專利名稱：豬源羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家畜飼料的微生物添加劑及其制備方法，特別是涉及一種含有由豬源 羅伊氏乳酸桿菌組成的直接飼喂的活菌凍干制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
人和動物腸道內(nèi)存在著大量的細(xì)菌，約30個屬500多種，共同構(gòu)成了腸道正常菌 群。這些微生物與宿主之間既有正向關(guān)系(偏利共生、相生和互惠現(xiàn)象)，也有負(fù)向關(guān)系(競 爭、偏害現(xiàn)象)，共同維持著微生態(tài)平衡。然而，近年來抗生素作為飼料添加劑的大量使用， 在抑制和殺滅病原菌的同時也抑殺了動物機體內(nèi)正常共生的菌群，破壞了微生態(tài)平衡。相 反，益生菌的作用在于扶植正常微生物菌群，頡頏病原菌，把生態(tài)失衡調(diào)節(jié)為生態(tài)平衡。其 中，乳酸菌作為豬腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群，能夠調(diào)節(jié)腸道內(nèi)正常菌群的共性比例，維持著腸道生態(tài) 系統(tǒng)的平衡。羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)屬于專性異型乳酸發(fā)酵菌，是普遍存 在于人和動物腸道的有益乳酸桿菌，也是乳酸桿菌屬中重要的種群之一。研究表明，羅伊氏 乳酸桿菌腸道能夠調(diào)整腸道菌群平衡，降低機體膽固醇、調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)等。另外，羅伊 氏乳酸桿菌還能夠產(chǎn)生一種獨特的抑菌素(reuterin)，可以有效地抑制大腸埃希氏、鼠傷 寒桿菌、白假絲酵母、黃曲霉菌、空腸彎曲桿菌及芽孢梭菌等多種有害菌，被認(rèn)為是唯一一 種能夠產(chǎn)生廣譜抗菌作用的腸道乳酸菌菌種。美國食品和藥品管理協(xié)會(FDA)于1989年 將羅伊氏乳酸桿菌列為安全的微生物菌種后，該菌得到了廣泛的應(yīng)用。目前國際上報道最 多的一株菌種是瑞典Biogaia AB公司所有的羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri ATCC-55730)，全球消費已超過15億個羅伊氏乳桿菌劑量，且沒有食用不安全的報導(dǎo)。日本 另有報道認(rèn)為，市面上20多種益生菌發(fā)酵乳中，唯有含羅伊氏乳酸桿菌類產(chǎn)品能夠?qū)和?齲齒起到抑制效果，主要是由于該菌能夠抑制變形鏈球(Sti^ptococcus mutan)的生長繁 殖，而Str印tococcusmutan是引起齲齒的主要微生物。我國衛(wèi)生部于2003年批準(zhǔn)羅伊氏 乳酸桿菌(Lactobacillusreuteri)為可用于保健食品的益生菌菌種，目前國內(nèi)關(guān)于羅伊 氏乳酸桿菌的報道主要應(yīng)用在人類酸奶食品中，且報道數(shù)量較少。而作為動物飼用的羅伊 氏乳酸桿菌更是鮮見報道，這主要是由于該菌從分離鑒定到產(chǎn)品制備以至于在動物生產(chǎn)中 的應(yīng)用等過程尚沒有系統(tǒng)的研究，這些因素限制了該菌種在動物生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。因此， 根據(jù)畜牧生產(chǎn)的需要，通過嚴(yán)格的科學(xué)試驗，開發(fā)一種新型、實用的乳酸菌制劑，有著廣闊 的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述領(lǐng)域的不足，提供一種豬源羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑，可以直接 飼喂動物。能夠增加保育豬糞中乳酸菌活菌含量，降低大腸桿菌含量，并具有提高保育豬平 均日增重和免疫力的作用。豬源羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)凍干制劑，其特征在于凍干制劑中保護(hù)劑的組分及各組分的重量百分比為脫脂乳10%、谷氨酸鈉0. 1%、半胱氨酸0.3%、 海藻糖10%、乳糖8%、糊精10%，其余為水。所述豬源羅伊氏乳酸桿菌活菌數(shù)彡109cfu/g。所述豬源羅伊氏乳酸桿菌來源于斷奶仔豬盲腸黏膜。上述豬源羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑的制備方法，其步驟為將豬源羅伊氏乳酸桿 菌進(jìn)行發(fā)酵擴大培養(yǎng)，離心發(fā)酵液后取菌泥，將菌泥加入到所述保護(hù)劑中，混勻、凍干即可。