專利名稱：：紫背天葵葉片組織培養的方法及其專用培養基的制作方法
技術領域：
：本發明涉及植物組織培養領域，特別涉及一種紫背天葵葉片組織培養的方法及其專用培養基。
背景技術：
：紫背天葵，學名GynurabicolorDC，別名紫背菜、兩色三七草、紅背菜、觀音菜，為菊科三七草屬多年生宿根草本植物。其整個植株呈紫綠色，葉長卵型，邊緣有鋸齒，葉面綠色略帶紫，背面紫紅色具蠟質，有光澤，是有藥用價值的野生蔬菜。紫背天葵作為一種值得推廣的高營養保健蔬菜，含有較為豐富全面的營養成分，除一般蔬菜所具有的營養物質外，還富含可提高動物抗病能力，并對惡性生長細胞具有中度抗性的黃酮類化合物及鐵、錳、鋅等對人體有益的微量元素。在我國南方一些地區更是把紫背天葵作為一種補血的“良藥”，是產后婦女食用的主要蔬菜之一。同時它也是很好的天然紅色素原料，這種色素就是花青素。隨著眾多的合成色素被發現有毒害作用以及人們保健意識的增強，傳統工業合成色素的應用范圍逐步縮小，前期影響廣泛的“蘇丹紅”事件使人們談“紅”色變；植物體花青素作為一種天然色素，安全、無毒、資源豐富，具有相當的營養和藥理作用，對人類健康影響廣泛，在食品、化妝品以及醫藥等方面有著巨大的應用潛力。紫背天葵可用扦插及種子繁殖，但主要采用扦插繁殖。但是長期使用無性繁殖易感染病菌，需用種子繁殖更新，或用組培技術脫毒重新育苗。組培技術具有繁殖速度快、不受季節影響等優點，同時建立高效的再生體系也是植物遺傳轉化的前提，利用轉基因技術可以豐富種質資源，提高作物的抗逆性或改良其品質。對現有文獻進行檢索發現，林碧英、林義章在《植物生理學通訊》2003年第39卷第4期346頁發表了題為“紫背天葵的組織培養和快速繁殖”；陳銀龍等在《現代農業科技》2006年7月刊發表了“紫背天葵的組培快繁技術”，但兩者所采用的外植體均為在帶芽莖段，屬于快繁技術，并不屬于經典組織培養方法。遺傳轉化過程中，以葉片等為外植體的經典組培方法，要比以帶芽莖段為外植體的快繁方法更有利于減少產生嵌合體，假陽性的現象。迄今為止，國內外尚未有紫背天葵以葉片為外植體的組織培養的報道。
發明內容本發明的目的在于提供一種紫背天葵葉片誘導愈傷組織的專用培養基。本發明的紫背天葵葉片的愈傷組織誘導培養基，是在MS基本培養液中添加如下物質得到的固體培養基2，4-D、6_BA、碳源和凝膠劑；上述愈傷組織誘導培養基中2，4-D的終濃度是l-3mg/L、6-BA終濃度是0.2_lmg/L；上述愈傷組織誘導培養基中的MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。表1.MS基本培養液的溶質<table>tableseeoriginaldocumentpage4</table>上述紫背天葵葉片的愈傷組織誘導培養基中2，4-D的終濃度優選是2mg/L，6_BA的終濃度優選是0.5mg/L。上述紫背天葵葉片的愈傷組織誘導培養基中凝膠劑可以是瓊脂、卡拉膠或Gelrite等，優選可是瓊脂；所述瓊脂的終濃度是7_9g/L；愈傷組織誘導培養基中的碳源可以是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖等，優選為蔗糖，蔗糖的終濃度是20-40g/L。本發明的另一目的在于克服上述現有技術的不足，提供一種以紫背天葵葉片為外植體進行生產紫背天葵再生苗的方法。本發明的生產紫背天葵再生苗的方法，包括以下步驟1)將紫背天葵葉片置于上述愈傷組織誘導培養基上培養，誘導得到愈傷組織；2)將步驟1)得到的愈傷組織在分化培養基上培養，獲得叢生芽；3)將步驟2)中獲得的叢生芽進行誘導生根培養得到再生苗。上述步驟1)、步驟2)和步驟3)中培養的培養條件均可為溫度為24-27°C，光照時間為14-18小時/天，光照強度為2000-30001UX。上述步驟2)中，分化培養基是在MS基本培養液中添加噻苯隆(TDZ，N_苯基-N'-1，2，3-噻二唑-5脲)48而3、碳源和凝膠劑得到的固體培養基；其中噻苯隆(TDZ)的終濃度為0.2-0.8mg/L,AgNO3的終濃度為2_6mg/L；MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。