般為即用型凍存液，需要現配現用，批次差異大，保持期短，保存效果不穩定。此外，現有凍存液的凍存程序復雜，需要使用昂貴的專用凍存儀器進行程序性降 溫，整個凍存過程耗時長達3 4小時，以保證凍存細胞的復蘇率。這種凍存操作復雜、處 理量小，凍存成本較高，不能滿足大規模細胞快速凍存的需要。

發明內容
本發明的目的在于提供一種新型的細胞凍存液。本發明所采取的技術方案是一種非程序細胞凍存液，含有細胞膜保護劑1. 0 28w/v%、滲透性細胞膜內保護 劑1. 0 18w/v%、細胞沉降穩定劑3. 0 28%，余量為溶劑。優選的，凍存液中還添加有0. 1 0. 7w/v%的抗氧化劑。優選的，凍存液中還添加有0. 2 1. 07w/v%的細胞營養劑。本發明的細胞凍存液，對細胞保護效果好，添加凍存液后，可直接將細胞放 入-80°C冰箱凍存，無需復雜的程序凍存，大大縮短的細胞凍存時間，提高了凍存效率，極為 適用于大量細胞的凍存。凍存后的細胞復蘇率高，復蘇后細胞的生長和分化正常。本發明的細胞凍存液，成分穩定，保質期長。本發明的細胞凍存液，無需另行配制或稀釋，批次間穩定性好。


圖1是SD大鼠間充質干細胞MSCs復蘇后的生長曲線圖；圖2是未誘導的SD大鼠MSCs細胞圖；圖3是本發明細胞凍存液凍存的SD大鼠MSCs復蘇后，成骨誘導28d的細胞圖4是常規細胞凍存液程序凍存的SD大鼠MSCs復蘇后，成骨誘導28d的細胞圖；圖5是常規細胞凍存液非程序凍存的SD大鼠MSCs復蘇后，成骨誘導28d的細胞 圖；圖6是本發明細胞凍存液凍存的SD大鼠MSCs復蘇后，成脂誘導20d的細胞圖；圖7是常規細胞凍存液程序凍存的SD大鼠MSCs復蘇后，成脂誘導20d的細胞圖；圖8是常規細胞凍存液非程序凍存的SD大鼠MSCs復蘇后，成脂誘導20d的細胞 圖。
具體實施例方式本發明中使用的細胞膜保護劑、滲透性細胞膜內保護劑、細胞沉降穩定劑，既可以 單獨使用，也有可以根據需要混合使用。本發明細胞凍存液中使用的溶劑，可為各種適用于細胞培養的溶劑，一般為血清， 特別是新生牛血清。本發明細胞凍存液中使用的滲透性細胞膜內保護劑，包括二甲基亞砜(DMSO)、丙
二醇、丙三醇等。本發明細胞凍存液中使用的細胞沉降穩定劑，包括甲基纖維素、羥乙基淀粉、糊 精、可溶性淀粉，用以防止或延緩細胞在凍存過程中的沉降，防止細胞互相擠壓，影響細胞 凍存效果。本發明細胞凍存液中使用的抗氧化劑，為常規的抗氧化劑，包括維生素C、谷胱甘 肽等，抗氧化劑既可以單獨使用，也可以混用。本領域的技術人員可以根據需要選擇其他的 抗氧化劑。本發明細胞凍存液中使用的細胞營養劑，為常規的細胞營養劑，包括谷氨酰胺、丙 酮酸鈉等，用以補充細胞代謝時消耗的部分能量。細胞營養劑既可以單獨使用，也可以混 用。本領域的技術人員可以根據需要選擇其他的細胞營養劑。一種非程序細胞凍存液，含有細胞膜保護劑1. 0 28w/v%、滲透性細胞膜內保護 劑1. 0 18w/v%、細胞沉降穩定劑3. 0 28%，余量為溶劑。優選的，凍存液中還添加有0. 1 0. 7w/v%的抗氧化劑。優選的，凍存液中還添加有0. 2 1. 0 八％的細胞營養劑。細胞膜保護劑包括非還原性雙糖、多糖、糖酐。其中，非還原性雙糖包括海藻糖、 蔗糖；多糖包括棉子糖、木糖、潘糖；糖酐包括低分子糖酐-40、中分子糖酐-70、高分子糖 酐-500。細胞沉降穩定劑包括甲基纖維素、羥乙基淀粉、糊精、可溶性淀粉滲透性細胞膜內保護劑包括DMS0、丙二醇、丙三醇抗氧化劑包括維生素C、谷胱甘肽。下面結合實施例，進一步說明本發明。以下實施例中，如無特別說明，百分比均指。實施例1細胞凍存液的組成如下細胞膜保護劑1%，由0. 4%的棉子糖、0. 6%的中分子糖酐-70組成，
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滲透性細胞膜內保護劑5 %，由DMSO組成，細胞沉降穩定劑15%，由甲基纖維素500CP組成，抗氧化劑0. 2%，由0. 03%的維生素C、0. 17%的谷胱甘肽組成，細胞營養劑0. 3%，由0. 2%的谷氨酰胺、0. 的丙酮酸鈉組成，新生牛血清，余量。實施例2細胞凍存液的組成如下細胞膜保護劑7%，由海藻糖組成，滲透性細胞膜內保護劑9%，由6%的丙二醇、3%的丙三醇組成，細胞沉降穩定劑28%，由20%的甲基纖維素400CP、8%的糊精組成，抗氧化劑0.4%，由維生素C組成，細胞營養劑1. 