所述發(fā)酵擴大培養(yǎng)中接種量為1%，發(fā)酵溫度為37°C，pH為6. 4 6. 5，發(fā)酵時間 為 24h。所述發(fā)酵擴大培養(yǎng)中采用的培養(yǎng)基的組分及各組分的重量百分比為麥芽糖 2%、酪蛋白胨1. 5%、酵母粉0. 5%、磷酸氫二鉀0. 4%、乙酸鈉0. 7%、硫酸鎂0. 058%、硫酸 錳0. 019%、吐溫0. 1%、牛肉膏1%、檸檬酸氫二銨0.2%。 上述凍干制劑在動物飼料添加劑中的應(yīng)用。所述動物為家畜。所述家畜為豬。本發(fā)明在斷奶仔豬盲腸黏膜分離得到了豬源羅伊氏乳酸桿菌，試驗數(shù)據(jù)表明，將 該豬源羅伊氏乳酸桿菌制成的凍干制劑添加到保育豬飼料中，能夠促進(jìn)保育豬生長，提高 其飼料利用率，降低料肉比見表20 ；能夠增加保育豬腸道中有益菌含量，降低有害菌含量， 從而維持豬腸道微生態(tài)環(huán)境的平衡，見表21 ；在保護(hù)肝臟、增強機體免疫力方面具有積極 的作用，見表22。基于對豬源羅伊氏乳酸桿菌在動物腸道中的益生功能，為了使豬源羅伊氏乳酸桿 菌在動物飼料中得到良好的應(yīng)用并充分發(fā)揮其益生菌的作用，本發(fā)明通過大量的配方篩 選得到一種凍干保護(hù)劑配方10%脫脂乳、0. 谷氨酸鈉、0.3%半胱氨酸、8%乳糖、10% 糊精、10%海藻糖，其余為水。該凍干保護(hù)劑對豬源羅伊氏乳酸桿菌的凍干保護(hù)率達(dá)到 98. 84 %，見表17 ；使其在常溫保存90d后，菌存活率達(dá)到75. 64 %，見表18。本發(fā)明還提供了豬源羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑的制備方法，主要特征在于在增菌 制備豬源羅伊氏乳酸桿菌時采用本發(fā)明優(yōu)化得到的豬源羅伊氏乳酸桿菌優(yōu)化培養(yǎng)基，麥芽 糖2 %、酪蛋白胨1. 5 %、酵母粉0. 5 %、磷酸氫二鉀0.4%、乙酸鈉0. 7 %、硫酸鎂0. 058 %、 硫酸錳0.019%、吐溫0. 1%、牛肉膏1%、檸檬酸氫二銨0.2%。該培養(yǎng)基在MRS培養(yǎng)基基 礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，使其最適于豬源羅伊氏乳酸桿菌，接種到該培養(yǎng)基的豬源羅伊氏乳酸桿菌 的活菌數(shù)是同時接種到MRS培養(yǎng)基上的豬源羅伊氏乳酸桿菌活菌數(shù)的6倍。由于本發(fā)明提供的豬源羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑，主要特點在于凍干制劑配方， 而其中的羅伊氏乳酸桿菌為普通動物腸道常見的益生菌，如豬、雞腸內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)此菌，因 此，該豬源羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑在動物飼料中都可以添加，本發(fā)明將該凍干制劑用于 豬飼料中只是一種優(yōu)選方案而已。綜上所述，本發(fā)明提供的豬源羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑的凍干保護(hù)劑，能為羅伊 氏乳酸桿菌提供良好的凍干保護(hù)，能得到較高的菌存活率與保存穩(wěn)定性，且生產(chǎn)工藝簡單， 成本合理，使本發(fā)明的凍干制劑非常適于應(yīng)用到動物飼料中。具體實施方法實施例1豬源羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑的制備
1. 1豬源乳酸桿菌的分離鑒定將仔豬剖殺，無菌操作刮取盲腸黏膜lg，置于盛有9ml無菌生理鹽水的帶有玻璃 珠的三角瓶中，充分震蕩搖勻，然后吸取1. Oml菌液于盛有9. Oml無菌生理鹽水的試管中， 此稀釋度為10—1，重復(fù)以上過程，依次制成10_2、10_3、10-4、10_5、10_6的菌液。選擇10_4、10_5、 10_6三個稀釋度，吸取0. Iml菌液分別滴于MRS培養(yǎng)基平板上，采用燭缸法37°C培養(yǎng)24 48h，挑取形態(tài)不同的菌落在MRS培養(yǎng)基上劃線接種做純培養(yǎng)，而后置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ缓筇羧〖兣囵B(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢；選取無芽孢革蘭氏陽性桿菌進(jìn)行接觸酶、硝酸 鹽還原、明膠液化等生化實驗，以及糖醇發(fā)酵試驗，結(jié)果與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《乳酸 細(xì)菌分類及實驗方法》對照，確定菌種。然后送至中國工業(yè)微生物菌種保藏中心進(jìn)行鑒定檢 驗。中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心對該乳酸桿菌為羅伊氏乳酸桿菌 (Lactobacillusreuteri)的鑒定結(jié)果如下表1豬源羅伊氏乳酸桿菌生理生化特征試驗報告