上述分化培養基中噻苯隆(TDZ)的終濃度優選為0.5mg/L,AgNO3的終濃度優選為4mg/L。本發明方法還在步驟2)和步驟3)之間還包括一叢生芽的伸長培養，所述伸長培養是將步驟2)得到的叢生芽接種到伸長培養基上培養，得到伸長的叢生芽。上述伸長培養的培養條件與步驟1)、步驟2)和步驟3)的培養條件一致。上述伸長培養基是在MS基本培養液中添加噻苯隆(TDZ)、AgNO3、碳源和凝膠劑得到的固體培養基；其中噻苯隆(TDZ)的終濃度為0.2mg/L,AgNO3的終濃度為4mg/L；MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。上述誘導生根培養是在生根培養基中進行的，所采用的生根培養基是在MS基本培養液中添加碳源和凝膠劑得到的固體培養基，MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示ο本發明的方法還包括預處理步驟，該預處理步驟是將紫背天葵葉片置于70%(ν/ν)的酒精里滅菌20-40秒，用無菌水沖洗，再用滴加了吐溫的0.1%(ν/ν)的升汞浸泡6-10分鐘后，用無菌水沖洗干凈。本發明中所采用的培養基(即分化培養基、伸長培養基和生根培養基)中的碳源可為葡萄糖、麥芽糖或蔗糖等，優選為蔗糖，蔗糖的用量為在培養基中的終濃度為20-40g/L；凝膠劑可為瓊脂、卡拉膠或Gelrite等，優選是瓊脂，瓊脂的用量可為在培養基中的終濃度為7-9g/L；凝膠劑的用量以能達到培養基的硬度為基礎，可適當調整用里。本發明的誘導愈傷組織的培養基可有效地誘導紫背天葵葉片形成愈傷組織，由實施例1可知，其愈傷組織的誘導率達到了100%，愈傷組織的分化率達69%以上，分化得到叢生芽的增殖倍數平均為7.12，生根培養的生根率最高可達到100%。本發明第一次建立紫背天葵的經典組培體系，以紫背天葵葉片作為外植體進行繁殖，取材方便，來源充足，可高頻率的誘導出大量的紫背天葵再生植株，產生的植株易于生根，再生植株成活率高，最高可達95%以上。而且具有再生植株變異性小，遺傳穩定性高，若進行遺傳轉化，比以腋芽為外植體的再生系統的有假陽性率低的優點。本發明為擴大紫背天葵繁殖系數、種質保存及其遺傳轉化奠定了良好的基礎。圖1為本發明實施例1紫背天葵葉片外植體的切割方法。圖2為本發明實施例1誘導的愈傷組織。圖3為本發明實施例1由愈傷組織分化的不定芽。圖4為本發明實施例1紫背天葵再生苗。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1、紫背天葵再生苗的獲得及其統計觀察1、愈傷組織的制備1)外植體的預處理選取幼嫩平展的紫背天葵(品種為紅葉，購于北京市農林科學院蔬菜中心)葉片為外植體，先在70%(體積百分比)的酒精里滅菌30s，用無菌水沖洗5次，再用滴加了吐溫的0.(體積百分比)的升汞浸泡8min，然后用無菌水沖洗干凈。2)愈傷組織的獲得將上述步驟1)中預處理好的紫背天葵葉片剪成IcmXIcm左右(切割方法如圖1所示)的小塊，葉背朝下的接種在紫背天葵葉片誘導愈傷組織的培養基上，在溫度為26°C，光照強度為25001ux，光照時間為16小時/天的培養條件下培養約12天，得到愈傷組織(如圖2所示)。上述紫背天葵葉片誘導愈傷組織的培養基是在MS基本培養液中添加2，4_D、6-BA、蔗糖和瓊脂得到的固體培養基；其中各物質的終濃度為2，4-D為2mg/L，6-BA為0.5mg/L，蔗糖為30g/L，瓊脂為8g/L；培養基的pH為5.9，MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。3)統計觀察實驗重復3次，統計觀察上述步驟2)中愈傷組織的誘導情況，實驗結果見下表2。從表2可以看出，紫背天葵葉片在培養12天左右開始出現愈傷組織，培養20天后愈傷組織的誘導率可達到100%。表2.培養20天后愈傷組織的誘導率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</table>2、愈傷組織分化叢生芽及統計觀察1)叢生芽的分化將上述步驟1中步驟2)得到的愈傷組織培養生長40天時，轉接到分化培養基上，在溫度為26°C，光照強度為25001UX，光照時間為16小時/天的培養條件下培養約42天時開始出現芽點，分化得到叢生芽(如圖3所示)。