0%，由0. 7%的谷氨酰胺、0. 3%的丙酮酸鈉組成，新生牛血清，余量。實施例3細胞凍存液的組成如下細胞膜保護劑28%，由10%的蔗糖、14%的潘糖、4%的低分子糖酐-40組成，滲透性細胞膜內保護劑1%，由丙二醇組成，細胞沉降穩定劑9%，由羥乙基淀粉組成，抗氧化劑0. 1 %，由谷胱甘肽組成，細胞營養劑0. 2%，由丙酮酸鈉組成，新生牛血清，余量。實施例4細胞凍存液的組成如下細胞膜保護劑21%，由17%的木糖、4%的高分子糖酐-500組成，滲透性細胞膜內保護劑12%，由丙二醇、丙三醇各半組成，細胞沉降穩定劑14%，由5%的甲基纖維素1500CP、9%的可溶性淀粉組成，抗氧化劑0. 7%，由0. 2%的維生素C、0. 5%的谷胱甘肽組成，細胞營養劑0. 8%，由谷氨酰胺、丙酮酸鈉各半組成，新生牛血清，余量。實施例5細胞凍存液的組成如下細胞膜保護劑11%，由7%的海藻糖、4%的棉子糖組成，滲透性細胞膜內保護劑18%，由2%的DMS0、16%的丙二醇組成，細胞沉降穩定劑14%，由8%的羥乙基淀粉、6%的糊精組成，抗氧化劑0.7%，由維生素C組成，細胞營養劑0.5%，由0.4%的谷氨酰胺、0. 的丙酮酸鈉組成，新生牛血清，余量。實施例6細胞凍存液的組成如下
細胞膜保護劑17%，由5%的棉子糖、12%的木糖組成，滲透性細胞膜內保護劑15%，由DMS0、丙二醇、丙三醇各5%組成，細胞沉降穩定劑18%，由12%的甲基纖維素、6%的可溶性淀粉組成，抗氧化劑0.5%，由維生素C組成，細胞營養劑0. 7%，由丙酮酸鈉組成，新生牛血清，余量。實施例7細胞凍存液的組成如下細胞膜保護劑23%，由7%海藻糖、12%的低分子糖酐_40、5%的木糖組成，滲透性細胞膜內保護劑11 %，由DMSO組成，細胞沉降穩定劑3%，由甲基纖維素4000CP組成，抗氧化劑0. 5%，由谷胱甘肽組成，細胞營養劑0.5%，由0. 谷氨酰胺、0.4%丙酮酸鈉組成，新生牛血清，余量。使用不同配比細胞膜保護劑的細胞凍存液，非程序性凍存SD大鼠間充質干細胞 MSCs，檢測其復蘇率，結果如表1所示。表1、細胞膜保護劑配比_細胞復蘇率比較表
權利要求
一種非程序細胞凍存液，含有細胞膜保護劑1.0～28w/v％、滲透性細胞膜內保護劑1.0～18w/v％、細胞沉降穩定劑3.0～28w/v％，余量為溶劑。
2.根據權利要求1所述的一種非程序細胞凍存液，其特征在于所述凍存液中還添加 有0. 1 0. 7w/v%的抗氧化劑。
3.根據權利要求1所述的一種非程序細胞凍存液，其特征在于所述凍存液中還添加 有細胞營養劑0.2 1.0w/v%。
4.根據權利要求1所述的一種非程序細胞凍存液，其特征在于細胞膜保護劑包括非 還原性雙糖、多糖、糖酐。
5.根據權利要求4所述的一種非程序細胞凍存液，其特征在于非還原性雙糖包括海 藻糖、蔗糖。
6.根據權利要求1所述的一種非程序細胞凍存液，其特征在于多糖包括棉子糖、木糖、潘糖。
7.根據權利要求1所述的一種非程序細胞凍存液，其特征在于糖酐包括低分子糖 酐-40、中分子糖酐-70、高分子糖酐-500。
8.根據權利要求1所述的一種非程序細胞凍存液，其特征在于細胞沉降穩定劑包括 甲基纖維素、羥乙基淀粉、糊精、可溶性淀粉。
9.根據權利要求1所述的一種非程序細胞凍存液，其特征在于滲透性細胞膜內保護 劑包括二甲基亞砜(DMS0)、丙二醇、丙三醇。
10.根據權利要求2所述的一種非程序細胞凍存液，其特征在于抗氧化劑包括維生素 C、谷胱甘肽。
全文摘要
本發明公開了一種非程序細胞凍存液，含有細胞膜保護劑1.0～28w/v％、滲透性細胞膜內保護劑1.0～18w/v％、細胞沉降穩定劑3.0～28％，余量為溶劑。本發明的細胞凍存液，對細胞保護效果好，添加凍存液后，可直接將細胞放入-80℃冰箱凍存，無需復雜的程序凍存，大大縮短的細胞凍存時間，提高了凍存效率，極為適用于大量細胞的凍存。凍存后的細胞復蘇率高，復蘇后細胞的生長和分化正常；細胞凍存液成分穩定，保質期長；使用前無需另行配制或稀釋，批次間穩定性好。
文檔編號A01N1/02GK101983562SQ201010184600
公開日2011年3月9日 申請日期2010年5月26日 優先權日2010年5月26日
發明者羅晴燕, 莫筱縈, 鄭敦武, 陳嘉慧, 魏寶麗 申請人:賽業(廣州)生物科技有限公司