生理生化特征氧化酶—接觸酶—硝酸鹽還原—從精氨酸產(chǎn)氨+產(chǎn)酸苦杏彳苷+葡萄糖+松二糖+蔗糖+H拉伯糖+葡萄糖酸鈉+棉籽糖+海藻糖-纖維—糖乳糖+鼠李糖-木糖+七葉靈犮芽糖+核糖—蜜二糖+果糖-甘露醇-水楊苷—、丨乳糖+甘露糖+ W山梨醇—注表中“ + ”表示彡90%菌株陽性，“_”表示彡90%菌株陰性，“ND”表示未測定。1. 2豬源羅伊氏乳酸桿菌生物學(xué)特性1. 2. 1耐酸性能測定將菌種活化2次后，采用5%接種量，分別接入到pH = 1. 5、pH = 2. 0、pH = 3的 溶液中，置于371保溫0.511、1.5、2.511，測定活菌數(shù)，計算存活率。由結(jié)果可知，羅伊氏乳酸 桿菌菌體隨著PH的降低及保溫時間的延長呈下降趨勢。其中，在PH= 1.5保溫2h對菌體 損傷最大，其存活率僅為17. 50%。表2豬源羅伊氏乳酸桿菌耐酸性能測定
權(quán)利要求
豬源羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)凍干制劑，其特征在于凍干制劑中保護(hù)劑的組分及各組分的重量百分比為脫脂乳10％、谷氨酸鈉0.1％、半胱氨酸0.3％、海藻糖10％、乳糖8％、糊精10％，其余為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，所述豬源羅伊氏乳酸桿菌活菌數(shù)>109cfu/g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，所述豬源羅伊氏乳酸桿菌來源于斷奶仔豬盲腸黏膜。
4.權(quán)利要求1 3任一所述豬源羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑的制備方法，其步驟為將 豬源羅伊氏乳酸桿菌進(jìn)行發(fā)酵擴大培養(yǎng)，離心發(fā)酵液后取菌泥，將菌泥加入到所述保護(hù)劑 中，混勻、凍干即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，所述發(fā)酵擴大培養(yǎng)中接種量為1%，發(fā)酵溫度為 37°C，pH為6. 4 6. 5，發(fā)酵時間為24h。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，所述發(fā)酵擴大培養(yǎng)中采用的培養(yǎng)基的組分及各組 分的重量百分比為麥芽糖2%、酪蛋白胨1. 5%、酵母粉0. 5%、磷酸氫二鉀0. 4%、乙酸鈉 0. 7 %、硫酸鎂0. 058 %、硫酸錳0. 019 %、吐溫0. 1 %、牛肉膏1 %、檸檬酸氫二銨0.2%。
7.權(quán)利要求1 3任一所述豬源羅伊氏乳酸桿菌劑凍干制劑在動物飼料添加劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，所述動物為家畜。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述家畜為豬。
全文摘要
本發(fā)明涉及“豬源羅伊氏乳酸桿菌干制劑及其制備方法”，屬于微生物的應(yīng)用領(lǐng)域。豬源羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)凍干制劑，其特征在于凍干制劑中的保護(hù)劑的組分及各組分的重量百分比為脫脂乳10％、谷氨酸鈉0.1％、半胱氨酸0.3％、海藻糖10％、乳糖8％、糊精10％，其余為水。本發(fā)明的豬源羅伊氏乳酸桿菌凍干制劑經(jīng)試驗證明能夠增加保育豬糞中乳酸菌活菌含量，降低大腸桿菌含量，并具有提高保育豬平均日增重和免疫力的作用。本發(fā)明制備的凍干制劑中活菌數(shù)≥109cfu/g，該凍干制劑能夠保證保存90天后活菌存活率在75％以上。本發(fā)明還為羅伊氏乳桿菌提供了優(yōu)化培養(yǎng)基，比常規(guī)培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)上培養(yǎng)的活菌數(shù)要高6倍以上。
文檔編號A23K1/16GK101971920SQ20101029563
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者劉輝, 季海峰, 張董燕, 王四新, 王雅民 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院