在分化誘導叢生芽的過程中為得到所需數量的叢生芽，可每30天在相同培養基(即本實施例的分化培養基)上繼代一次，也可根據各愈傷組織分化情況及時進行繼代。上述分化培養基是在MS基本培養液中添加TDZ(噻苯隆，購自北京綠生源科技有限公司)、AgNO3、蔗糖和瓊脂得到的固體培養基；其中TDZ的終濃度為0.5mg/L,AgNO3的終濃度為4mg/L，蔗糖的終濃度為30g/L，瓊脂的終濃度為8g/L；培養基的pH為5.9，MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。2)統計觀察實驗重復3次，統計觀察上述步驟2中步驟1)叢生芽的分化情況。愈傷組織培養約42天時開始出現芽點，但其中只有70%的外植體能分化，這些外植體上可陸續分化出8-15不定芽，培養60天后，統計實驗結果見下表3，從表3可以看出，愈傷組織的分化率可達到69%以上，分化得到叢生芽的增殖倍數平均為7.12。表3.分化培養的分化率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</table>3、伸長培養將步驟2中步驟1)誘導出的叢生芽進行分割，每2-5株一叢，轉接到伸長培養基上，在溫度為26°C，光照強度為25001UX，光照時間為16小時/天的培養條件下，誘導培養30天，得到伸長的叢生芽。上述伸長培養基是在MS基本培養液中添加TDZ(噻苯隆，購自北京綠生源科技有限公司)、AgNO3、蔗糖和瓊脂得到的固體培養基；其中TDZ的終濃度為0.2mg/L,AgNO3的終濃度為4mg/L，蔗糖的終濃度為30g/L，瓊脂的終濃度為8g/L，培養基的pH為5.9，MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。4、生根培養及統計觀察1)生根培養得到再生苗將上述步驟3中得到的伸長至1.5-2cm的叢生芽植株分離成單株，轉到生根培養基中，在溫度為26°C，光照強度為25001UX，光照時間為16小時/天的培養條件下誘導生根培養約30天，最終得到紫背天葵再生苗。上述生根培養基是在MS基本培養液中添加蔗糖和瓊脂得到的固體培養基，其中蔗糖的終濃度是30g/L，瓊脂的終濃度是8g/L，培養基的PH=5.9；MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。2)統計觀察實驗重復3次，統計觀察上述步驟4中步驟1)的生根培養情況。培養30天后，統計實驗結果見下表4，從表4可以看出生根培養叢生芽的生根率分別為100%，96%，92%，最高可達到100%，每株植株平均生根5.0根。表5.生根培養的生根率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</table>5、煉苗移栽將上述步驟4中得到的再生苗，進行煉苗，開蓋將其與空氣接觸，26°C下生長5天；然后用流水洗去掉再生苗根系上的培養基，將其移栽到消毒栽培基質(蛭石草炭=11，體積比)中培養，得到紫背天葵再生植株(如圖4所示)，再生植株的成活率可達95%以上。權利要求一種紫背天葵葉片的愈傷組織誘導培養基，是在MS基本培養液中添加如下物質得到的固體培養基2，4-D、6-BA、碳源和凝膠劑；所述愈傷組織誘導培養基中2，4-D的終濃度是1-3mg/L、6-BA終濃度是0.2-1mg/L；所述MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。2.根據權利要求2所述的愈傷組織誘導培養基，其特征在于所述愈傷組織誘導培養基中2，4-D的終濃度是2mg/L，6-BA的終濃度是0.5mg/L。3.根據權利要求1或2所述的愈傷組織誘導培養基，其特征在于所述愈傷組織誘導培養基中凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或Gelrite，優選是瓊脂；所述瓊脂的終濃度是7_9g/L；所述愈傷組織誘導培養基中碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優選為蔗糖；所述蔗糖的終濃度是20-40g/L。4.一種生產紫背天葵再生苗的方法，包括以下步驟1)將紫背天葵葉片置于權利要求1-3中任一所述的愈傷組織誘導培養基上培養，誘導得到愈傷組織；2)將步驟1)得到的愈傷組織在分化培養基上培養，獲得叢生芽；3)將步驟2)中獲得的叢生芽進行誘導生根得到再生苗。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟2)中，所述分化培養基是在MS基本培養液中添加噻苯隆、AgNO3、碳源和凝膠劑得到的固體培養基；其中噻苯隆的終濃度為0.2-0.8mg/L,AgNO3的終濃度為2_6mg/L；所述MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述分化培養基中噻苯隆的終濃度為0.5mg/L，AgNO3的終濃度為4mg/L。7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述分化培養基中，所述凝膠劑是瓊月旨、卡拉膠或Gelrite，優選為瓊脂，所述瓊脂的終濃度為7_9g/L；所述碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優選為蔗糖，所述蔗糖的終濃度為20-40g/L。8.根據權利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述方法在步驟2)和步驟3)之間還包括一叢生芽的伸長培養，所述伸長培養是將步驟2)得到的叢生芽接種到伸長培養基上培養，得到伸長的叢生芽。9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述伸長培養基是在MS基本培養液中添加噻苯隆、AgNO3、碳源和凝膠劑得到的固體培養基；其中噻苯隆的終濃度為0.2mg/L,AgNO3的終濃度為4mg/L；所述碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優選為蔗糖，所述蔗糖的終濃度為20-40g/L；所述凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或Gelrite，優選為瓊脂，所述瓊脂的終濃度為7_9g/L；所述MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。10.根據權利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述誘導生根是在生根培養基中進行的，所述生根培養基是在MS基本培養液中添加碳源和凝膠劑得到的固體培養基；所述碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優選為蔗糖，所述蔗糖的終濃度為20-40g/L；所述凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或Gelrite，優選為瓊脂，所述瓊脂的終濃度為7_9g/L；所述MS基本培養液的溶劑是水、溶質如表1所示。全文摘要本發明公開了一種紫背天葵葉片組織培養的方法及其專用培養基。本發明提供的紫背天葵葉片誘導愈傷組織的培養基是在MS基本培養液中添加如下物質得到的固體培養基2，4-D、6-BA、碳源和凝膠劑；培養基中2，4-D的終濃度是1-3mg/L、6-BA終濃度是0.2-1mg/L。本發明的方法是將紫背天葵葉片置于誘導愈傷組織的培養基上培養得到愈傷組織后，進行分化培養得到叢生芽，叢生芽再誘導生根得到再生苗。本發明建立紫背天葵的經典組培體系，以紫背天葵葉片作為外植體進行繁殖，取材方便，來源充足，可高頻率的誘導出大量的紫背天葵再生植株，產生的植株易于生根，再生植株成活率高，最高可達95％以上。文檔編號A01H4/00GK101836593SQ20101019785公開日2010年9月22日申請日期2010年6月3日優先權日2010年6月3日發明者劉莉莎,溫常龍,王玉玨,程琳,趙永欽,趙立群,郭仰東申請人:中國農業大學